Dissoziationstechniken für Zellkulturen

Die Dissoziation von Zellkulturen ist ein wichtiger Schritt bei der Pflege von Zellkulturen. Dabei werden die Zellen von ihrer Wachstumsoberfläche abgelöst, um eine Subkultur oder Ernte zu ermöglichen. In diesem Abschnitt werden zwei Hauptmethoden beschrieben: die Verwendung von enzymfreien Dissoziationspuffern und die Verwendung von enzymatischen Reagenzien.

1.verwendung von enzymfreien Zelldissoziationspuffern

Diese Methode ist schonend und erhält die zelluläre Integrität ohne den Einsatz von Enzymen:

1. Vorbereitung
   • Stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien vor der Verwendung auf 37°C erwärmt werden, um einen Schock für die Zellen zu vermeiden.
2. Entfernung des Wachstumsmediums
   • Verwerfen Sie das alte Wachstumsmedium aus dem Kulturgefäß.
3. Spülung
   • Zellmonolayer mit 5 ml kalzium- und magnesiumfreier PBS pro T75-Kolben oder 100-mm-Schale spülen.
   • Schütteln Sie das Gefäß 30 bis 60 Sekunden lang vorsichtig bei Raumtemperatur.
   • Saugen Sie die Spüllösung ab und verwerfen Sie sie.
   • Wiederholen Sie diesen Spülschritt ein weiteres Mal.
4. Dissoziation
   • Geben Sie etwa 5 ml enzymfreien Zelldissoziationspuffer in das Gefäß.
   • Schütteln Sie das Gefäß bei Raumtemperatur 1 bis 2 Minuten lang und überprüfen Sie die Dissoziation unter dem Mikroskop.
   • Klopfen Sie den Kolben oder die Schale gegebenenfalls gegen die Hand, um die Zellen zu lösen.
   • Wenn die Zellen anhaften, lassen Sie sie weitere 2 bis 5 Minuten bei Raumtemperatur stehen und klopfen Sie bei Bedarf erneut, wobei Sie mehr Dissoziationspuffer verwenden.
   • Sobald sich die Zellen abgelöst haben, fügen Sie mindestens 5 ml vollständiges Wachstumsmedium hinzu, um den Dissoziationspuffer zu neutralisieren und die Zellen zu resuspendieren.
5. Überprüfung der Lebensfähigkeit
   • Überwachen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen während der Subkultivierung und stellen Sie sicher, dass sie über 90 % bleibt.

2.verwendung anderer Reagenzien zur Dissoziation

Bei dieser Methode können verschiedene Dissoziationsreagenzien verwendet werden:

1. Beseitigung des gebrauchten Mediums
   • Verwerfen Sie das alte Medium aus dem Kulturgefäß.
2. Waschen der Zellen
   • Waschen Sie die Zellen mit einer ausgewogenen Salzlösung, die frei von Kalzium und Magnesium ist, oder verwenden Sie EDTA.
   • Geben Sie die Waschlösung vorsichtig auf die den Zellen gegenüberliegende Seite und schütteln Sie das Gefäß 1 bis 2 Minuten lang, bevor Sie die Waschlösung verwerfen.
3. Dissoziation
   • 2 bis 3 ml der gewählten Dissoziationslösung pro 25 cm² Wachstumsfläche auftragen, wobei darauf zu achten ist, dass die Zellschicht vollständig bedeckt ist.
   • Inkubieren Sie das Gefäß bei 37 °C und schütteln Sie es leicht. Die Dissoziation erfolgt in der Regel innerhalb von 5 bis 15 Minuten, je nach Zelllinie.
   • Bei hartnäckigen Zellen kann das Klopfen des Gefäßes den Prozess beschleunigen.
   • Beobachten Sie die Zellen sorgfältig, um eine Überbelichtung und mögliche Schäden zu vermeiden.
4. Entnahme der Zellen
   • Sobald sich die Zellen vollständig abgelöst haben, lassen Sie sie sich am Boden des Gefäßes sammeln, indem Sie es aufrecht stellen.
   • Fügen Sie das vollständige Medium hinzu, dispergieren Sie die Zellen und sammeln Sie sie auf, indem Sie über die Zellschicht pipettieren.
   • Zählen Sie sie und fahren Sie mit der Subkultivierung fort.

Bei beiden Methoden ist es wichtig, die optimalen Bedingungen für jede Zelllinie durch empirische Beobachtung zu ermitteln. Das Verfahren sollte die Lebensfähigkeit der Zellen erhalten, die während der Subkultivierung routinemäßig auf über 90 % überprüft werden sollte. Diese Verfahren bieten den Forschern eine Grundlage für die Anpassung an die spezifischen Anforderungen und Merkmale ihrer Zelllinien.

3.überblick über Techniken zur Subkultivierung adhärenter Zellen

Eine wirksame Subkultivierung von adhärenten Zellen erfordert ihre Ablösung vom Kulturgefäß. Dabei kommen verschiedene Methoden zum Einsatz, die jeweils für unterschiedliche Zelltypen und Bedingungen geeignet sind. Bei der Auswahl einer Dissoziationsmethode ist es entscheidend, die spezifischen Bedürfnisse der Zelllinie und die Ziele des Experiments zu berücksichtigen. Eine regelmäßige Überwachung der Lebensfähigkeit der Zellen, die zum Zeitpunkt der Subkultivierung bei über 90 % liegen sollte, ist für die weitere Gesundheit und Produktivität der Kultur unerlässlich. Im Folgenden finden Sie einen Überblick über diese Verfahren: