Tế bào nguyên phát của người

Tế bào nguyên phát của con người là gì?

Tế bào nguyên thủy là đại diện thuần khiết nhất của các mô tương ứng. Chúng được tách ra từ mô và xử lý để có thể phát triển trong môi trường nuôi cấy với điều kiện lý tưởng. Chúng mô phỏng gần hơn trạng thái trong cơ thể sống và thể hiện sinh lý bình thường vì chúng được lấy từ mô chứ không phải được biến đổi. Do đó, chúng có thể được sử dụng làm mô hình hữu ích cho nghiên cứu về dược lý tế bào, độc học và sinh lý học (bao gồm các nghiên cứu về chuyển hóa, lão hóa và truyền tín hiệu). Lưu ý rằng tế bào nguyên thủy khó nuôi cấy và duy trì hơn so với dòng tế bào liên tục vì chúng có tuổi thọ ngắn hơn và sẽ ngừng phân chia (hoặc lão hóa) sau một số lần phân chia nhất định. Các nghiên cứu về con đường tín hiệu tế bào bị phức tạp hóa bởi sự biến đổi tự nhiên của tế bào nguyên phát thu được từ người hiến tặng và qua các thực hành nuôi cấy con. Trước khi bắt đầu các nghiên cứu tín hiệu, các nhà nghiên cứu thường tiến hành sàng lọc để xác định liệu tế bào có phản ứng với các kích thích thông thường hay không. Để tránh lãng phí thời gian và tiền bạc, tế bào nguyên phát có thể được kích thích để hoạt hóa các con đường tín hiệu chính trước khi sàng lọc.

Tại sao sử dụng tế bào nguyên phát của con người?

Dòng tế bào bất tử thường được sử dụng làm mẫu thử tế bào. Mặc dù các nhà khoa học đã thừa nhận rằng các thay đổi sinh học do dòng tế bào gây ra có thể có hại trong việc nghiên cứu ý nghĩa sinh lý của chúng. Việc sử dụng tế bào nguyên phát của con người cải thiện giá trị sinh lý của dữ liệu thu được qua nuôi cấy tế bào, và chúng ngày càng được coi là quan trọng trong việc nghiên cứu các quá trình sinh học, tiến triển bệnh tật và phát triển thuốc.

Tế bào nguyên phát của con người được sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu in vitro về giao tiếp giữa các tế bào và trong tế bào, sinh học phát triển, và các cơ chế cơ bản của ung thư, bệnh Parkinson và tiểu đường, cùng nhiều lĩnh vực nghiên cứu sinh học tiền lâm sàng và điều tra khác. Các nhà nghiên cứu đã lâu sử dụng các dòng tế bào bất tử để nghiên cứu chức năng mô; tuy nhiên, các dòng tế bào có đột biến rõ ràng và bất thường nhiễm sắc thể có thể không phải là đại diện tốt cho các tế bào bình thường và sự phát triển của bệnh ở giai đoạn sớm. Một mô hình chính xác hơn của một loại tế bào mô cụ thể hiện có thể đạt được bằng cách sử dụng các tế bào nguyên thủy của con người được tách ra từ mô đó và duy trì trong môi trường nuôi cấy tế bào nguyên thủy và các chất bổ sung.

Văn hóa tế bào nguyên phát là gì?

Thay vì sử dụng các dòng tế bào bất tử, nuôi cấy tế bào nguyên phát liên quan đến việc nuôi cấy tế bào trực tiếp từ một cơ thể đa bào bên ngoài cơ thể. Ở một số quốc gia, như Vương quốc Anh, có sự công nhận pháp lý về việc nuôi cấy tế bào nguyên phát đại diện cho mô trong cơ thể hơn so với các dòng tế bào. Tuy nhiên, tế bào nguyên thủy cần chất nền và dinh dưỡng phù hợp để phát triển, và sau một số lần phân chia nhất định, chúng phát triển biểu hiện lão hóa khiến chúng ngừng phân chia vĩnh viễn. Hai yếu tố này thúc đẩy việc tạo ra dòng tế bào. Cả tế bào nguyên thủy bất tử tự nhiên (ví dụ: tế bào HeLa) và tế bào nguyên thủy bất tử nhân tạo (ví dụ: tế bào HEK) đều có thể được nuôi cấy vô thời hạn trong môi trường nuôi cấy tế bào.

Tế bào nguyên phát của con người theo loại mô

Các tế bào biểu mô, tế bào sợi, tế bào keratin, tế bào melanin, tế bào nội mô, tế bào cơ, tế bào miễn dịch và các tế bào gốc như tế bào gốc trung mô là những loại tế bào nguyên phát của con người được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu khoa học. Ban đầu, các văn hóa này là hỗn hợp (đại diện cho sự kết hợp của các loại tế bào có trong mô) và chỉ có thể duy trì sự sống trong ống nghiệm trong một khoảng thời gian nhất định. Biến đổi là quá trình in vitro cho phép tế bào nguyên thủy của con người được thao tác để tạo ra các dòng tế bào con vô hạn. Biến đổi có thể xảy ra tự nhiên hoặc được gây ra bởi hóa chất hoặc virus. Sau khi trải qua biến đổi di truyền, một dòng tế bào nguyên thủy có thể phân chia vô hạn thành một dòng tế bào con bất tử nếu được cung cấp đủ dinh dưỡng và không gian.

Tế bào nội mô

Điều trị ung thư, lành vết thương, nghiên cứu tín hiệu tế bào, sàng lọc cao thông lượng và cao nội dung, và sàng lọc độc tính là một số lĩnh vực có thể hưởng lợi từ việc sử dụng tế bào nội mô nguyên phát như một công cụ nghiên cứu.

Tế bào keratinocyte

Tế bào keratinocyte, được lấy từ biểu bì của da người trưởng thành hoặc da bao quy đầu của trẻ sơ sinh, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu các bệnh da liễu như vảy nến và ung thư.

Tế bào biểu mô

Từ nghiên cứu ung thư đến các cuộc điều tra độc học, tế bào biểu mô nguyên phát đã chứng minh là nguồn tài nguyên vô giá trong việc mô phỏng các cơ chế phòng vệ tự nhiên của cơ thể.

Tế bào sợi

Kích thích tế bào gốc đa năng (iPS) và nghiên cứu quá trình lành vết thương chỉ là một số trong nhiều ứng dụng của tế bào sợi nguyên phát.

Tế bào miễn dịch

Tế bào đơn nhân máu ngoại vi (PBMC) là các tế bào đơn nhân trong máu có nhân tròn. Chúng chủ yếu bao gồm lympho bào và đơn nhân, đóng vai trò quan trọng trong quá trình phản ứng miễn dịch. Tế bào đơn nhân máu ngoại vi thường được sử dụng để chẩn đoán nhiễm trùng hoặc phát hiện khả năng bảo vệ của vaccine. Hiểu biết về phản ứng miễn dịch tế bào do tế bào T trung gian thường là yếu tố quan trọng.

Tế bào melanocyte

Tế bào melanocyte, các tế bào da chuyên biệt sản xuất sắc tố melanin, là mô hình hữu ích cho nghiên cứu về các chủ đề như lành vết thương, độc tính, ung thư hắc tố, phản ứng của da với tia cực tím (UV), bệnh da và mỹ phẩm.

Tế bào gốc

Tế bào gốc có tiềm năng phân hóa thành nhiều loại tế bào khác nhau. Nhờ khả năng phân hóa này, chúng mang lại những cơ hội mới trong việc mô phỏng mô người và các điều kiện sức khỏe.

Tế bào gốc trung mô

Tế bào gốc trung mô, còn được gọi là MSCs, có thể được thu thập từ các nguồn khác nhau của con người như tủy xương, mô mỡ (tổ chức mỡ), mô dây rốn (Wharton's Jelly) và dịch ối (dịch bao quanh thai nhi) và có thể được nhân lên trong ống nghiệm. Các tế bào gốc trung mô trưởng thành này có khả năng phát triển thành nhiều loại tế bào khác nhau. Một số loại tế bào này bao gồm tế bào xương, tế bào sụn, tế bào cơ, tế bào thần kinh, tế bào da và tế bào giác mạc.

Tế bào cơ trơn

Trong các cơ quan rỗng, các tế bào cơ trơn nguyên phát (SMCs) lót bên trong và điều hòa khả năng co bóp. Ngoài ung thư và các bệnh khác, SMCs có thể được sử dụng để mô phỏng xơ hóa do tăng huyết áp.

Tế bào nguyên phát và dòng tế bào

Các dòng tế bào liên tục có thể đạt được khả năng sinh sản vô hạn (bất tử) thông qua đột biến tự phát, như trong các dòng tế bào ung thư biến đổi, hoặc thông qua sự thay đổi có chủ đích, như trong việc sản xuất nhân tạo các gen ung thư. Thông thường, dòng tế bào liên tục đáng tin cậy và thuận tiện hơn để sử dụng so với tế bào nguyên thủy. Chúng có thể mở rộng vô hạn và cung cấp truy cập nhanh chóng đến dữ liệu quan trọng. Việc sử dụng dòng tế bào liên tục có một số hạn chế, bao gồm việc chúng được biến đổi gen/biến đổi, có thể thay đổi các đặc điểm sinh lý và không phù hợp với điều kiện trong cơ thể, và điều này có thể tiếp tục thay đổi theo thời gian với số lần truyền tế bào đáng kể.

Các tiến bộ trong nuôi cấy tế bào nguyên thủy

Tế bào nguyên phát nổi tiếng là khó làm việc. Tuy nhiên, quá trình này đang trở nên dễ dàng hơn bao giờ hết nhờ các tiến bộ trong nuôi cấy tế bào nguyên phát, sự sẵn có của tế bào nguyên phát thương mại với các quy trình tối ưu hóa hoàn toàn, và các kỹ thuật phân tích mới yêu cầu ít đầu vào hơn.

Sự chuyển đổi từ nuôi cấy tế bào hai chiều sang ba chiều được coi là một cột mốc quan trọng trong lĩnh vực này. Cấu trúc đặc trưng của mô, tương tác giữa các tế bào và tín hiệu cơ học/sinh hóa có thể bị suy giảm trong nuôi cấy hai chiều. Do đó, giá trị sinh học của các nuôi cấy này có giới hạn.

Mặt khác, nuôi cấy tế bào 3D cho phép tế bào phát triển và tương tác với khung ngoại bào 3D. Điều này cho phép tế bào tương tác với nhau và với ma trận ngoại bào, khiến các mô hình nuôi cấy 3D trở nên tương tự với điều kiện sinh lý hơn. Độ chính xác của phương pháp này trong việc dự đoán phản ứng trong cơ thể đã làm cho nó trở thành một bước đột phá trong các lĩnh vực như phát hiện và phát triển thuốc. Do đó, các công nghệ tiên tiến như organoids được tạo ra từ bệnh nhân và các mô hình "cơ quan trên chip" cung cấp các mô hình có bối cảnh cao cho việc sàng lọc và phát triển thuốc.

Sản xuất tế bào nguyên phát là một nút thắt cổ chai trong nuôi cấy nguyên phát. Thường cần một lượng mô lớn hơn để vượt qua điều này, điều này có thể khó đạt được. Tuy nhiên, độ nhạy phân tích được cải thiện đang mở ra một hướng đi mới. Ví dụ, nhu cầu nuôi cấy lượng lớn tế bào nguyên phát được giảm bớt bằng cách sử dụng công nghệ tế bào đơn, bao gồm giải trình tự, western blotting và mass cytometry.

Triển vọng đầy hứa hẹn cho nuôi cấy tế bào nguyên phát

Các khó khăn chung trong nuôi cấy tế bào nguyên thủy đang được giảm bớt nhờ các tiến bộ công nghệ. Đổi lại, phương pháp này đang nhanh chóng thay thế các phương pháp khác trở thành tiêu chuẩn vàng trong nghiên cứu và thực hành sinh học tế bào và phân tử. Sản xuất vắc-xin, thay thế cơ quan, liệu pháp tế bào gốc, nghiên cứu ung thư và nhiều lĩnh vực khác sẽ được hưởng lợi lớn từ những tiến bộ tiếp theo trong nuôi cấy tế bào nguyên thủy.

Mẹo và thủ thuật trong nuôi cấy tế bào nguyên thủy

Nhu cầu mở rộng tế bào

Hai phương pháp phổ biến nhất để nuôi cấy tế bào nguyên phát là trong môi trường lơ lửng hoặc trên bề mặt (2D). Một số tế bào có thể lơ lửng tự do trong máu mà không bao giờ bám dính vào bề mặt (ví dụ như những tế bào được lấy từ máu ngoại vi). Các dòng tế bào khác đã được thiết kế để phát triển tốt trong môi trường lơ lửng, nơi chúng có thể đạt mật độ không thể đạt được trong điều kiện nuôi cấy 2D. Các tế bào nguyên thủy cần bám dính để phát triển trong ống nghiệm được gọi là tế bào bám dính, bao gồm các tế bào có trong mô rắn. Để cải thiện tính bám dính và cung cấp các tín hiệu cần thiết cho sự phát triển và biệt hóa, các tế bào này thường được nuôi cấy trong một bình nhựa phẳng không tráng phủ, nhưng đôi khi sử dụng micro-carrier. Lựa chọn sau có thể được tráng phủ bằng các protein ma trận ngoại bào (như collagen và laminin). Dung dịch nuôi cấy tế bào bao gồm một dung dịch cơ bản được bổ sung các yếu tố tăng trưởng và cytokine phù hợp. Máy ủ tế bào là một loại máy ủ phòng thí nghiệm đặc biệt được sử dụng để nuôi cấy và duy trì tế bào ở nhiệt độ và hỗn hợp khí cụ thể (thường là 37 °C, 5% CO₂ cho tế bào động vật có vú). Tùy thuộc vào loại tế bào được nuôi cấy, điều kiện tối ưu có thể rất khác nhau. Tùy thuộc vào loại tế bào được nuôi cấy, môi trường nuôi cấy tối ưu sẽ có sự kết hợp độc đáo của các yếu tố, bao gồm nhưng không giới hạn ở pH, nồng độ glucose, yếu tố tăng trưởng và sự hiện diện của các chất dinh dưỡng khác.

Kháng sinh trong môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng trong giai đoạn thiết lập nuôi cấy ban đầu để ngăn ngừa nhiễm khuẩn từ mô chủ. Một số phác đồ kháng sinh bao gồm sự kết hợp của gentamicin, penicillin, streptomycin và amphotericin B. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thời gian dài không được khuyến khích vì một số chất (như amphotericin B) có thể độc hại cho tế bào trong thời gian dài.

Hầu hết các tế bào nguyên phát sẽ trải qua quá trình lão hóa và ngừng phân chia sau một số lần nhân đôi dân số nhất định, do đó việc duy trì sự sống của chúng sau khi tách biệt là vô cùng quan trọng. Sự sống còn lâu dài của tế bào đòi hỏi kỹ thuật nuôi cấy tế bào chuyên nghiệp và điều kiện nuôi cấy lý tưởng (bao gồm môi trường phù hợp, nhiệt độ phù hợp, hỗn hợp khí phù hợp, pH phù hợp, nồng độ yếu tố tăng trưởng phù hợp, sự hiện diện của các chất dinh dưỡng và sự hiện diện của glucose). Vì nhiều yếu tố tăng trưởng được sử dụng để bổ sung vào môi trường nuôi cấy được chiết xuất từ máu động vật (các thành phần từ máu có tiềm năng gây nhiễm khuẩn), nên việc sử dụng chúng nên được hạn chế hoặc tránh hoàn toàn. Việc sử dụng kỹ thuật vô trùng cũng rất quan trọng.

Văn hóa lại và duy trì

Khi các tế bào trong môi trường nuôi cấy bám dính vào bề mặt đĩa nuôi cấy, điều này đánh dấu sự bắt đầu của giai đoạn duy trì. Quá trình bám dính thường xảy ra sau 24 giờ kể từ khi bắt đầu nuôi cấy. Các tế bào nên được nuôi cấy lại khi đạt đến một tỷ lệ bám dính nhất định và đang tích cực nhân lên. Do các tế bào sau khi đạt mật độ tối đa có thể trải qua quá trình biệt hóa và có tốc độ nhân lên chậm hơn sau khi nuôi cấy lại, tốt nhất nên nuôi cấy lại các tế bào nguyên phát trước khi chúng đạt 100% mật độ.

Việc nuôi cấy lại trong môi trường tươi mới duy trì sự tăng trưởng theo cấp số nhân của các tế bào phụ thuộc vào bề mặt. Việc nuôi cấy lại các lớp tế bào đơn lớp làm gián đoạn các tương tác giữa các tế bào và trên bề mặt tế bào. Các enzyme phân giải protein nồng độ thấp, như trypsin/EDTA, được sử dụng để tách các tế bào nguyên phát bám dính khỏi các lớp tế bào đơn lớp hoặc mô. Sau khi được tách rời và pha loãng thành dung dịch tế bào đơn, các tế bào được đếm và chuyển sang các bình nuôi cấy mới để bám dính lại và nhân lên.

Bảo quản đông lạnh và phục hồi

Bảo quản đông lạnh bảo quản tế bào sống bằng cách đông lạnh chúng ở nhiệt độ thấp. Bảo quản đông lạnh và rã đông tế bào nguyên phát của người ngăn ngừa tế bào chết và hư hỏng trong quá trình lưu trữ và sử dụng. Tế bào nguyên phát của người được bảo vệ đông lạnh bằng DMSO hoặc glycerol (ở nhiệt độ đúng và với tốc độ đông lạnh được kiểm soát). Quá trình đông lạnh phải diễn ra dần dần, -1 °C mỗi phút, để ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng. Lưu trữ lâu dài yêu cầu nitơ lỏng (-196 °C) hoặc nhiệt độ dưới -130 °C.

Ngâm các tế bào đông lạnh trong bể nước 37 °C khoảng 1 đến 2 phút là đủ để rã đông các tế bào được bảo quản đông lạnh. Các tế bào nguyên phát của con người không nên được ly tâm sau khi rã đông khỏi tủ đông (vì chúng cực kỳ nhạy cảm với tổn thương trong quá trình phục hồi sau bảo quản đông lạnh). Có thể cấy tế bào ngay sau khi rã đông, và điều này thúc đẩy quá trình bám dính trong nuôi cấy trong 24 giờ đầu tiên sau khi cấy. 1 Sau khi tế bào nguyên phát đông lạnh đã bám dính, môi trường nuôi cấy đã sử dụng phải được loại bỏ (vì DMSO có hại cho tế bào nguyên phát và có thể gây giảm độ sống sau khi rã đông).