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HEK293-Zellen: Ein Eckpfeiler der modernen Zellforschung und Biotechnologie

Die menschliche embryonale Niere 293(HEK293) ist eine menschliche embryonale Nierenzelllinie, die aufgrund ihrer Vielseitigkeit und ihres Nutzens für eine Vielzahl von Forschungsanwendungen in der wissenschaftlichen Gemeinschaft große Popularität erlangt hat. Die Zelllinie wurde in den frühen 1970er Jahren entwickelt und wird seitdem für die Entwicklung von Impfstoffen, die Krebsforschung, die Arzneimittelprüfung und die Signaltransduktion verwendet. Dieser Blog-Beitrag befasst sich mit allen Aspekten der HEK293-Zelllinie, einschließlich ihres Ursprungs, Informationen zur Kultur, Vor- und Nachteilen, Anwendungen und Ressourcen.

HEK293-Zellen: Allgemeine Informationen und Herkunft

Was sind HEK293-Zellen?

HEK293-Zellen sind eine menschliche embryonale Nierenzelllinie, die aus dem Nierengewebe eines elektiv abgetriebenen menschlichen Embryos unbekannter Elternschaft gewonnen wurde. Die Zellen wurden von einem niederländischen Biologen namens Alex Van der Eb in den frühen 1970er Jahren entwickelt. Später wurden sie von dem Forscher Frank Graham durch eine Transformation mit einem verkürzten Adenovirus 5 immortalisiert.

Anfangs schien es schwierig zu sein, die Zellen zu transformieren. Nach vielen kontinuierlichen Versuchen wuchsen die Zellen jedoch aus einem einzigen transformierten Klon [1]. Die Transfektion der Zelle mit dem Adenovirus 5 führte zum Einbau der Gene E1A und E1B in das Genom der Zelle, was den Zelltod verhindert und eine reichliche Proteinproduktion ermöglicht. Vor der Immortalisierung waren die fetalen Nierenzellen nicht ausreichend charakterisiert, so dass ihr genauer Zelltyp unbekannt ist.

Embryonale Nieren setzen sich aus Endothel-, Epithel- und Fibroblastenzellen zusammen, so dass HEK 293-Zellen wahrscheinlich zu diesen Zellen gehören. Die mRNA und die Genprodukte deuten jedoch darauf hin, dass es sich um neuronale Zellen handelt. Es ist möglich, dass die Zugabe von Ad5 den zellulären Phänotyp und die Genexpression verändert hat. Wissenswertes: Die "293" in HEK293 bezieht sich auf das 293. von Graham durchgeführte Experiment.

Wissenswertes: Die "293" in HEK293 bezieht sich auf das 293. Experiment, das von Graham durchgeführt wurde.

Merkmale von HEK293-Zellen

  • Morphologie
  • Größe der Zelle
  • Genom und Ploidie (Chromosomenzahl)

HEK293-Zellen haben eine Form, die Epithelzellen ähnelt. Embryonale Nieren bestehen hauptsächlich aus Fibroblasten, Endothelzellen und Epithelzellen. Daher ähneln 293-Zellen in ihrer Form einem dieser Zelltypen.

HEK293-Zellen in Kultur.

Die Größe von HEK 293-Zellen liegt zwischen 11 und 15 µm, was durch die Kulturbedingungen beeinflusst werden kann. In Kultur können die Zellen abgeflacht erscheinen, wenn sie auf einer Oberfläche wachsen, oder rundlich in Suspension. HEK293-Zellen sind hypotriploid, und etwa 30 % der HEK293-Zellen haben eine modale Ploidie von 64 Chromosomen, aber einige Zellen haben noch mehr Chromosomen. Die Zellen haben außerdem drei Kopien des X-Chromosoms und ein 4-Kilobasenpaar-Fragment des Adenovirus 5, das in Chromosom 19 integriert ist.

Vergleich HEK293 vs. HEK293T-Zelllinie

Von den HEK293-Elternzellen wurden zahlreiche Derivate abgeleitet, wie z. B. die üblichen 293-Zellderivate HEK293T und HEK293F. HEK293T-Zellen sind eines der am weitesten verbreiteten Derivate und wurden durch den Einbau einer temperaturempfindlichen SV40-T-Antigen-Mutante in das ursprüngliche HEK293-Zellgenom geschaffen. Die Expression des T-Antigens ermöglicht die Replikation von Plasmiden mit einem SV40-Replikationsursprung, wenn sie in 293-T-Zellen transfiziert werden, was zu einer erhöhten Produktion rekombinanter Proteine führt [2]. Weitere Informationen über HEK-Zelllinienderivate, einschließlich ihrer Entwicklung und Eigenschaften, finden Sie in diesem Übersichtsartikel.

Grundlagen der HEK293-Zellkultivierung: Eine Schritt-für-Schritt-Anleitung

Bedingungen

Informationen

Verdopplungszeit der Population

Die Verdopplungszeit der HEK293-Zelllinie liegt zwischen 24 und 45 Stunden, mit einem Durchschnitt von 30 Stunden.

Adhärente oder Suspensionskulturen

HEK293-Zellen können sowohl in adhärenter als auch in Suspensionsform gezüchtet werden. Adhärente Zellen wachsen in Monolayern, während Suspensionskulturen als Sphäroide wachsen.

Aussaat-Dichte

Teilen Sie die Zellen während der Wachstumsphase bei 80-90 % Konfluenz. Die Zellen mit Accutase ablösen und in einer Dichte von 1 bis 4 x 104 Zellen/cm2 aussäen. Bei einer Aussaatdichte von 1 x 104 Zellen/cm2 bildet sich innerhalb von 4 Tagen eine konfluente Schicht.

Wachstumsmedium

Wachsen Sie in Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) mit 2 mM L-Glutamin und 10 % fötalem Rinderserum (FBS). Wechseln Sie das Medium zweimal pro Woche.

Wachstumsbedingungen (Temperatur, CO2)

Für ein optimales Wachstum in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und einer CO2-Zufuhr von 5 % aufbewahren.

Lagerung

Zur langfristigen Aufbewahrung in der Dampf- oder Flüssigphase von Flüssigstickstoff lagern. Eine Lagerung bei -80 °C im Gefrierschrank ist zu vermeiden, da dies die Lebensfähigkeit der Zellen beeinträchtigen kann.

Einfrierverfahren und Medium

Verwenden Sie ein langsames Einfrierverfahren für eine optimale Konservierung. Einfrieren in CM-1 oder CM-ACF Gefriermedium, erhältlich bei CLS.

Auftauprozess

Tauen Sie die gefrorenen Zellen in einem 37 °C warmen Wasserbad für 1-2 Minuten auf, bis ein kleiner Eisklumpen zurückbleibt. Überführen Sie die Zellsuspension in ein Zentrifugenröhrchen, fügen Sie vorgewärmtes Wachstumsmedium hinzu und zentrifugieren Sie, um die Bestandteile des Gefriermediums zu entfernen. Das Zellpellet in frischem Medium resuspendieren und unter optimalen Bedingungen kultivieren.

Biosicherheitsstufe

HEK293-Zellen erfordern eine Handhabung der Biosicherheitsstufe 1.

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Die HEK293-Zelllinie in Forschung und Industrie

Die Anwendungen von HEK293-Zellen sind vielfältig und bedeutend. Sie werden häufig als System für die Expression und Produktion von rekombinanten Proteinen verwendet. Da sie menschlichen Ursprungs sind, ist es wahrscheinlicher, dass die in diesen Zellen hergestellten Proteine ihren natürlichen menschlichen Gegenstücken in Struktur und Funktion ähneln, was für therapeutische Anwendungen entscheidend ist.

Darüber hinaus werden HEK293-Zellen häufig zur Untersuchung von Genfunktionen und -regulierung eingesetzt, da sie leicht fremde DNA aufnehmen, was sie zu einem hervorragenden Modell für genetische Manipulationen macht. Diese Zellen spielen auch eine entscheidende Rolle bei der Herstellung von adenoviralen Vektoren, die in der Gentherapie und der Entwicklung von Impfstoffen eingesetzt werden, einschließlich der schnellen Herstellung von Impfstoffen für COVID-19.

Impfstoff- und Proteinproduktion: HEK 293-Zellen eignen sich für die groß angelegte Herstellung von Proteinen und therapeutischen Impfstoffen. Die Zelllinie wird außerdem zur Herstellung viraler Vektoren wie adenoassoziierter und adenoviraler Vektoren verwendet. Kürzlich wurden HEK293-Zellen für die Herstellung eines wichtigen rekombinanten Proteins, Erythropoietin (EPO), verwendet.

Drogentests: HEK293-Zellen werden häufig für die Prüfung der Toxizität von Arzneimitteln und Naturprodukten verwendet.

Krebsforschung: 293-Zellen sind tumorerzeugend, und entscheidende Veränderungen der Genexpression können die Tumorentstehung in dieser Zelllinie verschlimmern. Daher wird die 293-Zelllinie häufig in der Krebsforschung eingesetzt, um die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen zu verstehen und Medikamente zu entwickeln.

Transfektionsstudien: Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen, und HEK293-Zellen eignen sich besonders gut für diesen Prozess. Mehr zu diesem Thema erfahren Sie weiter unten.

Die Rolle von HEK293 in der Impfstoff- und Proteinproduktion

Bei der Herstellung von Impfstoffen haben HEK293-Zellen eine wichtige Rolle bei der Entwicklung von Impfstoffen auf Adenovirus-Basis gespielt. Ihre Fähigkeit, in Suspensionskulturen zu wachsen, ermöglicht skalierbare Prozesse, die für die Deckung des weltweiten Impfstoffbedarfs entscheidend sind. Darüber hinaus bietet ihr menschlicher Ursprung einen Vorteil gegenüber anderen Zelllinien, da sie menschenähnliche posttranslationale Modifikationen durchführen können, wodurch die biologische Wirksamkeit der hergestellten Impfstoffe gewährleistet wird.

Die Vielseitigkeit von HEK293-Zellen erstreckt sich auch auf die Produktion komplexer Proteine, einschließlich monoklonaler Antikörper und Biosimilars, die bei der Behandlung von Krebs, Autoimmunkrankheiten und anderen Erkrankungen eingesetzt werden. Ihre Fähigkeit, Proteine genau zu falten und zu modifizieren, macht sie zu einer bevorzugten Wahl in der rekombinanten Proteinproduktion.

Warum werden HEK293-Zellen für die Transfektion verwendet?

Unter Transfektion versteht man das Einbringen von Nukleinsäuren in Zellen, und HEK293-Zellen eignen sich besonders gut für diesen Prozess. Es gibt mehrere Gründe, warum HEK293-Zellen für die Transfektion bevorzugt werden:

  1. Hohe Transfektionseffizienz: HEK293-Zellen haben eine hohe Aufnahmerate für fremde DNA, was auf ihre Fähigkeit zurückzuführen ist, bestimmte virale Gene zu exprimieren, die den Eintritt der DNA in die Zelle erleichtern.
  2. Robustes Wachstum: Diese Zellen wachsen schnell und sind relativ einfach zu pflegen, was für Experimente, die schnelle und zuverlässige Ergebnisse erfordern, von Vorteil ist.
  3. Anpassungsfähigkeit: HEK293-Zellen können unter verschiedenen Bedingungen gezüchtet werden, z. B. in adhärenten oder Suspensionskulturen, was sie für die Proteinproduktion in großem Maßstab geeignet macht.
  4. Menschliche Zelllinie: Als menschliche Zelllinie bieten sie einen relevanteren biologischen Kontext für die menschliche Biologie, was besonders in der therapeutischen Forschung wichtig ist, wo die Reaktion in menschlichen Zellen Vorhersagen über In-vivo-Ergebnisse ermöglicht.
  5. Vielseitigkeit: Sie sind in der Lage, Proteine mit komplexen posttranslationalen Modifikationen zu produzieren, eine Eigenschaft, die für die Funktionalität vieler Proteine, insbesondere therapeutischer Antikörper, wesentlich ist.

HEK293 Subkultur-Protokoll

Erforderliche Reagenzien

  1. 1X Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS)
  2. 10% Trypsin-PBS
  3. Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM)
Verfahren

Vorbereitung der Zellen

  1. Überprüfen Sie die HEK-Zellen unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass sie zu etwa 90 % konfluent sind.
  2. Reinigen Sie den Arbeitsplatz mit aseptischen Techniken und sterilisieren Sie den Abzug mit UV-Licht.
  3. Wischen Sie den Arbeitsbereich mit 70%igem Ethanol ab.
  4. Wärmen Sie alle Reagenzien in einem 37°C warmen Wasserbad vor.

Berechnung von Splitfraktion und Saatgutmenge

  1. Bestimmen Sie die Splitfraktion, normalerweise zwischen 1:5 und 1:20.
  2. Berechnen Sie das Volumen für die Pipettierung nach folgender Formel: Vp = (S)(Vd).

Medienvolumina und Aufteilungsprotokolle

Für die Zellkultur benötigen verschiedene Gefäße spezifische Medienvolumina und haben einzigartige Wachstumsbereiche. Eine 6-Well-Platte hat beispielsweise eine Wachstumsfläche von 4,67 cm^2 pro Vertiefung und benötigt etwa 2,5 mL Medien, während eine 100-mm-Platte eine Wachstumsfläche von 55 cm^2 hat und 10 mL Medien benötigt. Der Prozess der Zellteilung umfasst das Entfernen des alten Mediums, das Waschen mit PBS, die Inkubation mit Accutase, die Neutralisierung mit DMEM, das Zentrifugieren, das Resuspendieren in neuem Medium und die anschließende Aussaat auf eine neue Platte. Detaillierte Schritte und Verhältnisse für andere Gefäße wie 100 cm^2-Kolben und 150-mm-Platten finden Sie in der Originalquelle.

Konfluente HEK293-Zellen, die bei CLS kultiviert wurden.

Vorteile und Beschränkungen der HEK293-Zelllinie

HEK293-Zellen haben besondere Eigenschaften, die sie für die Forschung und die Proteinproduktion attraktiv machen.

Vorteile

  • Hohe rekombinante Proteinproduktion: HEK293-Zellen können große Mengen an rekombinanten Proteinen mit komplexen posttranslationalen Modifikationen produzieren.
  • Flexible Transfektion: Diese Zellen sind sehr effizient für Transfektionsstudien und können mit verschiedenen physikalischen und chemischen Methoden effizient transfiziert werden.
  • Genexpressionsanalyse: Aufgrund ihrer Fähigkeit, effizient transfiziert zu werden, können HEK293-Zellen sowohl für transiente als auch für stabile Genexpressionsanalysen verwendet werden.
  • Reproduzierbarkeit der Ergebnisse: HEK293-Zellen bieten konsistente, zuverlässige und reproduzierbare Ergebnisse, was sie zu einer beliebten Wahl für Forschungslabors macht.

Nachteile der HEK293-Zelllinie

  • Bakterielle Kontamination: Das Risiko einer bakteriellen Kontamination ist eine häufige Herausforderung bei der Kultivierung von Zelllinien, einschließlich HEK293-Zellen. Bakterieninfektionen können den pH-Wert des Kulturmediums verändern, Trübungen verursachen und die Zellform, die Kulturdauer und die Genexpression beeinträchtigen. Um eine Kontamination zu verhindern, müssen die aseptischen Bedingungen für die Zellkultur streng eingehalten werden.
  • Virale Infektion: HEK293-Zellen sind, wie andere menschliche Zelllinien auch, anfällig für Viruserkrankungen des Menschen. Diese Infektionen können nur durch PCR-Tests nachgewiesen werden und sind nicht leicht zu erkennen.
  • Kulturdauer: Obwohl die HEK293-Zelllinie immortalisiert ist, kann eine längere Kulturdauer die Gesundheit der Zellen allmählich beeinträchtigen und die Genexpression, die Reproduzierbarkeit und das Zellwachstum beeinträchtigen. Um eine gesunde Kultur zu erhalten, wird empfohlen, die Anzahl der Passagen unter 20 zu halten.

HEK293 Ressourcen-Übersicht: Protokolle, Videos und mehr

HEK293-Zellen sind eine weit verbreitete und gut untersuchte Zelllinie, für deren Pflege und Kultivierung verschiedene Ressourcen zur Verfügung stehen. Hier stellen wir einige Ressourcen vor, um mehr über HEK293-Zellkulturprotokolle zu erfahren:

Videos über die HEK293-Zelllinie

Zahlreiche Lehrvideos über die Subkultivierung, Zellplattierung und Transfektionsprotokolle von HEK293-Zellen sind leicht verfügbar.

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Häufig gestellte Fragen zu HEK293-Zellen

HEK293-Zellen werden in der wissenschaftlichen Forschung häufig verwendet, was natürlich zahlreiche Fragen zu ihrer Natur, ihrem Ursprung und ihren Eigenschaften aufwirft. Im Folgenden gehen wir auf einige dieser häufig gestellten Fragen ein.

HEK293-Zellen sind eine Linie menschlicher embryonaler Nierenzellen, die unter Laborbedingungen gezüchtet wurden. Aufgrund ihrer hohen Transfektiosität, d. h. ihrer Fähigkeit, fremde DNA aufzunehmen, werden sie häufig in der wissenschaftlichen Forschung verwendet.
HEK293-Zellen gelten aufgrund ihres zuverlässigen Wachstums und ihrer stabilen Transfektionseigenschaften als wichtige Zelllinie für verschiedene Anwendungen wie die Gentherapie, die Herstellung von Biotherapeutika und Studien zur Genomvariation und Genfunktion.
Der Begriff "Zellliniengenom" bezieht sich auf die spezifische genetische Beschaffenheit von HEK293-Zellen, die sich aus den ursprünglichen embryonalen 293-Nierenzellen entwickelt hat, einschließlich aller genomischen Variationen und Veränderungen, die während der Zelllinie aufgetreten sind.
Ja, HEK293-Zellen können aufgrund ihres gut charakterisierten Genoms in der Forschung zum Nachweis von Kopienzahlveränderungen, d. h. von Veränderungen in der Anzahl der Kopien eines bestimmten Gens, verwendet werden.
HEK293-Zellen werden häufig zur Herstellung viraler Vektoren für die Gentherapie verwendet, da sie schnell und in hoher Dichte wachsen können, was für die Herstellung und Ernte von Vektoren unerlässlich ist.
native Proteine" beziehen sich auf die Proteine, die auf natürliche Weise von den HEK293-Zellen exprimiert werden, während sich "andere Proteine" auf die Proteine beziehen könnten, die durch genetische Manipulation oder Transfektion in den Zellen zu Forschungszwecken exprimiert werden.
hohe Transfektiosität" bezieht sich auf die Leichtigkeit, mit der HEK293-Zellen genetisch so verändert werden können, dass sie spezifische Gene exprimieren, was sie ideal für Experimente zur Proteinexpression und Rezeptorplastizität macht.
HEK293-Zellen werden für die Herstellung von Biotherapeutika verwendet, da sie eine Vielzahl von rekombinanten Proteinen mit den richtigen posttranslationalen Modifikationen exprimieren können, die für die therapeutische Wirksamkeit wichtig sind.
Bei der Genom-Resequenzierung wird bereits sequenzierte DNA sequenziert, um etwaige genomische Veränderungen zu ermitteln. HEK293-Zellen bieten einen stabilen genomischen Hintergrund für diese Analysen.
Die Karyotyp- und Transkriptomanalysen von HEK293-Zellen geben Einblicke in ihre chromosomalen Eigenschaften und Genexpressionsprofile, die für das Verständnis der Zellbiologie und für verschiedene Forschungsanwendungen von entscheidender Bedeutung sind.

Referenzliste

  1. Lin, Y.-C., et al., Genome dynamics of the human embryonic kidney 293 lineage in response to cell biology manipulations. Nature Communications, 2014. 5(1): p. 4767.
  2. Tan, E., et al., HEK293 cell line as a platform to produce recombinant proteins and viral vectors. Frontiers in bioengineering and biotechnology, 2021: S. 1288.
  3. Pulix, M., et al., Molecular characterization of HEK293 cells as emerging versatile cell factories. Aktuelle Meinung in Biotechnologie, 2021. 71: p. 18-24.
  4. Alvim, R.G., I. Itabaiana Jr, und L.R. Castilho, Zika virus-like particles (VLPs): Stabile Zelllinien und kontinuierliche Perfusionsprozesse als neue potenzielle Plattform für die Impfstoffherstellung. Vaccine, 2019. 37(47): p. 6970-6977.
  5. Schwarz, H., et al., Small-scale bioreactor supports high density HEK293 cell perfusion culture for the production of recombinant Erythropoietin. Zeitschrift für Biotechnologie, 2020. 309: p. 44-52.
  6. Liu, X., et al., Nanotoxische Effekte von Silber-Nanopartikeln auf normale HEK-293-Zellen im Vergleich zur krebsartigen HeLa-Zelllinie. Internationale Zeitschrift für Nanomedizin, 2021. 16: p. 753.
  7. Patra, B., et al., Piper betle: augmented synthesis of gold nanoparticles and its in-vitro cytotoxicity assessment on HeLa and HEK293 cells. Journal of Cluster Science, 2020. 31: p. 133-145.
  8. Stepanenko, A. und V. Dmitrenko, HEK293 in der Zellbiologie und Krebsforschung: Phänotyp, Karyotyp, Tumorigenität und Stress-induzierte Genom-Phänotyp-Evolution. Gene, 2015. 569(2): p. 182-190.

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