Protokoll zur Kryokonservierung

Materialien und Reagenzien

• 1-2 mL Kryovials
• CoolCell® Gefriergerät oder programmierbarer Kühler
• Kryoprotektives Einfriermedium (z. B. DIY-Kryoprotektionsmedien, CM-1, CM-ACF oder spezielle Medien)
• Fötales Rinderserum (FBS) oder konditionierte Medien
• DMSO oder Glycerin
• Calcium- und magnesiumfreies PBS
• Accutase, Trypsin oder Trypsin-EDTA (für adhärente Zellen)
• 15 ml oder 50 mL Falcon-Röhrchen
• Hämozytometer oder automatischer Zellzähler
• Zentrifuge

Beschriftung und Dokumentation

• Beschriften Sie die Kryovials mit dem Datum, dem Namen des Forschers, der Zellnummer, der Passagezahl, dem Zelltyp und zusätzlichen Informationen wie genetischen Veränderungen.

Vorbereitung des Einfriermediums

• Bereiten Sie das Einfriermedium je nach Zelltyp vor:
• Für FBS-haltige Medienkulturen: 90% FBS + 10% DMSO.
• Für serumfreie Medienkulturen: 90 % konditionierte Medien + 10 % DMSO.
• Für Zellen, die Glycerin benötigen: 90 % FBS + 10 % Glycerin.
• Wenn Sie eine bequeme und maßgeschneiderte Einfrierlösung wünschen, sollten Sie unser vorformuliertes Einfriermedium CM-1 oder CM-ACF erwerben. Entscheiden Sie sich für unser CM-1 Einfriermedium, wenn Ihr Protokoll ein Medium mit fötalem Rinderserum (FBS) erfordert, oder wählen Sie unser CM-ACF Medium für eine FBS-freie Alternative.

Zellvorbereitung

Für adhärente Zellen

• Beobachten Sie die Zellen, bis sie eine Konfluenz von 85-95 % erreicht haben.
• Saugen Sie das alte Kulturmedium ab.
• Spülen Sie den Monolayer mit calcium- und magnesiumfreiem PBS ab.
• Zellen mit Accutase, Trypsin oder Trypsin-EDTA ablösen und ggf. mit Kulturmedium neutralisieren.
• Die Zellsuspension in ein 50-mL-Falcon-Röhrchen überführen.

Für Suspensionszellen

• Die Zelldichte und den Gesundheitszustand unter dem Mikroskop überprüfen.
• Übertragen Sie die Zellsuspension direkt in ein 50-mL-Falcon-Röhrchen.

Zellzählung und Zentrifugation

• Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer oder einem automatischen Zellzähler.
• Zentrifugieren Sie die Zellen bei 300g rpm für 3 - 5 Minuten bei Raumtemperatur, um sie zu pelletieren.
• Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne das Zellpellet zu stören.
• Erwärmen Sie das vorbereitete Einfriermedium vor der Verwendung auf 37°C.

Kryokonservierung

• Resuspendieren Sie das Zellpellet in Einfriermedium bis zu einer Dichte von 2,0 Millionen Zellen/ml für adhärente und 5 Millionen Zellen/ml für Suspensionszellen.
• Aliquotieren Sie 1,0 mL (oder mehr nach Bedarf) der Zellsuspension in beschriftete Kryovials.
• Stellen Sie die Fläschchen für 20 Minuten in einen 4°C-Kühlschrank.
• Überführen Sie die Fläschchen in einen programmierbaren Kühler oder eine isolierte Box in einem -70°C bis -90°C Gefrierschrank, um die Zellen mit einer kontrollierten Rate von 1°C pro Minute einzufrieren.
• Nach dem ersten Einfrieren die Fläschchen in flüssigen Stickstoff oder in ein elektrisches Gefrierfach mit einer Temperatur von unter -150°C zur langfristigen Aufbewahrung umlagern.

Aseptische Technik

• Befolgen Sie während des gesamten Prozesses aseptische Techniken, um die Sterilität der Kulturen zu gewährleisten.