Văn hóa tế bào động vật có vú: Nguyên lý cơ bản và kỹ thuật
Văn hóa tế bào động vật có vú là một kỹ thuật cơ bản trong nghiên cứu sinh học, cho phép các nhà khoa học nghiên cứu tế bào trong môi trường được kiểm soát bên ngoài cơ thể sống. Quá trình này bao gồm tách tế bào khỏi mô, duy trì chúng trong điều kiện được kiểm soát cẩn thận và nhân giống chúng cho các mục đích thí nghiệm khác nhau. Văn hóa tế bào động vật có vú là yếu tố quan trọng để hiểu các quá trình tế bào, cơ chế bệnh tật và phát triển các liệu pháp mới, bao gồm cả những liệu pháp sử dụng dòng tế bào bất tử
Điểm chính:
- Tế bào có thể được tách ra từ mô bằng phương pháp tiêu hóa enzym hoặc nuôi cấy mô
- Tế bào nguyên thủy có tuổi thọ giới hạn, trong khi dòng tế bào bất tử có thể nhân lên vô hạn
- Điều kiện nuôi cấy, bao gồm thành phần của môi trường nuôi cấy, là yếu tố quan trọng cho sự sống còn và nhân lên của tế bào
- Tế bào có thể được nuôi cấy trong môi trường lơ lửng hoặc bám dính, tùy thuộc vào loại tế bào và nhu cầu nghiên cứu
- Các môi trường nuôi cấy phổ biến bao gồm MEM, DMEM và RPMI 1640, mỗi loại được thiết kế riêng cho các loại tế bào cụ thể
- Điều kiện nuôi cấy điển hình bao gồm nhiệt độ 37°C, 5% CO2 và độ ẩm tương đối 95%
- Các chất thay thế huyết thanh như dịch lysate tiểu cầu người (hPL) ngày càng được sử dụng để tránh các vấn đề tiềm ẩn về nhiễm khuẩn
Các kỹ thuật tách tế bào
Quá trình thiết lập một dòng tế bào bắt đầu bằng việc tách tế bào từ mô. Có nhiều phương pháp để thực hiện điều này, mỗi phương pháp phù hợp với các loại mô và mục tiêu nghiên cứu khác nhau. Đối với mẫu máu, việc tách tế bào tương đối đơn giản, với tế bào bạch cầu là đối tượng chính cho việc nuôi cấy do khả năng phát triển của chúng. Mô rắn đòi hỏi các kỹ thuật tách chiết phức tạp hơn. Một phương pháp phổ biến là tiêu hóa enzym, trong đó các enzym như collagenase, trypsin hoặc pronase được sử dụng để phân hủy ma trận ngoại bào, giải phóng các tế bào riêng lẻ vào dung dịch. Ngoài ra, các nhà nghiên cứu có thể áp dụng phương pháp nuôi cấy mô ghép, trong đó các mảnh mô nhỏ được đặt trực tiếp vào môi trường nuôi cấy, cho phép các tế bào di chuyển ra ngoài và phát triển. Lựa chọn giữa các phương pháp này thường phụ thuộc vào loại mô cụ thể, quần thể tế bào mong muốn và mục đích sử dụng thí nghiệm. Cần lưu ý rằng các tế bào được tách trực tiếp từ cơ thể được gọi là tế bào nguyên thủy và, với một số ngoại lệ như tế bào từ khối u, thường có tuổi thọ giới hạn trong nuôi cấy trước khi trải qua quá trình lão hóa
Sản phẩm thiết yếu cho nuôi cấy tế bào động vật có vú
| Tên sản phẩm | Số sản phẩm | Danh mục | Ứng dụng |
|---|---|---|---|
| DMEM, chứa: 4,5 g/L glucose, chứa: 4 mM L-glutamine, chứa: 1,5 g/L NaHCO₃, chứa: 1,0 mM natri pyruvate | 820300a | Dung dịch nuôi cấy | Môi trường nuôi cấy đa năng cho các loại tế bào động vật có vú khác nhau |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L Glucose, w: 1,6 mM L-Glutamine, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM Natri pyruvate, w: 1,2 g/L NaHCO₃ | 820400a | Dung dịch nuôi cấy | Phù hợp cho nhiều loại tế bào động vật có vú, đặc biệt là tế bào biểu mô |
| RPMI 1640, chứa: 2.1 mM glutamine ổn định, chứa: 2.0 g/L NaHCO3 | 820700a | Dung dịch nuôi cấy | Thường được sử dụng cho các tế bào lympho và dòng tế bào lai |
| Accutase | 830100 | Dung dịch tách tế bào | Dung dịch tách tế bào nhẹ nhàng cho tế bào bám dính |
| Dung dịch đông lạnh CM-1 | 800150 | Bảo quản đông lạnh | Dùng để đông lạnh và bảo quản lâu dài tế bào động vật có vú |
| Dung dịch đông lạnh CM-ACF, không chứa huyết thanh | 800650 | Bảo quản lạnh | Dung dịch không chứa thành phần động vật cho việc đông lạnh tế bào |
| PBS | 860015 | Dung dịch đệm | Dùng để rửa tế bào và duy trì cân bằng pH |
| Dung dịch nuôi cấy tế bào nội mô | 820731 | Dung dịch chuyên dụng | Được tối ưu hóa cho việc nuôi cấy tế bào nội mô |
| Kiểm tra Mycoplasma | 900159 | Kiểm soát chất lượng | Cần thiết để phát hiện sự nhiễm mycoplasma trong các mẫu nuôi cấy |
| Xác thực dòng tế bào - Người | 900154 | Kiểm soát chất lượng | Xác minh danh tính của dòng tế bào người |
Bảng này đại diện cho một số sản phẩm thiết yếu cho nuôi cấy tế bào động vật có vú. Để xem toàn bộ danh mục sản phẩm nuôi cấy tế bào của chúng tôi, bao gồm các loại môi trường và hóa chất chuyên dụng, vui lòng truy cập trang danh mục Môi trường và Hóa chất của chúng tôi.
Accutase là dung dịch tách tế bào đã được lọc vô trùng, sẵn sàng sử dụng, được thiết kế như một giải pháp thay thế nhẹ nhàng cho trypsin/EDTA trong việc tách các tế bào động vật có vú bám dính khỏi các dụng cụ nuôi cấy mô tiêu chuẩn bằng nhựa và các bề mặt được phủ chất bám dính. Sản phẩm kết hợp hoạt tính enzyme phân giải protein và collagen trong dung dịch muối cân bằng để mang lại hiệu quả tách tế bào hiệu quả nhưng có kiểm soát, bảo tồn các protein bề mặt tế bào và hỗ trợ khả năng sống sót cao sau khi truyền tế bào cũng như tái bám dính nhanh chóng.
Công thức Accutase dựa trên dung dịch muối đệm phosphate của Dulbecco (DPBS) với EDTA và phenol red làm chỉ thị pH trực quan. Các enzyme có nguồn gốc không phải từ động vật có vú và vi khuẩn, khiến Accutase đặc biệt phù hợp cho nghiên cứu tế bào gốc, quy trình sản xuất vắc-xin và bất kỳ ứng dụng nào cần giảm thiểu tối đa các chất gây ô nhiễm có nguồn gốc từ động vật hoặc vi sinh vật. Dung dịch tự ức chế ở 37 °C, do đó không cần chất trung hòa hoặc môi trường chứa huyết thanh sau khi tách tế bào – tế bào có thể được chuyển trực tiếp vào môi trường mới.
Các tính năng chính
Dung dịch lỏng 1x đã lọc vô trùng, sẵn sàng sử dụng – không cần pha loãng hoặc tái tạo
Hoạt tính enzyme phân giải protein và collagen kết hợp để phân ly nhẹ nhàng
Mỗi lô được tiêu chuẩn hóa theo hoạt tính phân ly xác định để đảm bảo tính nhất quán giữa các lô
Enzyme có nguồn gốc không phải từ động vật có vú và vi khuẩn
Tự ức chế ở 37 °C – không cần dung dịch trung hòa
Được pha chế trong dung dịch PBS của Dulbecco với EDTA
Chứa phenol red làm chỉ thị pH trực quan
pH 6,8 – 7,8
Ứng dụng điển hình
Accutase nhẹ nhàng phân ly nhiều loại tế bào bám dính và nhạy cảm, bao gồm tế bào gốc phôi người (hESCs), tế bào gốc đa năng cảm ứng người (iPSCs), tế bào gốc thần kinh, tế bào thần kinh nguyên phát và các dòng tế bào bám dính được nuôi cấy thường xuyên như HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 và A549. Các trường hợp sử dụng điển hình bao gồm:
Nuôi cấy và truyền tế bào động vật có vú bám dính thường xuyên
Tách tế bào đơn nhẹ nhàng của hESCs, iPSCs và các dòng tế bào nhạy cảm khác
Chuẩn bị mẫu cho phân tích tế bào dòng chảy và phân tích FACS
Phân tích các dấu hiệu bề mặt tế bào khi tính toàn vẹn của epitope là yếu tố quan trọng
Các thử nghiệm về di chuyển, tăng sinh và apoptosis của tế bào
Thử nghiệm trạng thái nghỉ ngơi bằng cách thiếu hụt huyết thanh và nghiên cứu chuyển gen ung thư
Thử nghiệm di chuyển của tế bào ung thư và tế bào nơ-ron
Mở rộng quy mô sản xuất trong quy trình làm việc với bình phản ứng sinh học
Đối với công việc thường ngày, sử dụng khoảng 10 ml Accutase cho mỗi 75 cm2 bề mặt nuôi cấy và ủ trong 5–10 phút ở nhiệt độ phòng. Thời gian ủ tối ưu cần được xác định cho từng dòng tế bào và không được vượt quá một giờ. Trước khi thêm, rửa lớp tế bào bằng dung dịch muối không chứa Ca2+/Mg2+ như DPBS không có canxi và magiê để loại bỏ huyết thanh dư và các cation hóa trị hai.
Xử lý & Bảo quản
Bảo quản chai chưa mở trong tủ đông ở -15 °C hoặc thấp hơn. Rã đông ở nhiệt độ phòng hoặc qua đêm ở +2 °C đến +8 °C. Không rã đông Accutase trong bể nước 37 °C, vì nhiệt độ cao làm giảm hoạt tính enzym. Sau khi rã đông, dung dịch có thể được bảo quản trong tối đa 2 tháng ở +2 °C đến +8 °C; không bảo quản ở nhiệt độ phòng. Không làm ấm trước thuốc thử đến 37 °C trước khi sử dụng – thêm trực tiếp vào các tế bào đã rửa sạch ở nhiệt độ phòng. Để bảo quản lâu dài, nên chia thành các phần dùng một lần để tránh các chu kỳ rã đông lặp đi lặp lại. Luôn làm việc trong điều kiện vô trùng.
Chất lượng
Được sản xuất theo các tiêu chuẩn chất lượng nghiêm ngặt. Mỗi lô Accutase đều được lọc vô trùng và kiểm tra độ vô trùng, pH, hình thức và hoạt tính phân ly để đảm bảo hiệu suất ổn định, có thể lặp lại từ lô này sang lô khác.
Thông số kỹ thuật
Thông số
Chi tiết
Loại sản phẩmChất phản ứng tách tế bào / phân ly
Định dạngDung dịch đã được lọc vô trùng, sẵn sàng sử dụng
Thể tích100 ml
Nồng độ làm việc1x (sẵn sàng sử dụng)
Hoạt tính enzymKết hợp proteolytic và collagenolytic
Nguồn gốc enzymeKhông phải từ động vật có vú và không phải từ vi khuẩn
Hệ đệmDulbecco’s PBS với EDTA
Chất chỉ thị pHPhenol red
Phạm vi pH6,8 – 7,8
Hình thứcDung dịch trong suốt, màu đỏ nhạt đến cam
Nhiệt độ bảo quản-15 °C hoặc thấp hơn
Độ ổn định sau khi rã đôngTối đa 2 tháng ở nhiệt độ từ +2 °C đến +8 °C
Khối lượng sử dụng khuyến nghị~10 ml trên mỗi 75 cm² diện tích nuôi cấy
Thời gian ủ điển hình5 – 10 phút ở nhiệt độ phòng
Điều kiện vận chuyểnĐóng băng trên đá khô
Mục đích sử dụngChỉ dành cho mục đích nghiên cứu và sản xuất tiếp theo
Công thức (Thành phần trên mỗi lít)
Thành phần
Nồng độ (mg/L)
Muối vô cơ
Natri clorua (NaCl)8000,00
Phosphat hydro disodium (Na₂HPO₄)1150,00
Clorua kali (KCl)200,00
Phosphat dihydrogen kali (KH₂PO₄)200,00
Các thành phần khác
EDTA · 4Na (EDTA tetrasodium)220,00
Phenol đỏ3,00
Hỗn hợp enzyme độc quyền (có hoạt tính phân giải protein và collagen)1x
Accutase là nhãn hiệu đã đăng ký của Innovative Cell Technologies, Inc.
Dung dịch đệm phosphate (PBS) là một dung dịch đệm được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu sinh học và hóa học. Nó đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng pH và áp suất thẩm thấu trong các quy trình thí nghiệm khác nhau, bao gồm xử lý mô và nuôi cấy tế bào. Dung dịch PBS của chúng tôi được pha chế cẩn thận với các thành phần có độ tinh khiết cao để đảm bảo tính ổn định và độ tin cậy trong mọi thí nghiệm. Độ thẩm thấu và nồng độ ion của dung dịch PBS của chúng tôi tương tự như của cơ thể người, khiến nó trở thành dung dịch đẳng trương và không độc hại đối với hầu hết các tế bào.
Thành phần của dung dịch PBS của chúng tôi
Dung dịch PBS của chúng tôi là hỗn hợp được điều chỉnh pH của các dung dịch đệm phosphate và dung dịch muối có độ tinh khiết cao. Ở nồng độ làm việc 1X, nó chứa:
8000 mg/L Natri clorua (NaCl)
200 mg/L Kali clorua (KCl)
1150 mg/L Natri photphat dibasic khan (Na₂HPO₄)
200 mg/L Phosphat kali monobasic khan (KH₂PO₄)
Công thức này đảm bảo pH và cân bằng ion tối ưu, phù hợp cho nhiều ứng dụng sinh học khác nhau.
Ứng dụng của dung dịch PBS của chúng tôi
Dung dịch PBS của chúng tôi là lựa chọn lý tưởng cho nhiều ứng dụng trong nghiên cứu sinh học. Tính chất đẳng trương và không độc hại của nó khiến nó phù hợp cho việc pha loãng chất và rửa container tế bào. Dung dịch PBS chứa EDTA hiệu quả trong việc tách các tế bào bám dính và kết tụ. Tuy nhiên, không nên thêm các kim loại hai giá như kẽm vào PBS, vì điều này có thể gây kết tủa. Trong trường hợp này, các đệm Good's được khuyến nghị. Ngoài ra, dung dịch PBS của chúng tôi là một lựa chọn thay thế chấp nhận được cho môi trường vận chuyển virus trong việc vận chuyển và lưu trữ virus RNA, bao gồm SARS-CoV-2.
Kiểm soát chất lượng
Lọc vô trùng
Bảo quản và thời hạn sử dụng
Bảo quản ở nhiệt độ từ +2°C đến +25°C, tránh ánh sáng.
Sau khi mở, bảo quản ở nhiệt độ từ 2°C đến 25°C và sử dụng trong vòng 24 tháng.
Điều kiện vận chuyển
Nhiệt độ môi trường
Bảo quản
Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ từ +2°C đến +8°C trong điều kiện tối. Tránh đông lạnh và làm ấm thường xuyên lên +37°C, vì điều này làm giảm chất lượng sản phẩm.
Không làm nóng môi trường vượt quá 37°C hoặc sử dụng các nguồn nhiệt không kiểm soát như lò vi sóng.
Nếu chỉ sử dụng một phần môi trường, hãy lấy lượng cần thiết và làm ấm đến nhiệt độ phòng trước khi sử dụng.
Thành phần
Loại
Thành phần
Nồng độ (mg/L)
Muối
Kali clorua
200
Kali photphat monobasic khan
200
Clorua natri
8000
Natri photphat dibasic khan
1150
Phương pháp phân tích
CLS cung cấp cả xét nghiệm ngắn hạn và dài hạn để phát hiện mycoplasma. Trong xét nghiệm ngắn hạn, mẫu được kiểm tra ngay sau khi nhận, trong khi xét nghiệm dài hạn yêu cầu khởi động nuôi cấy tế bào và kiểm tra sau 14 ngày nuôi cấy không sử dụng kháng sinh. Xét nghiệm mycoplasma được thực hiện bằng hệ thống phát hiện hai điểm, sử dụng cả bộ kit phát hiện mycoplasma PlasmoTest™ (Invivogen) và bộ kit phát hiện mycoADVANCED Certus QC (Certus).
Mẫu
Đối với xét nghiệm nhanh, vui lòng cung cấp tối thiểu 50 µl dung dịch tế bào chứa 50.000 tế bào. Dung dịch tế bào có thể được vận chuyển ở nhiệt độ phòng.
Đối với xét nghiệm cao cấp, vui lòng cung cấp tối thiểu 1 triệu tế bào trong môi trường đông lạnh phù hợp để đảm bảo môi trường nuôi cấy khỏe mạnh và ổn định cho quá trình nuôi cấy và xét nghiệm sau đó. Vui lòng vận chuyển mẫu trên đá khô.
Vui lòng điền vào Phiếu mẫu xét nghiệm Mycoplasma và đính kèm với lô mẫu của bạn.
Phép thử báo cáo màu
Xét nghiệm này là một xét nghiệm màu dựa trên tế bào. Trong sự hiện diện của mycoplasma, dòng tế bào báo cáo kích hoạt một chuỗi tín hiệu gây ra sự thay đổi màu sắc của môi trường từ đỏ sang xanh. Xét nghiệm được thực hiện trong các đĩa đa giếng 96 giếng. Các tín hiệu được phát hiện bằng máy quang phổ viplate ở bước sóng 620-655 nm. Tất cả các loài mycoplasma và acholeplasma, cũng như các tạp chất khác trong nuôi cấy tế bào như vi khuẩn, đều được phát hiện.
Phóng đại nhiệt độ không đổi
Phóng đại nhiệt độ không đổi là một xét nghiệm nhanh và đáng tin cậy dựa trên việc phóng đại nhiệt độ không đổi của DNA đặc hiệu mycoplasma kết hợp với phát hiện thời gian thực sử dụng thuốc nhuộm DNA. Xét nghiệm có khả năng phát hiện sáu loài phổ biến nhất chiếm hơn 95% các trường hợp nhiễm bẩn: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis và A.laidlawii. Do sự tương đồng về trình tự, các loài mycoplasma khác cũng sẽ được phát hiện (M.pneumoniae, M.gallisepticum và M.synoviae). Để xác định xem mẫu có dương tính hay âm tính với mycoplasma, nhiệt độ tan chảy (Tm) được nghiên cứu.
Kết luận: Vai trò quan trọng của nuôi cấy tế bào động vật có vú trong nghiên cứu hiện đại
Văn hóa tế bào động vật có vú đã cách mạng hóa nghiên cứu sinh học và y học, cung cấp cho các nhà khoa học những công cụ mạnh mẽ để nghiên cứu các quá trình tế bào phức tạp, cơ chế bệnh tật và các can thiệp điều trị tiềm năng. Từ việc tách chiết tế bào nguyên thủy đến phát triển các dòng tế bào bất tử, kỹ thuật này đã trở thành một phần không thể thiếu trong bộ công cụ khoa học hiện đại
Hành trình của nuôi cấy tế bào động vật có vú bắt đầu với các kỹ thuật tách biệt cẩn thận, tiếp tục qua việc duy trì tế bào trong môi trường chuyên biệt một cách tỉ mỉ, và kết thúc với một loạt ứng dụng đa dạng trong các lĩnh vực nghiên cứu khác nhau. Cho dù là nghiên cứu ung thư, phát hiện thuốc hay sinh học tế bào cơ bản, khả năng nuôi cấy và thao tác tế bào động vật có vú trong ống nghiệm đã mở ra những con đường chưa từng có cho việc khám phá khoa học
Yếu tố then chốt cho thành công của nuôi cấy tế bào động vật có vú là các điều kiện được kiểm soát cẩn thận mà tế bào được duy trì. Từ thành phần của môi trường nuôi cấy đến các thông số môi trường chính xác trong tủ ấm, mọi khía cạnh đều được tối ưu hóa để mô phỏng điều kiện tự nhiên của tế bào một cách sát nhất có thể. Sự chú ý đến chi tiết này đảm bảo tính đáng tin cậy và khả năng tái hiện của thí nghiệm, là nền tảng của thực hành khoa học tốt
Sự phát triển của các dòng tế bào bất tử, như dòng tế bào HeLa được sử dụng rộng rãi, đã mở rộng thêm khả năng của nuôi cấy tế bào. Các dòng tế bào này cung cấp các mô hình tế bào nhất quán và dễ dàng tiếp cận, đã thúc đẩy nghiên cứu trong nhiều lĩnh vực
Khi nhìn về tương lai, nuôi cấy tế bào động vật có vú tiếp tục phát triển. Các tiến bộ trong kỹ thuật nuôi cấy 3D, phát triển organoid và sử dụng môi trường nuôi cấy được định nghĩa hóa học đang mở rộng giới hạn của những gì có thể đạt được trong nuôi cấy tế bào. Những phát triển này hứa hẹn sẽ đưa các mô hình in vitro gần hơn với độ phức tạp của hệ thống in vivo, có thể cách mạng hóa việc phát hiện thuốc, y học cá nhân hóa và sự hiểu biết của chúng ta về sinh học con người
Tóm lại, nuôi cấy tế bào động vật có vú vẫn là một kỹ thuật động lực và thiết yếu trong nghiên cứu khoa học đời sống. Sự hoàn thiện và ứng dụng liên tục của nó chắc chắn sẽ đóng vai trò quan trọng trong việc giải quyết một số câu hỏi cấp bách nhất trong sinh học và y học, thúc đẩy tiến bộ khoa học trong nhiều năm tới