Šūnu kultūru barotnes: Pārskats

Dzīvības zinātņu jomā viena no svarīgākajām metodoloģijām ir šūnu kultūras. Ar frāzi "šūnu kultūra" apzīmē šūnu, audu vai orgānu izņemšanu no dzīvnieka vai auga un turpmāku šo šūnu, audu vai orgānu implantēšanu mākslīgā vidē, kas ir labvēlīga to izdzīvošanai un/vai augšanai Lai nodrošinātu optimālu šūnu attīstību, ir nepieciešama kontrolēta temperatūra, substrāts šūnu piestiprināšanai, piemērota barotne un inkubators, kas uztur optimālu pH un osmolalitāti. Šādiem apstākļiem ir jābūt, lai šūnas varētu augt pilnvērtīgi.

Atbilstošas augšanas barotnes izvēle in vitro kultivēšanai ir šūnu kultūras posms, kas ir gan vissvarīgākais, gan vissvarīgākais. Augšanas barotne, saukta arī par barotni, ir šķidrums vai želeja, kas veidota, lai veicinātu organismu attīstību mikroskopiskā, šūnu vai augu mērogā. Šūnu kultivēšanai izmantotajā barotnē bieži vien ir pietiekams enerģijas un vielu daudzums, kas kontrolē šūnu ciklu. Galvenās barotnes sastāvdaļas ir aminoskābes, vitamīni, neorganiskie sāļi, glikoze un serums. Serumu pievieno barotnei, jo tas darbojas kā augšanas faktoru, hormonu un piesaistes faktoru avots. Papildus barības vielu nodrošināšanai barotne palīdz arī uzturēt pH un osmolalitātes līmeni.

Šūnu kultūrā izmantojamās barotnes veidi

Gan cilvēka, gan dzīvnieku šūnas var audzēt mākslīgā vai sintētiskā barotnē, vai arī pilnīgi dabiskā barotnē, kas papildināta ar dabīgiem elementiem. Turpmāk sniegsim pārskatu par dažādiem pašlaik pieejamajiem barotņu veidiem.

Dabiskās barotnes

Dabiskajās barotnēs var atrast tikai bioloģiskos šķidrumus, kas eksistē dabiskā stāvoklī. Dabiskās barotnes ir ļoti noderīgas un ērtas dažādu dzīvnieku šūnu tipu kultivēšanai. Izpratnes trūkums par precīzām sastāvdaļām, kas veido dabiskās barotnes, ir galvenais faktors, kas veicina to, ka, izmantojot dabiskās barotnes, iegūtie rezultāti ir maz atkārtojami.

Mākslīgās barotnes

Mākslīgo jeb sintētisko barotņu sagatavošana ietver barības vielu (gan organisko, gan neorganisko), seruma olbaltumvielu, ogļhidrātu, kofaktoru, vitamīnu un sāļu, kā arī O2 un CO2 gāzu fāžu pievienošanu [1].

Ir izstrādāti dažādi mākslīgo barotņu veidi, lai pildītu vienu vai vairākas no šādām funkcijām: 1) tūlītēja izdzīvošana (sabalansēts sāls šķīdums ar precīzu pH un osmotisko spiedienu). 2) Ilgstoša izdzīvošana (sabalansēts sāls šķīdums, kas papildināts ar dažādiem organisko ķīmisko vielu un/vai seruma preparātiem). 3) nenoteikta attīstība. 4) Specializētas funkcijas.

Ir četras atšķirīgas mākslīgo barotņu klasifikācijas:

Serumu saturošas barotnes

Visbiežāk sastopamais papildinājuma veids, kas atrodams barotnēs, kuras izmanto dzīvnieku šūnu audzēšanai, ir fetālais liellopu serums. To pievieno barotnei kā lētu papildinājumu, lai panāktu pēc iespējas labākus augšanas apstākļus. Papildus tam, ka serums darbojas ne tikai kā transportētājs vai helatoru barības vielām, kas ir nestabilas vai nešķīst ūdenī, hormoniem un augšanas faktoriem, proteāzes inhibitoriem un citām vielām, bet arī saista un neitralizē kaitīgas molekulas.

Serumu nesaturoša barotne

Seruma klātbūtnei barotnē ir vairāki trūkumi, un tā var radīt būtiskas kļūdas interpretācijā imunoloģiskajos pētījumos [2, 3]. Ir radītas dažādas no seruma brīvas barotnes [4, 5]. Šīs barotnes parasti ir īpaši izstrādātas viena šūnu tipa kultūrai, piemēram, Thermo Fisher Scientific ražotā Knockout Serum Replacement un Knockout DMEM, kā arī Stem Cell Technologies ražotā mTESR barotne [6] cilmes šūnām [7].

Turklāt šajās barotnēs ir noteikti attīrītu augšanas faktoru, lipoproteīnu un citu olbaltumvielu daudzumi, ko citādi parasti nodrošina serums [8]. Šīs barotnes bieži dēvē par "definētām kultūras barotnēm", jo to sastāvdaļas, kas veido šīs barotnes, ir labi zināmas.

Ķīmiski definētas barotnes

Šajās barotnēs ietilpst īpaši tīras neorganiskās un organiskās sastāvdaļas, kas nav piesārņotas ar jebkāda veida piesārņojumu. Tās var ietvert arī tīru proteīnu piedevas, piemēram, augšanas faktorus.

baktēriju vai rauga ģenētiskā modifikācija kopā ar konkrētu taukskābju, vitamīnu, holesterīna un aminoskābju pievienošanu rada to sastāvdaļu ražošanu [9].

Barotnes bez proteīniem

Bezproteīnu barotnes ir tādas barotnes, kurās vispār nav proteīnu, bet ir tikai bezproteīnu elementi. Salīdzinot ar barotnēm ar pievienotu serumu, barotņu izmantošana bez pievienotiem proteīniem veicina lielāku šūnu proliferāciju un proteīnu ekspresiju, kā arī atvieglo pakārtotajā procesā iegūto produktu attīrīšanu [10-12]. Tādos preparātos kā MEM un RPMI-1640 olbaltumvielas nav iekļautas. Tomēr, ja nepieciešams, var pievienot proteīnu piedevu.

Kultūru barotnes un to pamatkomponenti

Komerciālo barotni var iegādāties pulvera vai šķidruma veidā, un tajā bieži vien ir dažādas barības vielas, piemēram, aminoskābes, glikoze, sāļi, vitamīni un citi uztura bagātinātāji.

Katrai šūnu līnijai ir atšķirīgas vajadzības pēc šīm sastāvdaļām, un šo atšķirību dēļ ir plašs dažādu barotņu sastāvu skaits. Katra sastāvdaļa ir atbildīga par noteiktu funkciju, kas tiks izklāstīta turpmākajos punktos:

Buferējošās sistēmas

Lai uzturētu optimālus augšanas apstākļus, ir jākontrolē pH, ko bieži vien veic ar vienu no divām buferēšanas sistēmām:

Dabiskā buferēšanas sistēma

CO2/H2CO3 attiecība atmosfērā ir vienāda ar vidi, tādējādi radot dabisku buferēšanas mehānismu. Lai saglabātu dabisko buferēšanas mehānismu, kultūras jātur gaisa vidē ar 5-10 % CO2, ko bieži panāk, izmantojot CO2 inkubatoru. Viena no labākajām dabiskā bufera izmantošanas īpašībām ir tā, ka tas ir lēts un drošs.

HEPES

Ķīmiskajai buferēšanai, izmantojot cvinterjonu HEPES, ir lielāka buferspēja pH diapazonā 7,2-7,4, un tai nav nepieciešama regulēta gāzveida vide. Konkrētiem šūnu tipiem lielāka HEPES deva var būt kaitīga. HEPES saturošas barotnes ir arī daudz jutīgākas pret fluorescējošās gaismas fototoksisko iedarbību [13].

Fenola sarkanais

Komerciāli pieejamajā barotnē bieži ir iekļauts pH indikators fenola sarkanais, kas ļauj nepārtraukti kontrolēt pH. Paplašinot šūnas, šo šūnu producētie metabolīti izraisa pH izmaiņas un līdz ar to arī barotnes krāsas maiņu. Fenolsarkanajam ir divējāda ietekme uz barotnes krāsu, padarot to dzeltenu, ja pH ir skābs, un violetu, ja pH ir sārmains. pH 7,4, kas ir optimālā vērtība šūnu kultūrai, izraisa barotnes fluorescējoši sarkanu nokrāsu.

Taču fenola sarkanajam ir daži trūkumi: Pirmkārt, fenola sarkanais spēj imitēt vairāku steroīdo hormonu, galvenokārt estrogēna, darbību [14]. Tāpēc, pētot estrogēniem jutīgas šūnas, piemēram, krūts audus, ieteicams izmantot barotni, kas nesatur fenola sarkano. Fenola sarkanā klātbūtne vairākos bezseruma preparātos izjauc nātrija un kālija līdzsvaru. Seruma vai liellopu hipofīzes hormona pievienošana barotnei var neitralizēt šo efektu [15]. Treškārt, fenola sarkanā klātbūtne apgrūtina noteikšanu plūsmas citometrijas eksperimentos.

Neorganiskie sāļi

Barotnes, kas satur neorganiskos sāļus, piemēram, nātrija, kālija un kalcija jonus, palīdz uzturēt osmotisko līdzsvaru un regulēt membrānas potenciālu.

Aminoskābes

Tā kā aminoskābes ir olbaltumvielu pamatkomponenti, tās ir visu līdz šim radīto šūnu augšanas barotņu būtiska sastāvdaļa. Tā kā šūnas nespēj pašas saražot dažas aminoskābes, ir svarīgi, lai barotnes sastāvā būtu neaizstājamās aminoskābes. Tās ir nepieciešamas šūnu proliferācijai, un to koncentrācija nosaka maksimālo šūnu blīvumu, kādu var sasniegt. Īpaši svarīgs ir L-glutamīns, kas ir neaizvietojamā aminoskābe.

L-glutamīns darbojas kā sekundārs enerģijas avots vielmaiņai un nodrošina slāpekli NAD, NADPH un nukleotīdu ražošanai. Tā kā L-glutamīns ir nestabila aminoskābe, kas ar laiku pārvēršas formā, kuru šūnas nespēj izmantot, tas jādod barotnē.

Turklāt barotnei var piegādāt nebūtiskas aminoskābes, lai papildinātu to aminoskābju krājumus, kas ir izlietotas augšanas procesā. Šūnu augšanu paātrina un to dzīvotspēju palielina, ja augšanas barotni papildina ar nebūtiskām aminoskābēm.

Ogļhidrāti

Ogļhidrāti cukuru veidā ir galvenais enerģijas avots. Daudzas barotnes papildus biežāk sastopamajiem glikozes un galaktozes cukuriem satur arī maltozi un fruktozi.

Olbaltumvielas un peptīdi

Albumīns, transferīns un fibronektīns ir visbiežāk izmantotie proteīni un peptīdi. Tie ir īpaši nozīmīgi barotnēs, kurās nav seruma. Albumīns, transferīns, aprotinīns, fetuīns un fibronektīns ir daži no proteīniem, ko var atrast serumā, kas ir bagātīgs proteīnu avots.

Albumīns ir galvenais olbaltums, kas atrodams asinīs, un tā funkcija ir saistīt un transportēt dažādas vielas, tostarp ūdeni, sāļus, brīvās taukskābes, hormonus un vitamīnus, starp dažādiem orgāniem un šūnām. Albumīna spēja piesaistīt ķīmiskās vielas padara to par efektīvu kandidātu, lai no barotnes, kurā kultivē šūnas, atdalītu kaitīgos savienojumus.

Aprotinīns ir aizsargviela šūnu kultūru sistēmās, jo tas ir stabils neitrālā un skābā pH, kā arī izturīgs pret augstu temperatūru un bojājumiem, ko var izraisīt proteolītiskie fermenti. Tas spēj inhibēt vairākas serīna proteāzes, tostarp tripsīnu.

Fetuīns ir glikoproteīns, ko augļa un jaundzimušo dzīvnieku serumā var konstatēt lielākā daudzumā nekā pieaugušo serumā. Turklāt tas darbojas kā serīna proteāzes inhibitors. Olbaltumviela fibronektīns ir būtiska sastāvdaļa šūnu adhēzijas procesā. Transferīns ir olbaltumviela, kas transportē dzelzi un ir atbildīga par dzelzs piegādi šūnu membrānām.

Taukskābes un lipīdi

Tām ir būtiska nozīme bezseruma vidē, ja nav seruma.

Vitamīni

Daudzi vitamīni ir nepieciešami šūnu attīstībai un proliferācijai. Vitamīni šūnās nevar tikt saražoti pietiekamā daudzumā, tāpēc tie ir būtiski audu kultūrā kā uztura bagātinātāji.

Šūnu kultūrā galvenais vitamīnu avots ir serums; tomēr barotnes tiek arī apstrādātas ar dažādiem vitamīniem, lai tās būtu piemērotas konkrētam šūnu tipam. Visbiežāk augšanas stimulēšanai izmanto B grupas vitamīnus.

Mikroelementi

Tādi ķīmiskie elementi kā varš, cinks, selēns un trikarboksilskābes starpprodukti ir pazīstami kā mikroelementi. Mikroelementus bieži pievieno barotnēm, kurās nav seruma, lai aizstātu tos, kas parasti ir serumā. Šie elementi ir svarīgi ķīmiskie komponenti, kas nepieciešami veselīgai šūnu attīstībai. Daudzas bioķīmiskās reakcijas ir atkarīgas no noteiktiem mikroelementiem, piemēram, fermentu aktivitāte.

Barotnes papildinājumi

Dažām šūnu līnijām ieteiktajai pilnvērtīgai augšanas barotnei ir nepieciešami papildu komponenti, kas nav bāzes barotnē un serumā. Šie uztura bagātinātāji atbalsta šūnu augšanu un atbilstošu metabolisma funkciju.

Lai gan hormoni, augšanas faktori un signālu molekulas ir būtiski svarīgi noteiktu šūnu līniju pienācīgai proliferācijai, vienmēr jāievēro šādi piesardzības pasākumi: Tā kā, pievienojot uztura bagātinātājus, var mainīties pilnas augšanas barotnes osmolalitāte, kas var kavēt šūnu attīstību, pēc uztura bagātinātāju pievienošanas vienmēr ir ieteicams pārbaudīt osmolalitāti. Lielākajai daļai šūnu līniju optimālais osmolalitāte ir robežās no 260 līdz 320 mOSM/kg.

Antibiotikas

Antibiotikas bieži izmanto, lai kavētu baktēriju un sēnīšu piesārņotāju attīstību [16], lai gan tās nav būtiskas šūnu augšanai. Tā kā antibiotikas var slēpt piesārņojumu ar mikoplazmu un rezistentām baktērijām, to ikdienas lietošana šūnu kultūrā nav ieteicama [17, 18].

Turklāt antibiotikas var izjaukt paaugstinātas jutības šūnu metabolismu. Bieži izmanto MilliporeSigma un Life Technologies ražotās penicilīna un streptomicīna kombinācijas. Gliomu šūnu līniju TS603, TS516 un BT260 [19] kultūrā ir izmantots plazmocīns, un ir pierādīts, ka tas ir efektīvs mikoplazmas piesārņojuma likvidēšanā [20].

Serums

Serumā ir albumīni, augšanas faktori un augšanas inhibitori. Serums ir viena no nozīmīgākajām šūnu kultūru barotnes sastāvdaļām, jo tas nodrošina aminoskābes, olbaltumvielas, vitamīnus (īpaši taukos šķīstošos vitamīnus, piemēram, A, D, E un K), ogļhidrātus, lipīdus, hormonus, augšanas faktorus, minerālvielas un mikroelementus.

Lai veicinātu kultivēto šūnu attīstību, bieži izmanto serumu, kas iegūts no augļa un teļa liellopu izcelsmes. Augšanas faktoru bagātīgi nodrošina augļa serums, un tas ir piemērots šūnu klonēšanai un jutīgu šūnu attīstībai. Tā kā teļa seruma augšanu veicinošās spējas ir mazākas, to izmanto kontakta inhibīcijas eksperimentos. Parastās augšanas barotnēs bieži vien ir 2 % līdz 10 % seruma. Seruma pievienošana barotnei kaltēšanai kalpo šādiem mērķiem [21]:

• Serums nodrošina šūnām nepieciešamās barības vielas (gan šķīdumā, gan pievienotas olbaltumvielām).

• Seruma sastāvā ir vairāki augšanas faktori un hormoni, kas iesaistīti augšanas veicināšanā un specializētā šūnu aktivitātē.

• Tajā ir daudz saistvielu proteīnu, piemēram, albumīns un transferīns, kas transportē citas ķīmiskās vielas uz šūnām. Piemēram, albumīns nogādā šūnās taukus, vitamīnus, hormonus utt.

• Tas nodrošina arī olbaltumvielas, piemēram, fibronektīnu, kas palielina šūnu saķeri ar substrātu. Turklāt tas ražo izkliedējošos elementus, kas veicina šūnu paplašināšanos pirms dalīšanās.

• Tas nodrošina proteāzes inhibitorus, kas novērš šūnu proteolīzi.

• Tas satur arī minerālvielas, piemēram, Na+, K+, Zn2+ un Fe2+.

• Tas palielina barotnes viskozitāti, tādējādi pasargājot šūnas no mehāniskiem bojājumiem suspensijas kultūru maisīšanas laikā.

• Tas ir arī buferis.

Atsauces

[1] Morgan J, Morton H, Parker R. Dzīvnieku šūnu barošana audu kultūrā; sintētiskās barotnes sākotnējie pētījumi. Proc Soc Exp Biol Med. 1950;73:1-8

[2] Kerbel R, Blakeslee D. Rapid adsorption of a foetal calf serum component by mammalian cells in culture (Kerbels R, Blakeslee D. Zīdītāju šūnu kultūrā veikta ātra augļa teļa seruma komponenta adsorbcija). Potenciāls artefaktu avots šūnu specifisko antigēnu antiserumu pētījumos. Imunoloģija. 1976;31:881-91

[3] Sula K, Draber P, Nouza K. Seruma pievienošana barotnei, ko izmanto šūnu suspensiju pagatavošanai, kā iespējams artefaktu avots šūnu mediēto reakciju pētījumos, ko veic, izmantojot popliteālā limfmezgla testu. J Immunogenet. 1980;7:483-9

[4] Mariani E, Mariani A, Monaco M, Lalli E, Vitale M, Facchini A. Komerciālās bezseruma barotnes: hibrīdomu augšana un monoklonālo antivielu ražošana. J Immunol Methods. 1991;145:175-83

[5] Barnes D, Sato G. Kultivētu šūnu audzēšanas metodes bezseruma barotnē. Anal Biochem. 1980;102:255-70

[6] Yu H, Lu S, Gasior K, Singh D, Vazquez Sanchez S, Tapia O,et al. HSP70 chaperones RNA-free TDP-43 into anisotropic intranuclear liquid spherical shells. Science. 2021;371:

[7] Meharena H, Marco A, Dileep V, Lockshin E, Akatsu G, Mullahoo J,et al. Down-syndrome-induced senescence disrupts nuclear architecture of neural progenitors. Cell Stem Cell. 2022;29:116-130.e7

[8] Iscove N, Melchers F. Pilnīga seruma aizstāšana ar albumīnu, transferīnu un sojas pupiņu lipīdiem lipopolisaharīdu reaktīvo B limfocītu kultūrās. J Exp Med. 1978;147:923-33

[9] Stoll T, Muhlethaler K, von Stockar U, Marison I. Systematic improvement of a chemically-defined protein-free medium for hybridoma growth and monoclonal antibody production. J Biotechnol. 1996;45:111-23

[10] Darfler F. A protein-free medium for growth of hybridomas and other cells of the immune system. In Vitro Cell Dev Biol. 1990;26:769-78

[11] Barnes D, Sato G. Bezseruma šūnu kultūras: vienojoša pieeja. Cell. 1980;22:649-55

[12] Hamilton W, Ham R. Clonal growth of chinese hamster cell lines in protein-free media. In Vitro. 1977;13:537-47

[13] Zigler J, Lepe Zuniga J, Vistica B, Gery I. Analysis of cytotoxic effects of light-exected HEPES-containing culture medium. In Vitro Cell Dev Biol. 1985;21:282-7

[14] Berthois Y, Katzenellenbogen J, Katzenellenbogen B. Phenol red in tissue culture media is a weak estrogen: implications concerning the study of estrogen-responsive cells in culture. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986;83:2496-500

[15] Karmiol S. Serumu nesaturošu barotņu izstrāde. In: Master JRW, redaktors. Animal Cell culture, 3. izd. Oxford: Oxford University Press; 2000.

[16] Perlman D. Use of antibiotics in cell culture media. Methods Enzymol. 1979;58:110-6

[17] McGarrity G. Mycoplasmal infection of cell cultures spread and control. In Vitro. 1976;12:643-8

[18] Masters J, Stacey G. Changing medium and passaging cell lines. Nat Protoc. 2007;2:2276-84

[19] Chakraborty A, Laukka T, Myllykoski M, Ringel A, Booker M, Tolstorukov M,et al. Histone demethylase KDM6A directly senses oxygen to control chromatin and cell fate. Science. 2019;363:1217-1222

[20] Molla Kazemiha V, Azari S, Amanzadeh A, Bonakdar S, Shojaei Moghadam M, Habibi Anbouhi M,et al. Plasmocin™ efektivitāte uz dažādām zīdītāju šūnu līnijām, kas inficētas ar mollicutām, salīdzinot ar parasti lietotām antibiotikām šūnu kultūrā: vietējā pieredze. Cytotechnology. 2011;63:609-20

[21] Kragh Hansen U. Molecular aspects of ligand binding to serum albumin. Pharmacol Rev. 1981;33:17-53