Šūnu kultūras barotnes: pārskats

Dabaszinātņu jomā viena no svarīgākajām metodēm ir šūnu kultivēšana. Ar terminu „šūnu kultivēšana” saprot šūnu, audu vai orgānu izņemšanu no dzīvnieka vai auga un to turpmāku implantēšanu mākslīgā vidē, kas ir labvēlīga to izdzīvošanai un/vai augšanai. Optimālai šūnu attīstībai nepieciešamās pamatvides prasības ir kontrolēta temperatūra, substrāts šūnu piestiprināšanai, atbilstoša augšanas vide un inkubators, kas uztur optimālu pH līmeni un osmolalitāti. Lai šūnas varētu pilnībā attīstīties, tām ir jānodrošina šie apstākļi.

Atbilstošas augšanas vides izvēle in vitro kultivēšanai ir šis šūnu kultūras posms, kas ir gan vissvarīgākais, gan izšķirošais. Augšanas vide, ko dēvē arī par kultūras vidi, ir šķidrums vai gēls, kas izstrādāts, lai veicinātu organismu attīstību mikroskopiskā, šūnu vai augu līmenī. Šūnu kultivēšanai izmantotā vide bieži satur pietiekamu enerģijas daudzumu un vielas, kas regulē šūnu ciklu. Kultūras vides galvenās sastāvdaļas ir aminoskābes, vitamīni, neorganiskie sāļi, glikozes un serums. Serums tiek pievienots videi, jo tas darbojas kā augšanas faktoru, hormonu un saistīšanās faktoru avots. Papildus barības vielu nodrošināšanai vide palīdz arī uzturēt pH un osmolalitātes līmeni.

Šūnu kultūrā izmantoto barotņu veidi

Gan cilvēka, gan dzīvnieku šūnas var audzēt gan mākslīgā vai sintētiskā barotnē, gan pilnīgi dabīgā barotnē, kas papildināta ar dabīgiem elementiem. Turpinājumā sniegsim pārskatu par dažādiem pašlaik pieejamiem barotņu veidiem.

Dabiskās barotnes

Dabiskajā barotnē var atrast tikai bioloģiskos šķidrumus, kas pastāv to dabiskajā stāvoklī. Dabiskās barotnes ir ļoti noderīgas un viegli izmantojamas dažādu dzīvnieku šūnu tipu kultivēšanai. Nepietiekama izpratne par precīziem komponentiem, kas veido dabisko barotni, ir galvenais faktors, kas ietekmē zemo rezultātu atkārtojamību, izmantojot dabiskās barotnes.

Mākslīgās barotnes

Mākslīgo vai sintētisko barotņu sagatavošana ietver barības vielu (gan organisko, gan neorganisko), seruma proteīnu, ogļhidrātu, kofaktoru, vitamīnu un sāļu pievienošanu, kā arī O2 un CO2 gāzes fāžu pievienošanu [1].

Ir izstrādāti dažādi mākslīgo barotņu veidi, lai pildītu vienu vai vairākas no šādām funkcijām: 1) Tūlītēja izdzīvošana (līdzsvarots sāļu šķīdums ar precīzu pH un osmotisko spiedienu). 2) Ilgstoša izdzīvošana (līdzsvarots sāļu šķīdums, kam pievienotas dažādas organisko ķīmisko vielu un/vai seruma formulācijas). 3) Neierobežota attīstība. 4) Specializētas funkcijas.

Mākslīgajiem barotnēm ir četras atšķirīgas klasifikācijas:

Serumu saturošas barotnes

Visbiežāk sastopamais piedevas veids dzīvnieku šūnu audzēšanai izmantotajā barotnē ir liellopu augļa serums. To pievieno kultūras barotnei kā lētu piedevu, lai panāktu iespējami labākos augšanas apstākļus. Papildus tam, ka serums darbojas kā nestabilu vai ūdenī nešķīstošu uzturvielu, hormonu un augšanas faktoru, proteāžu inhibitoru un citu vielu pārvadātājs vai helators, tas arī saista un neitralizē kaitīgas molekulas.

Seruma nesaturošas barotnes

Seruma klātbūtnei barotnēs ir vairāki trūkumi, un tā var izraisīt būtiskas interpretācijas kļūdas imunoloģiskajos pētījumos [2, 3]. Ir izstrādātas dažādas bezseruma barotnes [4, 5]. Šīs barotnes parasti ir speciāli izstrādātas, lai atbalstītu viena šūnu tipa kultivēšanu, piemēram, „Knockout Serum Replacement” un „Knockout DMEM” no „Thermo Fisher Scientific”, kā arī „mTESR” barotne no „Stem Cell Technologies” [6], kas paredzēta cilmes šūnām [7].

Turklāt šajās barotnēs ir iekļauti noteikti daudzumi attīrītu augšanas faktoru, lipoproteīnu un citu proteīnu, kurus citādi parasti nodrošina serums [8]. Šīs barotnes bieži dēvē par „definētām kultivēšanas barotnēm”, jo to sastāvdaļas ir labi izpētītas.

Ķīmiski definētas barotnes

Šīs barotnes satur ultra-tīras neorganiskas un organiskas sastāvdaļas, kas nav piesārņotas ar nekāda veida piemaisījumiem. Tās var saturēt arī tīras olbaltumvielu piedevas, piemēram, augšanas faktorus.

 Baktēriju vai rauga ģenētiskā modifikācija kopā ar konkrētu taukskābju, vitamīnu, holesterīna un aminoskābju pievienošanu nodrošina to sastāvdaļu ražošanu [9].

Proteīnu nesaturošas barotnes

Proteīnu nesaturošas barotnes ir tādas, kurās vispār nav proteīnu, bet ir tikai neproteīna elementi. Salīdzinot ar barotnēm, kurām pievienots serums, barotņu izmantošana bez proteīnu piedevas veicina lielāku šūnu proliferāciju un proteīnu ekspresiju, kā arī atvieglo jebkura turpmākajā procesā iegūtā produkta attīrīšanu [10–12]. Proteīns nav iekļauts tādos barotņu sastāvos kā MEM un RPMI-1640. Tomēr nepieciešamības gadījumā var pievienot proteīna piedevu.

Kultivēšanas barotnes un to pamatkomponenti

Komerciālo kultivēšanas barotni var iegādāties pulvera vai šķidrā veidā, un tā bieži satur dažādus uzturvielu avotus, piemēram, aminoskābes, glikozes, sāļus, vitamīnus un citus uztura bagātinātājus. 

Šo sastāvdaļu nepieciešamība katrai šūnu līnijai ir atšķirīga, un šīs atšķirības nosaka plašo barotņu sastāvu dažādību. Katrai sastāvdaļai ir sava funkcija, kas tiks izklāstīta turpmākajos punktos:

Buferizācijas sistēmas

Lai uzturētu optimālus augšanas apstākļus, ir jākontrolē pH līmenis, ko bieži vien veic, izmantojot vienu no divām buferizācijas sistēmām:

Dabiskā buferizācijas sistēma

CO₂/H₂CO₃ attiecība atmosfērā ir vienāda ar to barotnē, tādējādi radot dabisku buferizācijas mehānismu. Lai saglabātu šo dabisko buferizācijas mehānismu, kultūras jātur gaisa vidē ar 5–10 % CO₂ saturu, ko bieži panāk, izmantojot CO₂ inkubatoru. Viena no lielākajām dabiskā bufera priekšrocībām ir tā lētums un drošība.

HEPES

Ķīmiskā buferēšana, izmantojot zwitterjonu HEPES, nodrošina lielāku buferēšanas spēju pH diapazonā no 7,2 līdz 7,4 un neprasa regulētu gāzes vidi. Konkrētiem šūnu tipiem lielāka HEPES deva var būt kaitīga. HEPES saturošas barotnes ir arī daudz jutīgākas pret fluorescējošās gaismas fototoksisko iedarbību [13].

Fenolsarkans

pH indikators fenola sarkans bieži tiek iekļauts komerciāli pieejamās kultivēšanas vidēs, ļaujot nepārtraukti uzraudzīt pH. Šīm šūnām vairojoties, to ražotie metabolīti izraisa pH izmaiņas un tādējādi arī vides krāsas maiņu. Fenola sarkanajam ir divkārša ietekme uz barotnes krāsu — skābā pH vidē tā kļūst dzeltena, bet sārmainā pH vidē — violeta. pH 7,4, kas ir optimālā vērtība šūnu kultūrām, liek barotnei izskatīties fluorescējoši sarkanai.

Tomēr fenola sarkanajam ir arī daži trūkumi: pirmkārt, fenola sarkanais spēj imitēt vairāku steroīdu hormonu, galvenokārt estrogēna, darbību [14]. Tāpēc, pētot pret estrogēnu jutīgas šūnas, piemēram, krūšu audus, ieteicams izmantot barotni bez fenola sarkanā. Vairākos bezseruma preparātos fenola sarkana klātbūtne traucē nātrija un kālija līdzsvaru. Šo efektu var neitralizēt, barotnei pievienojot serumu vai liellopu hipofīzes hormonu [15]. Treškārt, fenola sarkana klātbūtne apgrūtina noteikšanu plūsmas citometrijas eksperimentos.

Neorganiskie sāļi

Barotnes, kas satur neorganiskos sāļus, piemēram, nātrija, kālija un kalcija jonus, palīdz uzturēt osmotisko līdzsvaru un regulēt membrānas potenciālu.

Aminoskābes

Tā kā aminoskābes ir proteīnu pamatsastāvdaļas, tās ir būtiska sastāvdaļa ikvienā šūnu audzēšanas barotnē, kas jebkad ir izstrādāta. Tā kā šūnas nespēj pašas ražot noteiktas aminoskābes, ir svarīgi, lai kultūras barotnē būtu iekļautas neaizvietojamās aminoskābes. Tās ir nepieciešamas šūnu vairošanās procesam, un to koncentrācija nosaka maksimālo šūnu blīvumu, ko var sasniegt. Īpaši svarīga ir neaizvietojamā aminoskābe L-glutamīns.

L-glutamīns darbojas kā sekundārs enerģijas avots vielmaiņai un piegādā slāpekli NAD, NADPH un nukleotīdu sintēzei. Tā kā L-glutamīns ir nestabila aminoskābe, kas laika gaitā pārveidojas formā, kuru šūnas nespēj izmantot, tā ir jāpievieno barotnei.

Turklāt barotnē var pievienot neesamās aminoskābes, lai atjaunotu tās, kas iztērētas augšanas procesa laikā. Šūnu augšana tiek veicināta un to dzīvotspēja palielinās, ja augšanas barotnei pievieno neesamās aminoskābes.

Ogļhidrāti

Ogļhidrāti cukuru veidā ir galvenais enerģijas avots. Daudzos barotnēs papildus izplatītākajiem cukuriem — glikozēm un galaktozēm — ir iekļauta arī maltoze un fruktoze.

Olbaltumvielas un peptīdi

Albumīns, transferīns un fibronektīns ir visbiežāk izmantotie proteīni un peptīdi. Tie ir īpaši nozīmīgi barotnēs, kurās nav iekļauts serums. Albumīns, transferīns, aprotinīns, fetuīns un fibronektīns ir daži no proteīniem, kas var atrasties serumā, kas ir bagāts proteīnu avots.

Albumīns ir galvenais asinīs sastopamais proteīns, un tā funkcija ir saistīt un transportēt dažādas vielas, tostarp ūdeni, sāļus, brīvās taukskābes, hormonus un vitamīnus, starp dažādiem orgāniem un šūnām. Albumīna spēja saistīties ar ķīmiskajām vielām padara to par efektīvu līdzekli kaitīgo savienojumu noņemšanai no barotnes, kurā tiek kultivētas šūnas.

Aprotinīns ir aizsarglīdzeklis šūnu kultivēšanas sistēmās, jo tas ir stabils neitrālā un skābā pH vidē, kā arī izturīgs pret augstām temperatūrām un proteolītisko enzīmu izraisītu noārdīšanos. Tas spēj inhibēt virkni serīna proteāžu, tostarp tripsīnu un citas.

Fetuīns ir glikoproteīns, ko dzīvnieku augļu un jaundzimušo dzīvnieku serumā var konstatēt lielākos daudzumos nekā pieaugušo dzīvnieku serumā. Turklāt tas darbojas kā serīna proteāzes inhibitors. Proteīns fibronektīns ir būtiska sastāvdaļa šūnu adhezijas procesā. Transferīns ir olbaltumviela, kas transportē dzelzi un ir atbildīga par dzelzs piegādi šūnu membrānām.

Taukskābes un lipīdi

Tām ir izšķiroša nozīme bezseruma vidē, ja serums nav klāt.

Vitamīni

Šūnu attīstībai un vairošanās procesam ir nepieciešami daudzi vitamīni. Šūnas nespēj ražot pietiekamu vitamīnu daudzumu, tāpēc audu kultūrās tie ir nepieciešami kā uztura bagātinātāji.

Šūnu kultūrā serums ir galvenais vitamīnu avots; tomēr barotnes tiek papildinātas arī ar dažādiem vitamīniem, lai tās būtu piemērotas konkrētam šūnu tipam. Visbiežāk augšanas stimulēšanai izmanto B grupas vitamīnus.

Mikroelementi

Ķīmiskie elementi, piemēram, varš, cinks, selēns un trikarboksilskābes starpprodukti, ir pazīstami kā mikroelementi. Mikroelementus bieži pievieno barotnēm, kurās nav seruma, lai aizstātu tos, kas parasti atrodas serumā. Šie elementi ir svarīgas ķīmiskas sastāvdaļas, kas nepieciešamas veselīgai šūnu attīstībai. Daudzas bioķīmiskās reakcijas, piemēram, fermentu aktivitāte, ir atkarīgas no noteiktiem mikroelementiem.

Barotnes piedevas

Pilnvērtīgajai augšanas barotnei, kas ieteikta noteiktām šūnu līnijām, nepieciešamas papildu sastāvdaļas, kuras nav iekļautas pamata barotnē un serumā. Šie uztura bagātinātāji veicina šūnu augšanu un atbilstošu vielmaiņas funkciju.

Lai gan hormoni, augšanas faktori un signālmolekulas ir būtiski konkrētu šūnu līniju pareizai proliferācijai, vienmēr jāievēro šādi piesardzības pasākumi: tā kā piedevu pievienošana var mainīt pilnās augšanas vides osmolalitāti, kas var kavēt šūnu attīstību, vienmēr ir ieteicams pārbaudīt osmolalitāti pēc piedevu pievienošanas. Lielākajai daļai šūnu līniju optimālā osmolalitāte ir no 260 līdz 320 mOSM/kg.

Antibiotikas

Antibiotikas bieži izmanto, lai kavētu baktēriju un sēnīšu piesārņotāju attīstību [16], lai gan tās nav nepieciešamas šūnu augšanai. Tā kā antibiotikas var slēpt mikoplazmu un rezistentu baktēriju izraisītu piesārņojumu, to rutīna lietošana šūnu kultūrās nav ieteicama [17, 18].

Turklāt antibiotikas var traucēt paaugstinātas jutības šūnu vielmaiņu. Bieži tiek izmantotas MilliporeSigma un Life Technologies ražotās penicilīna–streptomicīna kombinācijas. Plasmocin ir izmantots gliomas šūnu līniju TS603, TS516 un BT260 kultivēšanā [19], un ir pierādīts, ka tas efektīvi novērš mikoplazmas piesārņojumu (20).

Serums

Serumā ir sastopami albumīni, augšanas faktori un augšanas inhibitori. Serums ir viena no vissvarīgākajām šūnu kultūras barotnes sastāvdaļām, jo tas nodrošina aminoskābes, olbaltumvielas, vitamīnus (īpaši taukos šķīstošos vitamīnus, piemēram, A, D, E un K), ogļhidrātus, lipīdus, hormonus, augšanas faktorus, minerālvielas un mikroelementus.

Lai veicinātu kultivēto šūnu attīstību, bieži izmanto serumu, kas iegūts no liellopu augļiem un teļiem. Augļu serums ir bagāts augšanas faktoru avots un ir piemērots šūnu klonēšanai un jutīgu šūnu attīstībai. Tā kā teļu seruma spēja veicināt augšanu ir samazināta, to izmanto kontakta inhibīcijas eksperimentos. Standarta augšanas barotnēs bieži vien ir iekļauts 2–10 % seruma. Seruma pievienošana kultivēšanas barotnei kalpo šādiem mērķiem [21]:

• Serums nodrošina šūnām nepieciešamos uzturvielu avotus (gan šķīdumā, gan saistīti ar olbaltumvielām).

• Serumā ir vairāki augšanas faktori un hormoni, kas piedalās augšanas veicināšanā un specializētajā šūnu darbībā.

• Tajā ir daudz saistošo proteīnu, piemēram, albumīns un transferīns, kas transportē citas ķīmiskās vielas uz šūnu. Piemēram, albumīns piegādā taukus, vitamīnus, hormonus utt. uz šūnām.

• Tas nodrošina arī proteīnus, piemēram, fibronektīnu, kas palielina šūnu saistīšanos ar substrātu. Turklāt tas rada izplatīšanās elementus, kas palīdz šūnu izplešanās procesā pirms dalīšanās.

• Tas piegādā proteāžu inhibitorus, kas novērš proteolīzi šūnās.

• Tas satur arī minerālvielas, piemēram, Na+, K+, Zn2+ un Fe2+.

• Tas palielina barotnes viskozitāti, tādējādi aizsargājot šūnas no mehāniskiem bojājumiem suspensijas kultūras maisīšanas laikā.

• Tas darbojas arī kā buferis.

Atsauces

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Dzīvnieku šūnu barošana audu kultūrā; sākotnējie pētījumi par sintētisko barotni. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Teļa augļa seruma komponenta ātra adsorbcija kultivētajās zīdītāju šūnās. Potenciāls artefaktu avots pētījumos par antiserumiem pret šūnu specifiskiem antigēniem. Immunology. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Seruma pievienošana barotnei, ko izmanto šūnu suspensiju sagatavošanai, kā iespējamais artefaktu avots šūnu mediētajās reakcijās, kuras pētītas, izmantojot popliteālā limfmezgla testu. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Komerciālas bezseruma barotnes: hibridomu augšana un monoklonālo antivielu ražošana. J Immunol Methods. 1991;145:175–83

[5] Barnes D, Sato G. Metodes kultivēto šūnu audzēšanai bezseruma barotnē. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O, u.c. HSP70 šaperoni nogādā RNS-brīvo TDP-43 anizotropiskās intranukleārās šķidrās sfēriskās apvalkos. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J, u.c. Dauna sindroma izraisītā novecošanās traucē neironu priekšteču kodola arhitektūru. Cell Stem Cell. 2022;29:116–130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Seruma pilnīga aizstāšana ar albumīnu, transferīnu un sojas lipīdiem lipopolisaharīdiem reaģējošu B limfocītu kultūrās. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Hibridomu augšanai un monoklonālo antivielu ražošanai paredzētas ķīmiski definētas bezproteīnu barotnes sistemātiska uzlabošana. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. Proteīnu nesaturoša barotne hibridomu un citu imūnsistēmas šūnu audzēšanai. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Šeruma nesaturoša šūnu kultūra: vienota pieeja. Cell. 1980;22:649–55

[12] Hamilton W, Ham R. Ķīniešu kāmju šūnu līniju klonālā audzēšana proteīnu nesaturošās barotnēs. In Vitro. 1977;13:537–47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Gaismas iedarbībai pakļautas HEPES saturošas kultūras vides citotoksiskās iedarbības analīze. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Fenolsarkanais audu kultūras barotnēs ir vājš estrogēns: sekas estrogēniem reaģējošu šūnu pētījumiem kultūrā. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Bezseruma barotņu izstrāde. In: Master JRW, redaktors. Dzīvnieku šūnu kultūras, 3. izdevums. Oksforda: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Antibiotiku lietošana šūnu kultūras barotnēs. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Mikoplazmu infekcijas izplatība un kontrole šūnu kultūrās. In Vitro. 1976;12:643–8

[18] Masters J, Stacey G. Barotnes nomaiņa un šūnu līniju pārstādīšana. Nat Protoc. 2007;2:2276–84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M, et al. Histonu demetilāze KDM6A tieši uztver skābekli, lai regulētu hromatīnu un šūnu likteni. Science. 2019;363:1217–1222

[20] Molla Kazemiha V., Azari S., Amanzadeh A., Bonakdar S., Shojaei Moghadam M., Habibi Anbouhi M, u.c. Plasmocin™ efektivitāte dažādās ar mollicutes inficētās zīdītāju šūnu līnijās salīdzinājumā ar šūnu kultūrās parasti lietotajām antibiotikām: vietējā pieredze. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Liganda saistīšanās ar seruma albumīnu molekulārie aspekti. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53