Veröffentlicht: 2023 | Zuletzt überprüft: Mai 2026

Umfassender Leitfaden zum Einfrieren von Zellen: Gewährleistung von Lebensfähigkeit und Sterilität

Das Einfrieren von Zellen ist ein entscheidender Prozess im Zellkulturmanagement, der die langfristige Lagerung und Erhaltung wertvoller Zelllinien gewährleistet. Unabhängig davon, ob mit menschlichen oder tierischen Zellen gearbeitet wird, sind die Einhaltung präziser Protokolle und die Anwendung strenger aseptischer Techniken von entscheidender Bedeutung für eine erfolgreiche Kryokonservierung.

Dieser Leitfaden enthält detaillierte Anweisungen zu den erforderlichen Materialien, Reagenzien und Schritt-für-Schritt-Verfahren, um Zellen effektiv einzufrieren und dabei ihre Lebensfähigkeit und Sterilität zu bewahren. Durch die Einhaltung dieser Richtlinien können Forscher Zellkulturen sicher lagern und später mit minimalem Verlust an Zelllebensfähigkeit wiederbeleben, wodurch die Integrität und Zuverlässigkeit ihrer Versuchsergebnisse gewahrt bleibt.

Zu Beginn ist es unerlässlich, eine sterile Arbeitsumgebung zu schaffen. Die richtigen aseptischen Techniken spielen eine entscheidende Rolle bei der Verhinderung von Kontaminationen und der Gewährleistung der Sterilität der Kulturen.

Aseptische Technik

Befolgen Sie während des gesamten Prozesses aseptische Techniken, um die Sterilität der Kulturen zu gewährleisten.

Umfassender Prozess zum Einfrieren von Zellen

Dieses Flussdiagramm bietet eine detaillierte visuelle Anleitung zu den wesentlichen Schritten für das ordnungsgemäße Einfrieren von Zellen. Befolgen Sie diese Verfahren, um eine hohe Zellviabilität und -integrität während des Kryokonservierungsprozesses sicherzustellen.

Vorbereitung des Einfriermediums

Bereiten Sie das kryoprotektive Einfriermedium entsprechend dem Zelltyp vor:

FBS-haltige Kulturmedien: 90 % FBS + 10 % DMSO oder 70 % Wachstumsmedium, 20 % FBS und 10 % DMSO
Zellen, die Glycerin benötigen: 90 % FBS + 10 % Glycerin

Erwägen Sie den Kauf unseres vorformulierten Gefriermediums:

Gefriermedium CM-1: Für Protokolle, die ein Medium mit fötalem Rinderserum (FBS) erfordern
Gefriermedium CM-ACF – serumfrei: Als FBS-freie Alternative

Kennzeichnung und Dokumentation

Beschriften Sie Kryoröhrchen mit den folgenden Angaben:

Datum
Name des Forschers
Zellnummer
Passagenummer
Zelltyp
Sonstige Angaben (z. B. genetische Modifikationen)

Zellpräparation

Für adhärente Zellen:

Beobachten Sie die Zellen, bis sie eine Konfluenz von 85–95 % erreichen
Das alte Kulturmedium absaugen
Spülen Sie die Zellmonoschicht mit kalzium- und magnesiumfreiem PBS
Lösen Sie die Zellen mit Accutase, Trypsin oder Trypsin-EDTA ab und neutralisieren Sie sie bei Bedarf mit Kulturmedium
Die Zellsuspension in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen überführen

Für Suspensionszellen:

Überprüfen Sie die Zelldichte und den Zustand der Zellen unter dem Mikroskop
Übertragen Sie die Zellsuspension direkt in ein 50-ml-Falcon-Röhrchen

Zellzählung und Zentrifugation

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler
Zentrifugieren Sie bei 300 g für 3–5 Minuten bei Raumtemperatur, um die Zellen zu pelletieren
Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne das Zellpellet zu stören
Erwärmen Sie das vorbereitete Gefriermedium vor der Verwendung auf 37 °C

Kryokonservierung

Resuspendieren Sie das Zellpellet im Gefriermedium auf eine Dichte von 2,0 Millionen Zellen/ml für adhärente Zellen und 5 Millionen Zellen/ml für Suspensionszellen oder auf die von Ihnen gewünschte Konzentration
1,0 ml (oder mehr, je nach Bedarf) der Zellsuspension in beschriftete Kryoröhrchen aliquotieren
Verwenden Sie eine Langsamgefriermethode, bevor Sie die Zellen zur Langzeitlagerung überführen

? Methode: ? Schritte
❄️ Manuelles Einfrieren: 1️⃣ Legen Sie die Zellen im Gefriermedium für 40 Minuten in einen Gefrierschrank bei 4 °C.
2️⃣ Übertragen Sie sie für 24 Stunden in einen Gefrierschrank bei -80 °C.
3️⃣ Lagern Sie die Zellen zur Langzeitkonservierung in flüssigem Stickstoff.
? Verwendung von Mr. Frosty: 1️⃣ Bereite die Zellen in Kryoröhrchen mit Gefriermedium vor.
2️⃣ Stelle die Kryoröhrchen in den Mr. Frosty-Behälter.
3️⃣ Lagere sie 24 Stunden lang bei -80 °C, bevor du sie in flüssigen Stickstoff überführst.
? Gefrierschrank mit kontrollierter Abkühlgeschwindigkeit: 1️⃣ Programmieren Sie das Gerät so, dass die Temperatur allmählich sinkt.
2️⃣ Legen Sie die vorbereiteten Zellen in den Gefrierschrank.
3️⃣ Übertragen Sie die Zellen nach dem Gefrierzyklus in flüssigen Stickstoff.

Lagern Sie die Kryoröhrchen bei Temperaturen unter -130 °C oder in flüssigem Stickstoff zur Langzeitkonservierung.

Materialien und Reagenzien

1–2-ml-Kryoröhrchen
CoolCell®-Gefriergerät oder Gefrierschrank mit kontrollierter Abkühlgeschwindigkeit
Kryoprotektives Gefriermedium (z. B. selbst hergestellte Kryoprotektivmedien, CM-1, CM-ACF oder Spezialmedien)
Fötales Rinderserum (FBS) oder konditionierte Medien
DMSO oder Glycerin
Calcium- und magnesiumfreies PBS
Accutase, Trypsin oder Trypsin-EDTA (für adhärente Zellen)
15-ml- oder 50-ml-Falcon-Röhrchen
Hämocytometer oder automatischer Zellzähler
Zentrifuge