Umfassender Leitfaden zum Einfrieren von Zellen: Sicherstellung von Lebensfähigkeit und Sterilität
Das Einfrieren von Zellen ist ein wichtiger Prozess im Zellkulturmanagement, der die langfristige Lagerung und Konservierung wertvoller Zelllinien gewährleistet. Unabhängig davon, ob Sie mit menschlichen oder tierischen Zellen arbeiten, sind die Befolgung präziser Protokolle und die Einhaltung strenger aseptischer Techniken für eine erfolgreiche Kryokonservierung von größter Bedeutung.
Dieser Leitfaden enthält detaillierte Anweisungen zu den erforderlichen Materialien, Reagenzien und schrittweisen Verfahren, um Zellen effektiv einzufrieren und dabei ihre Lebensfähigkeit und Sterilität zu bewahren. Durch die Einhaltung dieser Richtlinien können Forscher Zellkulturen sicher lagern und später mit minimalem Verlust an Lebensfähigkeit wiederbeleben und so die Integrität und Zuverlässigkeit ihrer experimentellen Ergebnisse erhalten.
Zu Beginn ist es wichtig, eine sterile Arbeitsumgebung zu schaffen. Korrekte aseptische Techniken spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermeidung von Kontaminationen und der Gewährleistung der Sterilität der Kulturen.
Aseptische Technik
Befolgen Sie während des gesamten Prozesses aseptische Techniken, um die Sterilität der Kulturen zu gewährleisten.
Umfassender Prozess des Einfrierens von Zellen
Dieses Flussdiagramm bietet einen detaillierten visuellen Leitfaden für die wesentlichen Schritte, die für das richtige Einfrieren von Zellen erforderlich sind. Befolgen Sie diese Verfahren, um eine hohe Lebensfähigkeit und Integrität der Zellen während des Kryokonservierungsprozesses zu gewährleisten.
Vorbereitung des Einfriermediums
Bereiten Sie das kryoprotektive Einfriermedium je nach Zelltyp vor:
- FBS-haltige Medienkulturen: 90% FBS + 10% DMSO oder 70% Wachstumsmedium, 20% FBS und 10% DMSO
- Zellen, die Glycerin benötigen: 90 % FBS + 10 % Glycerin
Erwägen Sie den Erwerb unseres vorformulierten Gefriermediums:
- Gefriermedium CM-1: Für Protokolle, die ein Medium mit fötalem Rinderserum (FBS) erfordern
- Gefriermedium CM-ACF - serumfrei: Für eine FBS-freie Alternative
Beschriftung und Dokumentation
Beschriften Sie die Kryovials mit den folgenden Angaben:
- Datum
- Name des Forschers
- Nummer der Zelle
- Nummer der Passage
- Zelltyp
- Zusätzliche Informationen (z. B. genetische Veränderungen)
Vorbereitung der Zellen
Für adhärente Zellen:
- Beobachten Sie die Zellen, bis sie 85-95 % Konfluenz erreichen
- Absaugen des alten Kulturmediums
- Spülen Sie die Zell-Monolayer mit kalzium- und magnesiumfreier PBS
- Zellen mit Accutase, Trypsin oder Trypsin-EDTA ablösen und bei Bedarf mit Kulturmedium neutralisieren
- Die Zellsuspension in ein 50-mL-Falcon-Röhrchen überführen
Für Suspensionszellen:
- Zelldichte und -gesundheit unter dem Mikroskop prüfen
- Übertragen Sie die Zellsuspension direkt in ein 50-mL-Falcon-Röhrchen
Zellzählung und Zentrifugation
- Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler
- Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300 g für 3-5 Minuten bei Raumtemperatur, um sie zu pelletieren
- Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne das Zellpellet zu stören
- Erwärmen Sie das vorbereitete Gefriermedium vor der Verwendung auf 37°C
Kryokonservierung
- Resuspendieren Sie das Zellpellet in Gefriermedium bis zu einer Dichte von 2,0 Mio. Zellen/ml für adhärente Zellen und 5 Mio. Zellen/ml für Suspensionszellen bzw. der gewünschten Konzentration
- Aliquotieren Sie 1,0 mL (oder mehr, je nach Bedarf) der Zellsuspension in beschriftete Kryovials
- Verwenden Sie eine Methode zum langsamen Einfrieren, bevor Sie die Zellen in die Langzeitlagerung überführen
| 🥶 Methode | 💡 Schritte |
|---|---|
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❄️ Manuelles Einfrieren |
1️⃣ Zellen in Gefriermedium für 40 Minuten bei 4°C einfrieren. 2️⃣ Für 24 Stunden in einen Gefrierschrank mit -80 °C überführen. 3️⃣ Zellen zur Langzeitkonservierung in flüssigem Stickstoff lagern |
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🧊 Verwendung von Mr. Frosty |
1️⃣ Zellen in Kryoflaschen mit Gefriermedium vorbereiten. 2️⃣ Kryoflaschen in den Mr. Frosty-Behälter stellen. 3️⃣ 24 Stunden bei -80°C lagern, bevor sie in flüssigen Stickstoff überführt werden |
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🧬 Gefriergerät mit kontrollierter Geschwindigkeit |
1️⃣ Programmieren Sie das Gerät so, dass die Temperatur schrittweise gesenkt wird. 2️⃣ Vorbereitete Zellen in den Gefrierschrank legen. 3️⃣ Nach dem Einfrierzyklus die Zellen in flüssigen Stickstoff überführen |
- Lagern Sie die Kryoflaschen bei Temperaturen unter -130 °C oder in flüssigem Stickstoff für eine langfristige Aufbewahrung.
Materialien und Reagenzien
- 1-2 mL Kryo-Gefäße
- CoolCell®-Einfriergerät oder Gefrierschrank mit kontrollierter Geschwindigkeit
- Kryoprotektives Gefriermedium (z. B. DIY-Kryoprotektionsmedium, CM-1, CM-ACF oder spezielle Medien)
- Fötales Rinderserum (FBS) oder konditionierte Medien
- DMSO oder Glycerin
- Kalzium- und magnesiumfreies PBS
- Accutase, Trypsin oder Trypsin-EDTA (für adhärente Zellen)
- 15 mL oder 50 mL Falcon-Röhrchen
- Hämozytometer oder automatischer Zellzähler
- Zentrifuge