Cytions Leitfaden für exzellente Zellkulturen

Cytion bietet umfassende Richtlinien für die Kultivierung von Zelllinien, wobei die Bedeutung von Sterilität und aseptischen Techniken im Vordergrund steht. Unsere Protokolle gewährleisten eine erfolgreiche Zellkultur für eine Vielzahl von Zelltypen und Anwendungen.

1. Laborplanung

Der Aufbau eines Gewebekulturlabors erfordert eine sorgfältige Planung, um die Produktion von hochwertigem Material in einer sicheren und effizienten Umgebung zu gewährleisten. Optimale Einrichtungen umfassen getrennte Bereiche für die Quarantäne und die Verarbeitung von nicht kontaminiertem Material, mit jeweils eigenen Inkubatoren. Wenn der Platz eine Trennung nach Bereichen nicht zulässt, ist eine zeitliche Trennung der Bearbeitung verschiedener Materialien ratsam. Strenge Reinigungsprotokolle und die Einhaltung von Einschließungsstufen mindestens der Kategorie 2 sind unerlässlich, um Kontaminationsrisiken zu minimieren und eine kontrollierte Laborumgebung aufrechtzuerhalten.

2. Einrichten eines aseptischen Arbeitsbereichs

• Praktiken der Haube: Aufrechterhaltung eines laminaren Luftstroms durch korrekte Positionierung des Haubenflügels und Vermeidung von Unordnung.
• Sterilisation: Autoklavieren Sie Werkzeuge wie Pipettenspitzen und Glaspipetten, und verwenden Sie 70%iges Ethanol zur Oberflächendekontamination.

3. Vorbereitung von Medien und Reagenzien

• Auswahl der Kulturmedien: Konsultieren Sie unsere detaillierten Medientabellen, um Ihre Zelllinie mit dem geeigneten DMEM- oder RPMI-Medium zu versorgen, ergänzt durch Zusätze wie fötales Rinderserum (FBS) und Glutamin.
• Sterilität der Supplemente: Alle Kulturmedien und Supplemente müssen steril sein, gegebenenfalls unter Verwendung von Filtersterilisation.
• Persönliche Schutzausrüstung: In Zellkulturlabors hängt die Minimierung von Schäden von der strikten Einhaltung der persönlichen Schutzausrüstung ab, z. B. von Handschuhen, die der Norm EN 374-3 entsprechen.
• Desinfektion: Die Minimierung von Schäden hängt auch von der korrekten Verwendung von Desinfektionsmitteln wie Natriumhypochlorit oder Ethanol ab. Für umfassende Sicherheit und Wirksamkeit in der Laborhygiene sind in der folgenden Tabelle weitere Desinfektionsmittel und ihre spezifischen Anwendungsfälle aufgeführt:

4 Einrichtung der Kultivierungsumgebung

• Flaschen für adhärente Zelllinien: Mit Gewebekulturen behandelte Flaschen sind im Allgemeinen für die meisten Zelllinien ausreichend. Für bestimmte Zelltypen, die zusätzliche Unterstützung benötigen, können die Flaschen vorbehandelt oder mit Substraten wie Gelatine oder Fibronectin beschichtet werden. Diese Beschichtungen können die Anhaftung und Vermehrung von Zellen erheblich verbessern. Detaillierte Protokolle für die Vorbereitung und Beschichtung finden Sie in den jeweiligen Produktinformationsblättern.
• Flaschen für Suspensions-Zelllinien: Verwenden Sie Flaschen, die speziell für nicht-adhärente Zellen entwickelt wurden und die eine freie Bewegung und einen angemessenen Gasaustausch ermöglichen. Diese Flaschen benötigen keine Oberflächenbehandlung, die die Zellanhaftung fördert.

5. Überwachung der Zellgesundheit

Die Aufrechterhaltung der Gesundheit von Zellkulturen ist ein kritischer Aspekt der Zellkulturarbeit. Eine kontinuierliche Überwachung ist unerlässlich, um die Integrität und Reproduzierbarkeit der Versuchsergebnisse zu gewährleisten. Im Folgenden finden Sie ausführliche Hinweise zur Überwachung der Zellgesundheit:

5.1. Tägliche Überprüfungen

• Mikroskopische Auswertung: Untersuchen Sie die Zellen täglich unter dem Mikroskop, um die wichtigsten Indikatoren für den Gesundheitszustand der Zellen zu beurteilen, einschließlich der gleichmäßigen Zellanhaftung, der charakteristischen Morphologie und der erwarteten Wachstumsmuster. Achten Sie auf eine einheitliche Größe und Form der Zellen, das Vorhandensein ausgeprägter Zellkerne und das Fehlen von Körnigkeit, die auf den Zelltod hinweisen könnte.
• Überwachung der Wachstumsrate: Verfolgen Sie die Proliferationsrate, um sicherzustellen, dass sie mit der erwarteten Verdopplungszeit für die Zelllinie übereinstimmt. Plötzliche Veränderungen der Wachstumsrate können auf ein Problem mit der Zellgesundheit oder den Kulturbedingungen hindeuten.
• Beurteilung des Mediums: Überprüfen Sie die Farbe des Kulturmediums, die auf pH-Veränderungen hinweisen kann. Eine Gelbfärbung des Mediums deutet auf einen erhöhten Säuregehalt hin, der oft ein Nebenprodukt des Zellstoffwechsels oder einer bakteriellen Kontamination ist, während eine violette oder rosafarbene Färbung auf eine basischere Umgebung hinweisen kann.

5.2. Kriterien für die Verwerfung von Kulturen

• Indikatoren für Kontamination: Achten Sie auf Anzeichen einer Kontamination wie Trübungen des Mediums, unerwartete pH-Veränderungen oder das Vorhandensein von Mikrobenkolonien. Kontaminationen können bakterieller, pilzlicher oder viraler Natur sein, und jede Art hat ihre eigenen visuellen Anzeichen, wie z. B. bakterielle Filme oder Pilzhyphen.
• Abnorme Morphologie: Wenn Zellen anhaltende abnorme Veränderungen der Morphologie aufweisen, die nicht mit normalem Wachstum oder normaler Differenzierung einhergehen, kann es notwendig sein, die Kultur zu verwerfen. Dazu gehören umfangreiche Zellrundungen, Ablösungen oder das Vorhandensein von Zelltrümmern.
• Irreversible Stressanzeichen: Achten Sie auf Anzeichen für irreversiblen Stress oder Toxizität, wie Vakuolisierung, Membranblasen oder apoptotische Körper. Dies sind häufig Vorläufer des Zelltods und können die Versuchsergebnisse beeinträchtigen.
• Verschlechterung der Wachstumsbedingungen: Wenn die Kultur eine Konfluenz oder ein Überwachstum erreicht hat, was zu einer Verarmung an Nährstoffen und einer Ansammlung von Abfallstoffen führt, sollte die Kultur subkultiviert oder verworfen werden, um negative Auswirkungen auf die Zellgesundheit zu vermeiden.

6. Strategien für die Subkultivierung

Das Subkultivieren oder Teilen von Zellen ist ein routinemäßiger Bestandteil der Zellkultur, bei dem ein Teil der Zellkultur in ein frisches Wachstumsmedium übertragen wird, um die Kultur zu vermehren. Eine sorgfältige Planung und Ausführung sind für den Erfolg dieses Prozesses entscheidend. Im Folgenden finden Sie einige verbesserte Strategien für eine effektive Subkultivierung:

Planung von Splits

• Optimale Splitverhältnisse: Bestimmen Sie das ideale Splitverhältnis auf der Grundlage der Eigenschaften der Zelllinie, der Wachstumsraten und der beabsichtigten Verwendung der Kulturen. Dies könnte einen 1:2-Split für schnell wachsende Zellen oder einen 1:10-Split für langsamer wachsende Linien bedeuten.
• Spezifikationen des Anbieters: In den Produktblättern des Herstellers finden Sie Empfehlungen für die einzelnen Zelllinien, die oft detaillierte Protokolle für die Subkultur und die für die Zellen erforderlichen Bedingungen enthalten.
• Kontinuität der Kultur: Führen Sie eine Master-Zellbank und verwenden Sie eine konsequente Subkultivierungsroutine, um die Langlebigkeit und genetische Stabilität der Zelllinie im Laufe der Zeit zu gewährleisten.

Teilung adhärenter Zellen

Eine ausführliche Anleitung zum Teilen von adhärenten Zellen finden Sie in unserem separaten Artikel unten:

Zellkultur-Dissoziation ->

7.medienpflege

Rechtzeitiges Auffüllen mit Nährstoffen: Die Medien sollten gewechselt werden, bevor die Zellen die für ihr Wachstum und ihre Stoffwechselfunktionen wichtigen Nährstoffe verbrauchen.

kontrolle von pH-Wert und Toxinen: Regelmäßige Medienwechsel verhindern die Ansammlung von Stoffwechselnebenprodukten und sorgen für einen physiologischen pH-Wert, der für die Gesundheit der Zellen entscheidend ist.

8.kontrolle der Passagezahl

Begrenzung der Passage: Führen Sie ein detailliertes Protokoll der Zellpassagen. Häufige Passagen können zu einer genetischen Drift führen, die den Phänotyp und das Verhalten der Zellen verändern kann. Wenn Sie die Anzahl der Passagen begrenzen, erhalten Sie die genetische Stabilität und Integrität der Zelllinie.

Dokumentation der Passagenanzahl: Notieren Sie bei jeder Subkultivierung von Zellen die Passagenzahl. Diese Information ist für die Nachverfolgung der Zelllinienhistorie und die Identifizierung potenzieller passagebedingter Veränderungen des Zellverhaltens unerlässlich. In unserem Leitfaden finden Sie Informationen zur genauen Nachverfolgung der Passagenzahl.

Leitfaden zur Passagezahl ->

9.sicherstellung der Integrität der Zelllinie

• Verifizierungsaufzeichnungen: Überprüfen Sie regelmäßig die Identität der Zelllinie (z. B. durch Short Tandem Repeat (STR)-Profiling) und vermerken Sie dies in den Aufzeichnungen, um sicherzustellen, dass in allen Experimenten die richtige Zelllinie verwendet wird.
• Überwachung von Mutationen: Überwachen Sie nach Möglichkeit die wichtigsten genetischen oder phänotypischen Veränderungen, die auf eine genetische Drift oder eine Kontamination der Zelllinie hindeuten könnten, und führen Sie diese Aufzeichnungen zu Referenzzwecken.