Tế bào nguyên phát của người

Tế bào nguyên phát của con người là gì?

Tế bào nguyên phát là đại diện thuần khiết nhất của các mô tương ứng. Chúng được tách ra từ mô và xử lý để có thể phát triển ổn định trong môi trường nuôi cấy với điều kiện lý tưởng. Chúng mô phỏng trạng thái trong cơ thể sống (in vivo) một cách sát thực hơn và thể hiện các đặc tính sinh lý bình thường vì chúng được lấy trực tiếp từ mô chứ không qua quá trình biến đổi. Do đó, chúng có thể đóng vai trò là các mô hình hữu ích cho nghiên cứu về dược lý học tế bào, độc học và sinh lý học (bao gồm các nghiên cứu về chuyển hóa, lão hóa và truyền tín hiệu). Cần lưu ý rằng tế bào nguyên phát khó nuôi cấy và duy trì hơn so với dòng tế bào liên tục vì chúng có tuổi thọ ngắn hơn và sẽ ngừng phân chia (hoặc lão hóa) sau một số lần phân chia nhất định. Các nghiên cứu về các con đường truyền tín hiệu tế bào trở nên phức tạp do tính biến đổi vốn có của các tế bào nguyên phát thu được từ người hiến tặng và qua các phương pháp nuôi cấy thứ cấp. Trước khi bắt đầu các nghiên cứu về truyền tín hiệu, các nhà nghiên cứu thường tiến hành sàng lọc để xác định liệu các tế bào có phản ứng với các kích thích thường được sử dụng hay không. Để tránh lãng phí thời gian và tiền bạc, các tế bào nguyên phát có thể được kích thích để kích hoạt các con đường truyền tín hiệu chính trước khi được sàng lọc.

Tại sao nên sử dụng tế bào nguyên phát của con người?

Các dòng tế bào bất tử thường được sử dụng làm mẫu thử tế bào. Mặc dù các nhà khoa học đã thừa nhận rằng những thay đổi sinh học do các dòng tế bào gây ra có thể gây hại khi nghiên cứu ý nghĩa sinh lý của chúng. Việc sử dụng tế bào nguyên phát của người giúp nâng cao giá trị sinh lý của dữ liệu thu được từ nuôi cấy tế bào, và chúng ngày càng được coi là quan trọng trong việc nghiên cứu các quá trình sinh học, tiến triển bệnh tật và phát triển thuốc.

Tế bào nguyên phát của người được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu in vitro về giao tiếp giữa các tế bào và nội bào, sinh học phát triển, cũng như các cơ chế cơ bản của ung thư, bệnh Parkinson và tiểu đường, cùng nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học tiền lâm sàng và điều tra khác. Các nhà nghiên cứu từ lâu đã sử dụng các dòng tế bào bất tử để nghiên cứu chức năng mô; tuy nhiên, các dòng tế bào có đột biến rõ ràng và bất thường nhiễm sắc thể có thể không phải là vật thay thế tốt cho các tế bào bình thường và sự phát triển của bệnh ở giai đoạn đầu. Hiện nay, có thể tạo ra một mô hình chính xác hơn về một loại tế bào mô cụ thể bằng cách sử dụng các tế bào nguyên phát của con người được phân lập từ mô đó và duy trì trong môi trường nuôi cấy tế bào nguyên phát và các chất bổ sung.

Nuôi cấy tế bào nguyên phát là gì?

Thay vì sử dụng các dòng tế bào bất tử, nuôi cấy tế bào nguyên phát liên quan đến việc nuôi cấy tế bào trực tiếp từ một sinh vật đa bào bên ngoài cơ thể. Ở một số quốc gia, chẳng hạn như Vương quốc Anh, đã có sự công nhận pháp lý về thực tế rằng nuôi cấy tế bào nguyên phát đại diện cho mô trong cơ thể tốt hơn so với các dòng tế bào. Tuy nhiên, tế bào nguyên phát cần chất nền và chất dinh dưỡng phù hợp để phát triển, và sau một số lần phân chia nhất định, chúng sẽ phát triển kiểu hình lão hóa khiến chúng ngừng phân chia vĩnh viễn. Hai yếu tố này thúc đẩy việc tạo ra các dòng tế bào. Cả tế bào nguyên phát được bất tử hóa tự nhiên (ví dụ: tế bào HeLa) và tế bào nguyên phát được bất tử hóa nhân tạo (ví dụ: tế bào HEK) đều có thể được nuôi cấy vô thời hạn trong môi trường nuôi cấy tế bào.

Các loại tế bào nguyên phát của con người theo loại mô

Các tế bào biểu mô, tế bào sợi, tế bào sừng, tế bào hắc tố, tế bào nội mô, tế bào cơ, tế bào miễn dịch và các tế bào gốc như tế bào gốc trung mô là những loại tế bào nguyên phát của người được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu khoa học. Ban đầu, các dòng nuôi cấy này là hỗn hợp (đại diện cho sự kết hợp của các loại tế bào có trong mô), và chúng chỉ có thể được duy trì sự sống trong ống nghiệm trong một khoảng thời gian nhất định. Quá trình biến đổi là một quy trình trong ống nghiệm cho phép các tế bào nguyên phát của người được thao tác để tạo ra các dòng nuôi cấy thứ cấp bất tử vô hạn. Quá trình biến đổi có thể diễn ra tự nhiên hoặc được kích thích bởi hóa chất hoặc vi-rút. Sau khi trải qua quá trình biến đổi gen, một nuôi cấy nguyên phát có thể phân chia vô hạn thành một dòng tế bào thứ cấp bất tử nếu được cung cấp đủ chất dinh dưỡng và không gian.

Tế bào nội mô

Điều trị ung thư, chữa lành vết thương, nghiên cứu tín hiệu tế bào, sàng lọc thông lượng cao và nội dung cao, cũng như sàng lọc độc tính là một số lĩnh vực có thể hưởng lợi từ việc sử dụng tế bào nội mô nguyên phát làm công cụ nghiên cứu.

Tế bào sừng

Tế bào sừng, có nguồn gốc từ lớp biểu bì của da người trưởng thành hoặc bao quy đầu của trẻ sơ sinh, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các bệnh về da như bệnh vẩy nến và ung thư.

Tế bào biểu mô

Từ các nghiên cứu về ung thư đến các cuộc điều tra độc tính, tế bào biểu mô nguyên phát đã chứng tỏ là nguồn tài nguyên vô giá để mô phỏng các cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể.

Tế bào sợi

Tạo ra tế bào gốc đa năng cảm ứng (iPS) và nghiên cứu quá trình lành vết thương chỉ là một vài trong số rất nhiều ứng dụng của các tế bào sợi nguyên phát.

Tế bào miễn dịch

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) là các tế bào đơn nhân trong máu có nhân tròn. Chúng chủ yếu bao gồm lympho bào và bạch cầu đơn nhân, đóng vai trò quan trọng trong quá trình đáp ứng miễn dịch. Tế bào đơn nhân máu ngoại vi thường được sử dụng để chẩn đoán nhiễm trùng hoặc phát hiện khả năng bảo vệ của vắc-xin. Hiểu biết sâu sắc về phản ứng miễn dịch tế bào do tế bào T trung gian thường rất quan trọng.

Tế bào hắc tố

Tế bào hắc tố, là các tế bào da chuyên biệt sản xuất sắc tố melanin, rất hữu ích làm mô hình cho các nghiên cứu về các chủ đề như chữa lành vết thương, độc tính, u ác tính, phản ứng của da với bức xạ cực tím (UV), các bệnh về da và mỹ phẩm.

Tế bào gốc

Tế bào gốc có khả năng biệt hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Nhờ khả năng biệt hóa này, chúng mang lại những cơ hội mới để mô phỏng mô người và các tình trạng sức khỏe.

Tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô, còn được gọi là MSC, có thể được thu thập từ các nguồn khác nhau của con người như tủy xương, mô mỡ (tissue adipose), mô dây rốn (Wharton's Jelly) và dịch ối (dịch bao quanh thai nhi) và có thể được nhân lên trong ống nghiệm. Các tế bào gốc mô đệm trưởng thành này có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau. Một số loại tế bào này bao gồm tế bào xương, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào thần kinh, tế bào da và tế bào giác mạc.

Tế bào cơ trơn

Trong các cơ quan rỗng, các tế bào cơ trơn nguyên phát (SMC) lót bên trong và điều hòa khả năng co bóp. Ngoài ung thư và các bệnh khác, SMC có thể được sử dụng để mô hình hóa xơ hóa do tăng huyết áp.

Tế bào nguyên phát và dòng tế bào

Dù là do đột biến tự phát, như trong các dòng tế bào ung thư biến đổi, hay thông qua sự thay đổi có chủ đích, như trong việc sản xuất nhân tạo các gen ung thư, các dòng tế bào liên tục đã có khả năng nhân lên vô hạn (bất tử). Theo quy luật, các dòng tế bào liên tục đáng tin cậy và thuận tiện hơn so với tế bào nguyên phát. Chúng có thể nhân lên vô hạn và cung cấp dữ liệu cần thiết một cách nhanh chóng. Việc sử dụng các dòng tế bào liên tục có những hạn chế nhất định, bao gồm việc chúng bị biến đổi gen, điều này có thể làm thay đổi các đặc điểm sinh lý và không phù hợp với điều kiện in vivo, và điều này có thể tiếp tục thay đổi theo thời gian khi trải qua nhiều lần nhân giống.

Những tiến bộ trong nuôi cấy tế bào nguyên phát

Tế bào nguyên phát vốn nổi tiếng là khó xử lý. Tuy nhiên, quá trình này đang trở nên dễ dàng hơn bao giờ hết nhờ những tiến bộ trong nuôi cấy tế bào nguyên phát, sự sẵn có của các dòng tế bào nguyên phát thương mại với các quy trình được tối ưu hóa hoàn toàn, cùng các kỹ thuật phân tích mới đòi hỏi ít công sức hơn.

Sự chuyển đổi từ nuôi cấy tế bào hai chiều sang ba chiều được coi là một cột mốc quan trọng trong lĩnh vực này. Cấu trúc đặc trưng của mô, tương tác giữa các tế bào, cũng như các tín hiệu cơ học và sinh hóa có thể bị suy giảm trong môi trường nuôi cấy 2D. Do đó, giá trị sinh học của các mô hình nuôi cấy này có giới hạn nhất định.

Mặt khác, nuôi cấy tế bào 3D cho phép tế bào phát triển và tương tác với khung ngoại bào 3D. Điều này giúp tế bào tương tác với nhau và với ma trận ngoại bào, khiến các mô hình nuôi cấy 3D trở nên phù hợp hơn với điều kiện sinh lý thực tế. Độ chính xác của phương pháp này trong việc dự đoán các phản ứng in vivo đã khiến nó trở thành một cuộc cách mạng trong các lĩnh vực như phát hiện và phát triển thuốc. Do đó, các công nghệ tiên tiến, như các cơ quan nhân tạo có nguồn gốc từ bệnh nhân và các cơ quan trên chip, cung cấp các mô hình có tính bối cảnh cao cho việc sàng lọc và phát triển thuốc.

Việc tạo tế bào nguyên phát là một trở ngại trong nuôi cấy nguyên phát. Thông thường, cần một khối lượng mô lớn hơn để khắc phục điều này, nhưng việc này có thể khó thực hiện. Tuy nhiên, độ nhạy phân tích được cải thiện đang mở ra một con đường mới. Ví dụ, nhu cầu nuôi cấy số lượng lớn tế bào nguyên phát được giảm bớt nhờ sử dụng công nghệ tế bào đơn lẻ, bao gồm giải trình tự, phương pháp Western blotting và đo lưu lượng tế bào khối lượng.

Triển vọng đầy hứa hẹn cho nuôi cấy tế bào nguyên phát

Những khó khăn chung trong nuôi cấy tế bào nguyên phát đang được giảm bớt nhờ những tiến bộ công nghệ. Đổi lại, phương pháp này đang nhanh chóng thay thế các phương pháp khác để trở thành tiêu chuẩn vàng trong nghiên cứu và thực hành sinh học tế bào và phân tử. Sản xuất vắc-xin, thay thế nội tạng, liệu pháp tế bào gốc, nghiên cứu ung thư và nhiều lĩnh vực khác sẽ được hưởng lợi rất nhiều từ những tiến bộ liên tục trong nuôi cấy tế bào nguyên phát.

Mẹo và thủ thuật nuôi cấy tế bào nguyên phát

Nhu cầu mở rộng tế bào

Hai phương pháp phổ biến nhất để nuôi cấy tế bào nguyên phát là nuôi cấy trong môi trường lơ lửng hoặc trên bề mặt (2D). Một số tế bào có thể nổi tự do trong dòng máu mà không bao giờ bám dính vào bề mặt (ví dụ như các tế bào có nguồn gốc từ máu ngoại vi). Các dòng tế bào khác nhau đã được thiết kế để phát triển mạnh trong môi trường nuôi cấy lơ lửng, nơi chúng có thể đạt được mật độ không thể đạt được trong điều kiện nuôi cấy 2D. Các tế bào nguyên phát cần bám dính để phát triển trong ống nghiệm được gọi là tế bào bám dính và bao gồm các tế bào có trong các mô rắn. Để cải thiện tính bám dính và cung cấp các tín hiệu cần thiết cho sự phát triển và biệt hóa, các tế bào này thường được nuôi cấy trong bình nhựa phẳng không tráng phủ, nhưng đôi khi cũng sử dụng vi chất mang. Lựa chọn sau này có thể được tráng phủ bằng các protein ma trận ngoại bào (như collagen và laminin). Môi trường nuôi cấy tế bào bao gồm một môi trường cơ bản được bổ sung các yếu tố tăng trưởng và cytokine phù hợp. Tủ ủ tế bào là một loại tủ ủ phòng thí nghiệm chuyên dụng được sử dụng để nuôi cấy và duy trì tế bào ở nhiệt độ và hỗn hợp khí cụ thể (thường là 37 °C, 5% CO₂ đối với tế bào động vật có vú). Tùy thuộc vào loại tế bào được nuôi cấy, các điều kiện tối ưu có thể rất khác nhau. Tùy thuộc vào loại tế bào được nuôi cấy, môi trường sinh trưởng tối ưu sẽ có sự kết hợp độc đáo của các yếu tố, bao gồm nhưng không giới hạn ở pH, nồng độ glucose, các yếu tố tăng trưởng và sự hiện diện của các chất dinh dưỡng khác.

Kháng sinh trong môi trường nuôi cấy rất quan trọng trong giai đoạn thiết lập nuôi cấy ban đầu để ngăn ngừa nhiễm khuẩn từ mô chủ. Một số phác đồ kháng sinh bao gồm sự kết hợp của gentamicin, penicillin, streptomycin và amphotericin B. Tuy nhiên, không nên sử dụng kháng sinh trong thời gian dài vì một số chất (như amphotericin B) có thể gây độc cho tế bào về lâu dài.

Hầu hết các tế bào nguyên phát đều trải qua quá trình lão hóa và ngừng phân chia sau một số lần nhân đôi dân số nhất định, do đó việc duy trì sự sống của chúng sau khi tách chiết là vô cùng quan trọng. Sự sống còn lâu dài của tế bào đòi hỏi kỹ thuật nuôi cấy chuyên sâu và điều kiện nuôi cấy lý tưởng (bao gồm môi trường phù hợp, nhiệt độ phù hợp, hỗn hợp khí phù hợp, độ pH phù hợp, nồng độ yếu tố tăng trưởng phù hợp, sự hiện diện của chất dinh dưỡng và glucose). Vì nhiều yếu tố tăng trưởng được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy được lấy từ máu động vật (các thành phần có nguồn gốc từ máu có khả năng gây nhiễm bẩn), nên hạn chế tối đa hoặc tránh hoàn toàn việc sử dụng chúng. Việc áp dụng kỹ thuật vô trùng cũng rất quan trọng.

Trồng lại và duy trì

Khi các tế bào được phân lập bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, điều này đánh dấu sự bắt đầu của giai đoạn duy trì. Quá trình bám dính thường xảy ra 24 giờ sau khi bắt đầu nuôi cấy. Tế bào nên được nuôi cấy lại khi đạt đến một tỷ lệ phủ bề mặt nhất định và đang nhân lên tích cực. Do tế bào sau khi đạt tỷ lệ phủ bề mặt tối đa có thể trải qua quá trình biệt hóa và tăng sinh chậm hơn sau mỗi lần nuôi cấy, nên tốt nhất là nuôi cấy lại các dòng tế bào nguyên phát trước khi chúng đạt 100% tỷ lệ phủ bề mặt.

Việc nuôi cấy lại trong môi trường mới giúp duy trì sự tăng trưởng theo cấp số nhân của các tế bào phụ thuộc vào bề mặt bám dính. Việc nuôi cấy lại các lớp đơn làm gián đoạn các tương tác bề mặt tế bào giữa các tế bào và trong tế bào. Các enzym phân giải protein ở nồng độ thấp, chẳng hạn như trypsin/EDTA, được sử dụng để tách các tế bào nguyên phát bám dính khỏi lớp tế bào đơn lớp hoặc mô. Sau khi được tách rời và pha loãng thành dung dịch tế bào đơn lẻ, các tế bào được đếm và chuyển sang các bình nuôi cấy mới để bám dính lại và nhân lên.

Bảo quản lạnh và phục hồi

Bảo quản đông lạnh giúp bảo tồn tế bào sống bằng cách đông lạnh chúng ở nhiệt độ thấp. Việc bảo quản đông lạnh và rã đông tế bào nguyên phát của người giúp ngăn ngừa tế bào chết và tổn thương trong quá trình lưu trữ và sử dụng. Tế bào nguyên phát của người được bảo vệ bằng DMSO hoặc glycerol (ở nhiệt độ thích hợp và với tốc độ đông lạnh được kiểm soát). Quá trình đông lạnh phải diễn ra từ từ, với tốc độ giảm 1 °C mỗi phút, để ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng. Bảo quản lâu dài yêu cầu sử dụng nitơ lỏng (-196 °C) hoặc nhiệt độ dưới -130 °C.

Chỉ cần ngâm các tế bào đông lạnh trong bể nước 37 °C khoảng 1 đến 2 phút là đủ để rã đông các tế bào được bảo quản bằng phương pháp đông lạnh. Không nên ly tâm các tế bào nguyên phát của người sau khi rã đông khỏi tủ đông (vì chúng cực kỳ nhạy cảm với tổn thương trong quá trình phục hồi sau bảo quản bằng phương pháp đông lạnh). Phương pháp này thích hợp để cấy tế bào ngay sau khi rã đông và giúp thúc đẩy sự bám dính trong môi trường nuôi cấy trong 24 giờ đầu tiên sau khi cấy. 1 Sau khi các tế bào nguyên phát được bảo quản lạnh đã bám dính, phải loại bỏ môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng (vì DMSO có hại cho tế bào nguyên phát và có thể gây giảm khả năng sống sót sau khi rã đông).