Môi trường nuôi cấy tế bào: Tổng quan

Trong lĩnh vực khoa học đời sống, một trong những phương pháp quan trọng nhất là nuôi cấy tế bào. Việc lấy tế bào, mô hoặc cơ quan từ động vật hoặc thực vật và sau đó cấy ghép những tế bào, mô hoặc cơ quan đó vào một môi trường nhân tạo thuận lợi cho sự sống sót và/hoặc phát triển của chúng chính là ý nghĩa của cụm từ "nuôi cấy tế bào". Các yêu cầu cơ bản về môi trường để tế bào phát triển tối ưu là nhiệt độ được kiểm soát, chất nền để tế bào bám dính, môi trường nuôi cấy thích hợp và tủ ấm duy trì độ pH và độ thẩm thấu tối ưu. Tế bào phải có những điều kiện này để phát triển hết tiềm năng.

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp cho quá trình nuôi cấy in vitro là giai đoạn quan trọng nhất và thiết yếu nhất trong nuôi cấy tế bào. Môi trường nuôi cấy, còn được gọi là môi trường nuôi dưỡng, là chất lỏng hoặc gel được pha chế để thúc đẩy sự phát triển của các sinh vật ở cấp độ vi mô, tế bào hoặc thực vật. Môi trường dùng để nuôi cấy tế bào thường chứa nguồn năng lượng dồi dào và các chất điều hòa chu kỳ tế bào. Các thành phần chính của môi trường nuôi cấy bao gồm axit amin, vitamin, muối vô cơ, glucose và huyết thanh. Huyết thanh được thêm vào môi trường vì nó đóng vai trò là nguồn cung cấp các yếu tố tăng trưởng, hormone và các yếu tố bám dính. Ngoài việc cung cấp chất dinh dưỡng, môi trường còn góp phần duy trì mức pH và độ thẩm thấu.

Các loại môi trường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào

Cả tế bào người và tế bào động vật đều có khả năng được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo hoặc tổng hợp, hoặc trong môi trường hoàn toàn tự nhiên được bổ sung các yếu tố tự nhiên. Trong phần tiếp theo, chúng tôi sẽ cung cấp cho bạn một cái nhìn tổng quan về các loại môi trường khác nhau hiện có.

Môi trường nuôi cấy tự nhiên

Chỉ các chất lỏng sinh học tồn tại ở trạng thái tự nhiên mới có thể được tìm thấy trong môi trường tự nhiên. Môi trường tự nhiên rất hữu ích và dễ dàng cho việc nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật khác nhau. Việc chưa hiểu rõ các thành phần chính xác tạo nên môi trường tự nhiên là yếu tố chính dẫn đến tính lặp lại thấp của các kết quả thu được khi sử dụng môi trường tự nhiên.

Môi trường nhân tạo

Việc chuẩn bị môi trường nhân tạo hoặc tổng hợp bao gồm việc bổ sung các chất dinh dưỡng (cả hữu cơ và vô cơ), protein huyết thanh, carbohydrate, đồng yếu tố, vitamin và muối, cũng như các pha khí O₂ và CO₂ [1].

Nhiều loại môi trường nhân tạo đã được phát triển nhằm đáp ứng một hoặc nhiều chức năng sau: 1) Duy trì sự sống ngay lập tức (dung dịch muối cân bằng với pH và áp suất thẩm thấu chính xác). 2) Duy trì sự sống kéo dài (dung dịch muối cân bằng được bổ sung các công thức khác nhau của hóa chất hữu cơ và/hoặc huyết thanh). 3) Phát triển vô thời hạn. 4) Các chức năng chuyên biệt.

Có bốn phân loại riêng biệt cho môi trường nhân tạo:

Môi trường chứa huyết thanh

Loại chất bổ sung thường gặp nhất trong môi trường dùng để nuôi cấy tế bào động vật là huyết thanh bò thai. Chất này được thêm vào môi trường nuôi cấy như một chất bổ sung giá rẻ nhằm đạt được điều kiện phát triển tốt nhất có thể. Ngoài vai trò là chất vận chuyển hoặc chất chelat hóa cho các chất dinh dưỡng không ổn định hoặc không tan trong nước, hormone và các yếu tố tăng trưởng, chất ức chế protease và các chất khác, huyết thanh còn liên kết và trung hòa các phân tử có hại.

Môi trường không có huyết thanh

Sự hiện diện của huyết thanh trong môi trường nuôi cấy có một số nhược điểm và có khả năng gây ra những sai sót lớn trong việc giải thích kết quả nghiên cứu miễn dịch [2, 3]. Đã có nhiều loại môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh khác nhau được tạo ra [4, 5]. Các môi trường này thường được thiết kế đặc biệt để hỗ trợ nuôi cấy một loại tế bào cụ thể, chẳng hạn như Knockout Serum Replacement và Knockout DMEM của Thermo Fisher Scientific, cùng với môi trường mTESR của Stem Cell Technologies [6], dành cho tế bào gốc [7].

Ngoài ra, các môi trường này còn chứa một lượng xác định các yếu tố tăng trưởng tinh khiết, lipoprotein và các protein khác, vốn thường được cung cấp bởi huyết thanh [8]. Các môi trường này thường được gọi là “môi trường nuôi cấy xác định” vì các thành phần cấu thành chúng đã được hiểu rõ.

Môi trường nuôi cấy được xác định về mặt hóa học

Các môi trường này bao gồm các thành phần vô cơ và hữu cơ siêu tinh khiết, không bị nhiễm bất kỳ loại tạp chất nào. Chúng cũng có thể bao gồm các chất bổ sung protein tinh khiết, chẳng hạn như các yếu tố tăng trưởng.

 Việc biến đổi gen của vi khuẩn hoặc nấm men, cùng với việc bổ sung các axit béo, vitamin, cholesterol và axit amin cụ thể, dẫn đến việc sản xuất các thành phần của chúng [9].

Môi trường không chứa protein

Môi trường không chứa protein là những môi trường hoàn toàn không chứa protein mà chỉ bao gồm các thành phần phi protein. So với môi trường có bổ sung huyết thanh, việc sử dụng môi trường không bổ sung protein thúc đẩy sự tăng sinh tế bào và biểu hiện protein mạnh mẽ hơn, đồng thời giúp việc tinh chế bất kỳ sản phẩm nào được tạo ra trong quá trình hạ lưu trở nên dễ dàng hơn [10-12]. Protein không được bao gồm trong các công thức như MEM và RPMI-1640. Tuy nhiên, có thể bổ sung protein nếu cần thiết.

Môi trường nuôi cấy và các thành phần cơ bản của nó

Môi trường nuôi cấy thương mại có thể được mua dưới dạng bột hoặc chất lỏng và thường chứa nhiều chất dinh dưỡng khác nhau như axit amin, glucose, muối, vitamin và các chất bổ sung dinh dưỡng khác. 

Nhu cầu về các thành phần này khác nhau đối với từng dòng tế bào, và những sự khác biệt này là nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng về công thức môi trường nuôi cấy. Mỗi thành phần đảm nhiệm một chức năng nhất định, sẽ được trình bày trong các đoạn sau:

Hệ thống đệm

Để duy trì điều kiện sinh trưởng tối ưu, pH phải được kiểm soát, thường được thực hiện bằng một trong hai hệ thống đệm sau:

Hệ thống đệm tự nhiên

Tỷ lệ CO2/H2CO3 trong khí quyển bằng với tỷ lệ trong môi trường nuôi cấy, tạo ra một cơ chế đệm tự nhiên. Để duy trì cơ chế đệm tự nhiên này, các mẫu nuôi cấy phải được giữ trong môi trường không khí có nồng độ CO2 từ 5-10%, điều này thường được thực hiện bằng cách sử dụng tủ ấp CO2. Một trong những ưu điểm lớn nhất của việc sử dụng chất đệm tự nhiên là chi phí rẻ và an toàn.

HEPES

Đệm hóa học sử dụng ion lưỡng tính HEPES có khả năng đệm cao hơn trong phạm vi pH 7,2-7,4 và không cần môi trường khí được điều chỉnh. Đối với một số loại tế bào cụ thể, liều lượng HEPES cao hơn có thể gây hại. Môi trường nuôi cấy có chứa HEPES cũng dễ bị ảnh hưởng bởi tác động quang độc của ánh sáng huỳnh quang hơn nhiều [13].

Phenol Red

Chất chỉ thị pH phenol red thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy thương mại, cho phép theo dõi liên tục giá trị pH. Khi tế bào phát triển, các chất chuyển hóa do chúng sản sinh ra gây ra sự thay đổi pH và do đó làm thay đổi màu sắc của môi trường nuôi cấy. Phenol Red có tác động kép lên màu sắc của môi trường nuôi cấy: chuyển sang màu vàng ở pH axit và màu tím ở pH kiềm. pH 7,4 – giá trị tối ưu cho nuôi cấy tế bào – khiến môi trường nuôi cấy có màu đỏ huỳnh quang.

Tuy nhiên, phenol red có một số nhược điểm: Thứ nhất, phenol red có khả năng mô phỏng hoạt động của một số hormone steroid, chủ yếu là estrogen [14]. Do đó, khi nghiên cứu các tế bào nhạy cảm với estrogen như mô vú, nên sử dụng môi trường nuôi cấy không chứa phenol red. Sự cân bằng natri-kali bị phá vỡ do sự hiện diện của phenol red trong một số công thức không có huyết thanh. Việc thêm huyết thanh hoặc hormone tuyến yên bò vào môi trường nuôi cấy có thể khắc phục tác động này [15]. Thứ ba, việc phát hiện trong các thí nghiệm đo lưu lượng tế bào bị cản trở do sự hiện diện của phenol red.

Muối vô cơ

Môi trường nuôi cấy chứa muối vô cơ, chẳng hạn như ion natri, kali và canxi, giúp duy trì cân bằng thẩm thấu và điều chỉnh điện thế màng tế bào.

Axit amin

Vì axit amin là thành phần cơ bản của protein, chúng là thành phần thiết yếu của mọi môi trường nuôi cấy tế bào từng được phát minh. Do tế bào không thể tự sản xuất một số axit amin nhất định, nên điều quan trọng là môi trường nuôi cấy phải chứa các axit amin thiết yếu. Chúng cần thiết cho sự nhân lên của tế bào, và nồng độ của chúng quyết định mật độ tế bào tối đa có thể đạt được. Đặc biệt, L-glutamine, một axit amin thiết yếu, có vai trò đặc biệt quan trọng.

L-glutamine đóng vai trò là nguồn năng lượng thứ cấp cho quá trình chuyển hóa và cung cấp nitơ cho việc sản xuất NAD, NADPH và các nucleotide. Do L-glutamine là một axit amin không ổn định, theo thời gian sẽ chuyển hóa thành dạng mà tế bào không thể sử dụng được, nên nó phải được bổ sung vào môi trường nuôi cấy.

Ngoài ra, các axit amin không thiết yếu có thể được bổ sung vào môi trường nuôi cấy để bù đắp lượng đã bị tiêu hao trong quá trình sinh trưởng. Sự sinh trưởng của tế bào được thúc đẩy và khả năng sống sót của chúng được tăng cường khi môi trường nuôi cấy được bổ sung các axit amin không thiết yếu.

Carbohydrate

Carbohydrate dưới dạng đường là nguồn năng lượng chính. Ngoài các loại đường phổ biến như glucose và galactose, nhiều môi trường nuôi cấy còn chứa maltose và fructose.

Protein và peptit

Albumin, transferrin và fibronectin là các protein và peptit được sử dụng phổ biến nhất. Chúng đặc biệt quan trọng trong các môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh. Albumin, transferrin, aprotinin, fetuin và fibronectin là một số protein có thể tìm thấy trong huyết thanh, vốn là nguồn cung cấp protein dồi dào.

Albumin là protein chính có trong máu, có chức năng liên kết và vận chuyển các chất khác nhau, bao gồm nước, muối, axit béo tự do, hormone và vitamin, giữa các cơ quan và tế bào khác nhau. Khả năng liên kết với các chất hóa học của albumin khiến nó trở thành một ứng cử viên hiệu quả để loại bỏ các hợp chất có hại khỏi môi trường nuôi cấy tế bào.

Aprotinin là chất bảo vệ trong hệ thống nuôi cấy tế bào, do nó ổn định ở pH trung tính và axit, cũng như chịu được nhiệt độ cao và sự phân hủy có thể do các enzym proteolytic gây ra. Chất này có khả năng ức chế một số protease serine, bao gồm trypsin và các loại khác.

Fetuin là một glycoprotein có thể được phát hiện với lượng cao hơn trong huyết thanh của thai nhi và động vật sơ sinh so với huyết thanh của động vật trưởng thành. Ngoài ra, nó còn hoạt động như một chất ức chế protease serine. Protein fibronectin là thành phần thiết yếu trong quá trình bám dính tế bào. Transferrin là một loại protein vận chuyển sắt và chịu trách nhiệm cung cấp sắt cho màng tế bào.

Axit béo và lipid

Chúng đóng vai trò quan trọng trong môi trường nuôi cấy không có huyết thanh khi huyết thanh vắng mặt.

Vitamin

Nhiều loại vitamin là cần thiết cho sự phát triển và sinh sôi của tế bào. Tế bào không thể tự sản xuất vitamin với lượng đủ nên vitamin là chất bổ sung dinh dưỡng thiết yếu trong nuôi cấy mô.

Trong nuôi cấy tế bào, huyết thanh là nguồn vitamin chính; tuy nhiên, môi trường nuôi cấy cũng được bổ sung các loại vitamin khác nhau để phù hợp với từng loại tế bào cụ thể. Thông thường, các vitamin nhóm B được sử dụng để kích thích sự tăng trưởng.

Các nguyên tố vi lượng

Các nguyên tố hóa học như đồng, kẽm, selen và các chất trung gian của axit tricarboxylic được gọi là nguyên tố vi lượng. Nguyên tố vi lượng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh để thay thế những nguyên tố thường có trong huyết thanh. Những nguyên tố này là các thành phần hóa học quan trọng cần thiết cho sự phát triển khỏe mạnh của tế bào. Nhiều phản ứng sinh hóa phụ thuộc vào các vi chất dinh dưỡng nhất định, chẳng hạn như hoạt động của enzyme.

Chất bổ sung môi trường nuôi cấy

Môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh được đề xuất cho một số dòng tế bào nhất định cần có các thành phần bổ sung không có trong môi trường cơ bản và huyết thanh. Các chất bổ sung này hỗ trợ sự phát triển của tế bào và chức năng trao đổi chất thích hợp.

Mặc dù hormone, yếu tố tăng trưởng và các phân tử tín hiệu là yếu tố thiết yếu cho sự nhân lên thích hợp của các dòng tế bào cụ thể, nhưng luôn cần tuân thủ các biện pháp phòng ngừa sau: Vì việc bổ sung các chất này có thể làm thay đổi độ thẩm thấu của môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh, từ đó có thể ức chế sự phát triển của tế bào, nên luôn cần kiểm tra lại độ thẩm thấu sau khi bổ sung. Đối với phần lớn các dòng tế bào, độ thẩm thấu tối ưu dao động trong khoảng từ 260 đến 320 mOSM/kg.

Kháng sinh

Kháng sinh thường được sử dụng để ức chế sự phát triển của các tác nhân gây ô nhiễm vi khuẩn và nấm [16], mặc dù chúng không phải là yếu tố thiết yếu cho sự phát triển của tế bào. Do kháng sinh có thể che giấu sự nhiễm bẩn bởi mycoplasma và vi khuẩn kháng thuốc, việc sử dụng thường xuyên kháng sinh không được khuyến nghị trong nuôi cấy tế bào [17, 18].

Ngoài ra, kháng sinh có thể làm rối loạn quá trình trao đổi chất của các tế bào quá mẫn cảm. Các hỗn hợp penicillin-streptomycin do MilliporeSigma và Life Technologies sản xuất thường được sử dụng. Plasmocin đã được sử dụng trong nuôi cấy các dòng tế bào u thần kinh đệm TS603, TS516 và BT260 [19], và đã được chứng minh là có hiệu quả trong việc loại bỏ nhiễm mycoplasma (20).

Huyết thanh

Albumin, các yếu tố tăng trưởng và các chất ức chế tăng trưởng đều có trong huyết thanh. Huyết thanh là một trong những thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy tế bào vì nó cung cấp axit amin, protein, vitamin (đặc biệt là các vitamin tan trong chất béo như A, D, E và K), carbohydrate, lipid, hormone, các yếu tố tăng trưởng, khoáng chất và các nguyên tố vi lượng.

Huyết thanh từ nguồn bò thai và bê thường được sử dụng để thúc đẩy sự phát triển của tế bào nuôi cấy. Huyết thanh bò thai là nguồn cung cấp dồi dào các yếu tố tăng trưởng và phù hợp cho việc nhân bản tế bào cũng như phát triển các tế bào nhạy cảm. Do khả năng thúc đẩy tăng trưởng bị suy giảm, huyết thanh bê được sử dụng trong các thí nghiệm ức chế tiếp xúc. Môi trường nuôi cấy thông thường thường chứa từ 2% đến 10% huyết thanh. Việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy phục vụ các mục đích sau [21]:

• Huyết thanh cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu cho tế bào (cả ở dạng dung dịch và gắn với protein).

• Huyết thanh chứa một số yếu tố tăng trưởng và hormone tham gia vào quá trình thúc đẩy tăng trưởng và hoạt động chuyên biệt của tế bào.

• Nó cung cấp nhiều protein liên kết, như albumin và transferrin, giúp vận chuyển các chất hóa học khác vào tế bào. Ví dụ, albumin vận chuyển chất béo, vitamin, hormone, v.v. vào tế bào.

• Nó cũng cung cấp các protein, chẳng hạn như fibronectin, giúp tăng khả năng bám dính của tế bào vào chất nền. Ngoài ra, nó còn tạo ra các yếu tố lan tỏa giúp tế bào mở rộng trước khi phân chia.

• Nó cung cấp các chất ức chế protease giúp ngăn chặn quá trình phân giải protein trong tế bào.

• Nó cũng chứa các khoáng chất như Na+, K+, Zn2+ và Fe2+.

• Nó làm tăng độ nhớt của môi trường nuôi cấy, từ đó bảo vệ tế bào khỏi tổn thương cơ học trong quá trình khuấy trộn khi nuôi cấy tế bào trong dung dịch lơ lửng.

• Nó cũng đóng vai trò như một chất đệm.

Tài liệu tham khảo

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Dinh dưỡng của tế bào động vật trong nuôi cấy mô; các nghiên cứu ban đầu về môi trường nuôi cấy tổng hợp. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Sự hấp phụ nhanh chóng của một thành phần huyết thanh bò thai bởi các tế bào động vật có vú trong nuôi cấy. Một nguồn tiềm ẩn gây ra hiện tượng giả trong các nghiên cứu về huyết thanh kháng thể đối với các kháng nguyên đặc hiệu tế bào. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Việc bổ sung huyết thanh vào môi trường dùng để chuẩn bị huyền phù tế bào là một nguồn có thể gây ra sai lệch trong các phản ứng miễn dịch tế bào được nghiên cứu thông qua thử nghiệm hạch bạch huyết vùng gối. Tạp chí Di truyền Miễn dịch. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh thương mại: sự phát triển của tế bào lai và sản xuất kháng thể đơn dòng. Tạp chí Phương pháp Miễn dịch học. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Các phương pháp nuôi cấy tế bào trong môi trường không chứa huyết thanh. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, và cộng sự. Các protein chaperone HSP70 vận chuyển TDP-43 không chứa RNA vào các vỏ cầu lỏng nội nhân có tính dị hướng. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, và cộng sự. Quá trình lão hóa do hội chứng Down gây ra làm rối loạn cấu trúc nhân của các tế bào tiền thân thần kinh. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Thay thế hoàn toàn huyết thanh bằng albumin, transferrin và lipid đậu nành trong môi trường nuôi cấy các tế bào lympho B phản ứng với lipopolysaccharide. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Cải tiến có hệ thống môi trường nuôi cấy không chứa protein và được định nghĩa hóa học dành cho sự phát triển của tế bào hybridoma và sản xuất kháng thể đơn dòng. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Môi trường không chứa protein để nuôi cấy tế bào lai và các tế bào khác của hệ miễn dịch. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Nuôi cấy tế bào không huyết thanh: một phương pháp thống nhất. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Sự phát triển dòng tế bào chuột hamster Trung Quốc trong môi trường không chứa protein. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Phân tích tác dụng độc tế bào của môi trường nuôi cấy chứa HEPES khi tiếp xúc với ánh sáng. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Chất Phenol red trong môi trường nuôi cấy mô là một estrogen yếu: những hàm ý liên quan đến việc nghiên cứu các tế bào nhạy cảm với estrogen trong nuôi cấy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Phát triển môi trường nuôi cấy không có huyết thanh. Trong: Master JRW, biên tập. Animal Cell culture, ấn bản thứ 3. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Việc sử dụng kháng sinh trong môi trường nuôi cấy tế bào. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Sự lây lan và kiểm soát nhiễm trùng mycoplasma trong nuôi cấy tế bào. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Thay đổi môi trường nuôi cấy và nhân giống dòng tế bào. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, và cộng sự. Enzym demethylase histone KDM6A trực tiếp cảm nhận oxy để điều chỉnh cấu trúc chromatin và số phận tế bào. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M, và cộng sự. Hiệu quả của Plasmocin™ trên các dòng tế bào động vật có vú bị nhiễm mollicutes so với các loại kháng sinh thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào: kinh nghiệm tại địa phương. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Các khía cạnh phân tử của sự liên kết ligand với albumin huyết thanh. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53