Vật liệu nuôi cấy tế bào: Tổng quan

Trong lĩnh vực khoa học đời sống, một trong những phương pháp quan trọng nhất là nuôi cấy tế bào. Việc lấy tế bào, mô hoặc cơ quan từ động vật hoặc thực vật và sau đó cấy ghép những tế bào, mô hoặc cơ quan đó vào một môi trường nhân tạo thuận lợi cho sự sống sót và/hoặc phát triển của chúng được gọi là "nuôi cấy tế bào." Các yêu cầu môi trường cơ bản để phát triển tế bào tối ưu bao gồm nhiệt độ được kiểm soát, chất nền cho tế bào bám dính, môi trường nuôi cấy đủ dinh dưỡng và tủ ấm duy trì pH và độ thẩm thấu tối ưu. Tế bào phải có những điều kiện này để phát triển hết tiềm năng của mình.

Việc lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp cho quá trình nuôi cấy in vitro là giai đoạn quan trọng và thiết yếu nhất trong nuôi cấy tế bào. Môi trường nuôi cấy, còn được gọi là môi trường nuôi cấy, là dung dịch hoặc gel được pha chế để khuyến khích sự phát triển của các sinh vật ở cấp độ vi mô, tế bào hoặc thực vật. Môi trường dùng để nuôi cấy tế bào thường chứa đủ nguồn năng lượng và các chất điều chỉnh chu kỳ tế bào. Các thành phần chính của môi trường nuôi cấy bao gồm axit amin, vitamin, muối vô cơ, glucose và huyết thanh. Huyết thanh được thêm vào môi trường vì nó đóng vai trò là nguồn cung cấp các yếu tố tăng trưởng, hormone và yếu tố bám dính. Ngoài việc cung cấp dinh dưỡng, môi trường còn góp phần duy trì mức pH và osmolality.

Các loại môi trường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào

Cả tế bào người và động vật đều có thể được nuôi cấy trong môi trường nhân tạo hoặc tổng hợp, hoặc trong môi trường hoàn toàn tự nhiên được bổ sung các yếu tố tự nhiên. Dưới đây, chúng tôi sẽ cung cấp cho bạn tổng quan về các loại môi trường hiện có.

Môi trường tự nhiên

Chỉ có các chất lỏng sinh học tồn tại ở trạng thái tự nhiên mới có thể được tìm thấy trong môi trường tự nhiên. Môi trường tự nhiên rất hữu ích và dễ dàng cho việc nuôi cấy nhiều loại tế bào động vật khác nhau. Sự thiếu hiểu biết về các thành phần chính xác cấu thành môi trường tự nhiên là yếu tố chính dẫn đến tính tái hiện thấp của kết quả thu được khi sử dụng môi trường tự nhiên.

Môi trường nhân tạo

Việc chuẩn bị môi trường nhân tạo hoặc tổng hợp bao gồm việc bổ sung các chất dinh dưỡng (cả hữu cơ và vô cơ), protein huyết thanh, carbohydrate, đồng yếu tố, vitamin và muối, cũng như các pha khí O2 và CO2 [1].

Các loại môi trường nhân tạo khác nhau đã được phát triển để đáp ứng một hoặc nhiều chức năng sau: 1) Sự sống sót ngay lập tức (một dung dịch muối cân bằng với pH và áp suất thẩm thấu chính xác). 2) Sự sống sót kéo dài (một dung dịch muối cân bằng được bổ sung các công thức khác nhau của hóa chất hữu cơ và/hoặc huyết thanh). 3) Phát triển vô thời hạn. 4) Chức năng chuyên biệt.

Có bốn phân loại riêng biệt cho môi trường nhân tạo:

Môi trường chứa huyết thanh

Loại chất bổ sung phổ biến nhất trong môi trường nuôi cấy tế bào động vật là huyết thanh bò non. Nó được thêm vào môi trường nuôi cấy như một chất bổ sung chi phí thấp để đạt được điều kiện phát triển tốt nhất. Ngoài việc hoạt động như một chất vận chuyển hoặc chất chelate cho các chất dinh dưỡng không ổn định hoặc không tan trong nước, hormone và yếu tố tăng trưởng, ức chế protease và các chất khác, huyết thanh còn liên kết và trung hòa các phân tử có hại.

Phương tiện nuôi cấy không chứa huyết thanh

Sự hiện diện của huyết thanh trong môi trường nuôi cấy có một số nhược điểm và có thể gây ra sai sót nghiêm trọng trong việc giải thích kết quả nghiên cứu miễn dịch [2, 3]. Đã có nhiều loại môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh khác nhau được phát triển [4, 5]. Các môi trường này thường được thiết kế riêng để hỗ trợ nuôi cấy một loại tế bào cụ thể, chẳng hạn như Knockout Serum Replacement và Knockout DMEM của Thermo Fisher Scientific, và mTESR medium của Stem Cell Technologies [6], dành cho tế bào gốc [7].

Ngoài ra, các môi trường này chứa các lượng xác định của các yếu tố tăng trưởng tinh khiết, lipoprotein và các protein khác, vốn thường được cung cấp bởi huyết thanh [8]. Các môi trường này thường được gọi là "môi trường nuôi cấy xác định" vì các thành phần cấu thành của chúng đã được hiểu rõ.

Phương tiện nuôi cấy được định nghĩa hóa học

Các môi trường này bao gồm các thành phần vô cơ và hữu cơ siêu tinh khiết, không bị nhiễm bẩn bởi bất kỳ loại ô nhiễm nào. Chúng cũng có thể bao gồm các protein tinh khiết, như các yếu tố tăng trưởng.

 Sự biến đổi gen của vi khuẩn hoặc nấm men, kết hợp với việc bổ sung các axit béo cụ thể, vitamin, cholesterol và axit amin, dẫn đến việc sản xuất các thành phần của chúng [9].

Phương tiện không chứa protein

Phương tiện không chứa protein là những phương tiện không chứa protein nào cả mà chỉ chứa các thành phần không phải protein. So với các phương tiện có bổ sung huyết thanh, việc sử dụng phương tiện không chứa protein thúc đẩy sự phát triển tế bào và biểu hiện protein nhiều hơn, đồng thời giúp dễ dàng tinh chế sản phẩm được tạo ra trong quá trình xử lý sau [10-12]. Protein không được bao gồm trong các công thức như MEM và RPMI-1640. Tuy nhiên, có thể bổ sung protein nếu cần thiết.

Phương tiện nuôi cấy và các thành phần cơ bản

Môi trường nuôi cấy thương mại có thể được mua dưới dạng bột hoặc dung dịch và thường chứa nhiều loại chất dinh dưỡng như axit amin, glucose, muối, vitamin và các chất bổ sung dinh dưỡng khác.

Các yêu cầu về các thành phần này khác nhau đối với từng dòng tế bào, và sự khác biệt này là nguyên nhân dẫn đến sự đa dạng về công thức của môi trường nuôi cấy. Mỗi thành phần chịu trách nhiệm cho một chức năng cụ thể, sẽ được trình bày chi tiết trong các đoạn sau:

Hệ thống đệm

Để duy trì điều kiện phát triển tối ưu, pH phải được kiểm soát, thường được thực hiện bằng một trong hai hệ thống đệm:

Hệ thống đệm tự nhiên

Tỷ lệ CO2/H2CO3 trong không khí bằng với tỷ lệ trong môi trường, tạo ra cơ chế đệm tự nhiên. Để duy trì cơ chế đệm tự nhiên này, các văn hóa phải được giữ trong môi trường không khí có nồng độ CO2 từ 5-10%, thường được thực hiện bằng cách sử dụng tủ ấm CO2. Một trong những ưu điểm lớn nhất của việc sử dụng đệm tự nhiên là chi phí thấp và an toàn.

HEPES

Đệm hóa học sử dụng zwitterion HEPES có khả năng đệm cao hơn trong khoảng pH 7.2-7.4 và không cần môi trường khí được điều chỉnh. Đối với một số loại tế bào, liều lượng HEPES cao có thể gây hại. Dung dịch chứa HEPES cũng dễ bị ảnh hưởng bởi tác động độc hại của ánh sáng huỳnh quang [13].

Phenol Red

Chất chỉ thị pH phenol red thường được thêm vào môi trường nuôi cấy thương mại, cho phép theo dõi liên tục pH. Khi tế bào phát triển, các chất chuyển hóa do tế bào sản sinh gây ra sự thay đổi pH và do đó làm thay đổi màu của môi trường. Phenol red có tác dụng kép đối với màu của môi trường, chuyển sang màu vàng ở pH axit và màu tím ở pH kiềm. pH 7.4, giá trị tối ưu cho nuôi cấy tế bào, khiến môi trường có màu đỏ huỳnh quang.

Tuy nhiên, phenol red có một số nhược điểm: Thứ nhất, phenol red có thể mô phỏng hoạt động của một số hormone steroid, chủ yếu là estrogen [14]. Do đó, khi nghiên cứu các tế bào nhạy cảm với estrogen như mô vú, nên sử dụng môi trường không chứa phenol red. Sự cân bằng natri-kali bị rối loạn do sự hiện diện của phenol red trong một số công thức không chứa huyết thanh. Thêm huyết thanh hoặc hormone tuyến yên bò vào môi trường có thể khắc phục tác động này [15]. Thứ ba, sự hiện diện của phenol red cản trở việc phát hiện trong các thí nghiệm cytometrie dòng.

Muối vô cơ

Môi trường chứa muối vô cơ, như ion natri, kali và canxi, giúp duy trì cân bằng thẩm thấu và điều chỉnh tiềm năng màng.

Axit amin

Vì axit amin là thành phần cơ bản của protein, chúng là thành phần thiết yếu của mọi môi trường nuôi cấy tế bào đã được phát triển. Do tế bào không thể tự sản xuất một số axit amin, việc môi trường nuôi cấy chứa axit amin thiết yếu là rất quan trọng. Chúng cần thiết cho sự phát triển của tế bào, và nồng độ của chúng quyết định mật độ tế bào tối đa có thể đạt được. Đặc biệt, L-glutamine, một axit amin thiết yếu, đặc biệt quan trọng.

L-glutamine hoạt động như một nguồn năng lượng thứ cấp cho quá trình chuyển hóa và cung cấp nitơ cho sản xuất NAD, NADPH và nucleotide. Do L-glutamine là một axit amin không ổn định, theo thời gian nó chuyển đổi thành dạng mà tế bào không thể sử dụng, nên nó phải được bổ sung vào môi trường.

Ngoài ra, các axit amin không thiết yếu có thể được bổ sung vào môi trường để bù đắp cho những axit amin đã bị tiêu hao trong quá trình phát triển. Việc bổ sung các axit amin không thiết yếu vào môi trường nuôi cấy giúp tăng cường sự phát triển của tế bào và nâng cao khả năng sống sót của chúng.

Carbohydrate

Carbohydrate dưới dạng đường là nguồn năng lượng chính. Nhiều môi trường nuôi cấy cũng bao gồm maltose và fructose ngoài các loại đường phổ biến như glucose và galactose.

Protein và peptit

Albumin, transferrin và fibronectin là các protein và peptit được sử dụng phổ biến nhất. Chúng đặc biệt quan trọng trong các môi trường không chứa huyết thanh. Albumin, transferrin, aprotinin, fetuin và fibronectin là một số protein có thể tìm thấy trong huyết thanh, nguồn cung cấp protein dồi dào.

Albumin là protein chính trong máu, có chức năng liên kết và vận chuyển các chất khác nhau, bao gồm nước, muối, axit béo tự do, hormone và vitamin, giữa các cơ quan và tế bào. Khả năng liên kết với các chất hóa học của albumin khiến nó trở thành ứng cử viên hiệu quả để loại bỏ các hợp chất có hại khỏi môi trường nuôi cấy tế bào.

Aprotinin là chất bảo vệ trong hệ thống nuôi cấy tế bào, vì nó ổn định ở pH trung tính và axit, cũng như chịu được nhiệt độ cao và sự phá hủy có thể gây ra bởi các enzyme protease. Nó có khả năng ức chế một số enzyme protease serine, bao gồm trypsin và các enzyme khác.

Fetuin là một glycoprotein có thể được phát hiện với lượng cao hơn trong huyết thanh của động vật thai nhi và sơ sinh so với huyết thanh của động vật trưởng thành. Ngoài ra, nó còn hoạt động như một chất ức chế protease serine. Protein fibronectin là thành phần thiết yếu trong quá trình bám dính tế bào. Transferrin là protein vận chuyển sắt và chịu trách nhiệm đưa sắt đến màng tế bào.

Axit béo và lipid

Chúng đóng vai trò quan trọng trong môi trường không chứa huyết thanh khi huyết thanh vắng mặt.

Vitamin

Nhiều vitamin là cần thiết cho sự phát triển và phân chia tế bào. Vitamin không thể được sản xuất với lượng đủ bởi tế bào và do đó là thành phần thiết yếu trong nuôi cấy mô như chất bổ sung dinh dưỡng.

Trong nuôi cấy tế bào, huyết thanh là nguồn chính của vitamin; tuy nhiên, môi trường nuôi cấy cũng được bổ sung các vitamin khác nhau để phù hợp với loại tế bào cụ thể. Thông thường, các vitamin nhóm B được sử dụng để kích thích sự phát triển.

Yếu tố vi lượng

Các nguyên tố hóa học như đồng, kẽm, selen và các chất trung gian của axit tricarboxylic được gọi là nguyên tố vi lượng. Nguyên tố vi lượng thường được thêm vào môi trường không chứa huyết thanh để thay thế những nguyên tố thường có trong huyết thanh. Những nguyên tố này là thành phần hóa học quan trọng cần thiết cho sự phát triển khỏe mạnh của tế bào. Nhiều phản ứng sinh hóa phụ thuộc vào các vi chất dinh dưỡng cụ thể, chẳng hạn như hoạt động của enzyme.

Phụ gia môi trường

Môi trường nuôi cấy đầy đủ được đề xuất cho một số dòng tế bào cần các thành phần bổ sung không có trong môi trường cơ bản và huyết thanh. Các chất bổ sung này hỗ trợ sự phát triển của tế bào và chức năng chuyển hóa phù hợp.

Mặc dù hormone, yếu tố tăng trưởng và phân tử tín hiệu là thiết yếu cho sự phát triển thích hợp của một số dòng tế bào, nhưng cần lưu ý các điều sau: Việc bổ sung chất phụ gia có thể làm thay đổi độ thẩm thấu của môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh, điều này có thể ức chế sự phát triển của tế bào. Do đó, luôn nên kiểm tra độ thẩm thấu sau khi bổ sung chất phụ gia. Đối với phần lớn các dòng tế bào, độ thẩm thấu tối ưu nằm trong khoảng 260 đến 320 mOSM/kg.

Kháng sinh

Kháng sinh thường được sử dụng để ức chế sự phát triển của vi khuẩn và nấm [16], mặc dù chúng không cần thiết cho sự phát triển của tế bào. Vì kháng sinh có thể che giấu sự nhiễm khuẩn do mycoplasma và vi khuẩn kháng thuốc, việc sử dụng thường xuyên kháng sinh không được khuyến nghị trong nuôi cấy tế bào [17, 18].

Ngoài ra, kháng sinh có thể làm rối loạn chuyển hóa của các tế bào nhạy cảm. Các kết hợp penicillin-streptomycin do MilliporeSigma và Life Technologies sản xuất thường được sử dụng. Plasmocin đã được sử dụng trong nuôi cấy các dòng tế bào glioma TS603, TS516 và BT260 [19], và đã được chứng minh là hiệu quả trong việc loại bỏ nhiễm khuẩn mycoplasma (20).

Huyết thanh

Albumin, yếu tố tăng trưởng và chất ức chế tăng trưởng đều có trong huyết thanh. Huyết thanh là một trong những thành phần quan trọng nhất của môi trường nuôi cấy tế bào vì nó cung cấp axit amin, protein, vitamin (đặc biệt là vitamin tan trong chất béo như A, D, E và K), carbohydrate, lipid, hormone, yếu tố tăng trưởng, khoáng chất và nguyên tố vi lượng.

Huyết thanh từ nguồn bào thai và bê bò thường được sử dụng để thúc đẩy sự phát triển của tế bào nuôi cấy. Huyết thanh bào thai là nguồn cung cấp dồi dào các yếu tố tăng trưởng và phù hợp cho việc nhân bản tế bào và phát triển các tế bào nhạy cảm. Do khả năng thúc đẩy tăng trưởng giảm, huyết thanh bê được sử dụng trong các thí nghiệm ức chế tiếp xúc. Môi trường nuôi cấy thông thường thường chứa 2% đến 10% huyết thanh. Việc bổ sung huyết thanh vào môi trường nuôi cấy có các mục đích sau [21]:

• Huyết thanh cung cấp các chất dinh dưỡng thiết yếu cho tế bào (cả ở dạng hòa tan và gắn với protein).

• Máu bào thai chứa nhiều yếu tố tăng trưởng và hormone tham gia vào quá trình thúc đẩy tăng trưởng và hoạt động chuyên biệt của tế bào.

• Nó cung cấp nhiều protein liên kết, như albumin và transferrin, giúp vận chuyển các chất khác vào tế bào. Ví dụ, albumin vận chuyển chất béo, vitamin, hormone, v.v. vào tế bào.

• Nó cũng cung cấp các protein như fibronectin, giúp tăng cường sự bám dính của tế bào vào nền. Ngoài ra, nó sản xuất các yếu tố lan rộng giúp tế bào mở rộng trước khi phân chia.

• Nó cung cấp các chất ức chế protease để ngăn chặn quá trình phân giải protein trong tế bào.

• Nó cũng chứa các khoáng chất như Na+, K+, Zn2+ và Fe2+.

• Nó tăng cường độ nhớt của môi trường, từ đó bảo vệ tế bào khỏi tổn thương cơ học trong quá trình khuấy trộn trong nuôi cấy treo.

• Nó cũng là một chất đệm.

Tham khảo

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Dinh dưỡng của tế bào động vật trong nuôi cấy mô; các nghiên cứu ban đầu về môi trường nuôi cấy tổng hợp. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Sự hấp thu nhanh chóng của một thành phần huyết thanh bào thai bò bởi các tế bào động vật có vú trong nuôi cấy. Một nguồn tiềm năng của các hiện tượng giả trong các nghiên cứu về kháng huyết thanh đối với kháng nguyên đặc hiệu tế bào. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Thêm huyết thanh vào môi trường dùng để chuẩn bị hỗn hợp tế bào như một nguồn tiềm năng của các hiện tượng giả trong các phản ứng miễn dịch tế bào được nghiên cứu bằng thử nghiệm hạch bạch huyết popliteal. Tạp chí Di truyền Miễn dịch. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh thương mại: sự phát triển của hybridoma và sản xuất kháng thể đơn dòng. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Phương pháp nuôi cấy tế bào trong môi trường không chứa huyết thanh. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O,   et al. Các protein chaperone HSP70 vận chuyển TDP-43 không chứa RNA vào các vỏ cầu lỏng nội nhân có tính dị hướng. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J,   et al. Sự lão hóa do hội chứng Down gây ra làm rối loạn cấu trúc nhân của các tế bào tiền thân thần kinh. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Thay thế hoàn toàn huyết thanh bằng albumin, transferrin và lipid đậu nành trong nuôi cấy tế bào lympho B phản ứng với lipopolysaccharide. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Cải thiện hệ thống môi trường nuôi cấy không chứa protein được định nghĩa hóa học cho sự phát triển của hybridoma và sản xuất kháng thể đơn dòng. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Một môi trường không chứa protein cho sự phát triển của hybridoma và các tế bào khác của hệ miễn dịch. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Nuôi cấy tế bào không chứa huyết thanh: một phương pháp thống nhất. Tạp chí Tế bào. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Sự phát triển clonal của các dòng tế bào chuột Trung Quốc trong môi trường không chứa protein. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Phân tích tác dụng độc tế bào của môi trường nuôi cấy chứa HEPES khi tiếp xúc với ánh sáng. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Phenol red trong môi trường nuôi cấy mô là một estrogen yếu: ý nghĩa đối với việc nghiên cứu các tế bào nhạy cảm với estrogen trong nuôi cấy. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Phát triển môi trường nuôi cấy không chứa huyết thanh. Trong: Master JRW, biên tập. Nuôi cấy tế bào động vật, ấn bản thứ 3. Oxford: Nhà xuất bản Đại học Oxford; 2000.

[16] Perlman D. Sử dụng kháng sinh trong môi trường nuôi cấy tế bào. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Sự lây lan và kiểm soát nhiễm trùng mycoplasma trong nuôi cấy tế bào. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Thay đổi môi trường và truyền dòng tế bào. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M,   et al. Enzyme demethylase histone KDM6A trực tiếp cảm nhận oxy để điều chỉnh cấu trúc chromatin và số phận tế bào. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M,   et al. Hiệu quả của Plasmocin™ trên các dòng tế bào động vật có vú bị nhiễm mollicutes so với các kháng sinh thông thường trong nuôi cấy tế bào: kinh nghiệm địa phương. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Các khía cạnh phân tử của sự gắn kết của chất liên kết với albumin huyết thanh. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53