Cilvēka primārās šūnas

Kas ir cilvēka primārās šūnas?

Primārās šūnas ir vispuretākā attēlošana to attiecīgajiem audiem. Tās tiek izdalītas no audiem un apstrādātas tā, lai tās varētu ieaugt kultūrā ar ideāliem apstākļiem. Tās precīzāk atspoguļo in vivo stāvokli un parāda normālu fizioloģiju, jo tās ir iegūtas no audiem, nevis modificētas. Tādēļ tās var kalpot kā noderīgi modeļi pētījumos par šūnu farmakoloģiju, toksikoloģiju un fizioloģiju (ieskaitot pētījumus par vielmaiņu, novecošanu un signālu pārraidi). Jāpatur prātā, ka primārās šūnas ir grūtāk kultivēt un uzturēt nekā nepārtrauktas šūnu līnijas, jo tām ir īsāks dzīves ilgums un tās pārtrauc dalīties (vai noveco) pēc noteiktu šūnu dalīšanās reižu skaita. Šūnu signālceļu pētījumus apgrūtina primāro šūnu dabiskā variabilitāte, kas rodas no donoriem un subkultivēšanas procesiem. Pirms signālceļu pētījumu uzsākšanas pētnieki bieži veic skrīningu, lai noteiktu, vai šūnas reaģē uz parasti izmantotajiem stimuliem. Lai izvairītos no laika un naudas izšķiešanas, primārās šūnas pirms skrīninga var stimulēt, lai aktivizētu galvenos signālceļus.

Kāpēc izmantot cilvēka primārās šūnas?

Kā šūnu analīzes parasti izmanto nemirstīgas šūnu līnijas. Lai gan zinātnieki ir atzinuši, ka šūnu līnijām raksturīgās bioloģiskās izmaiņas var būt kaitīgas, pētot to fizioloģisko nozīmi. Cilvēka primāro šūnu izmantošana uzlabo ar šūnu kultūrām iegūto datu fizioloģisko vērtību, un tās arvien vairāk tiek uzskatītas par svarīgām bioloģisko procesu, slimību attīstības un zāļu izstrādes pētījumos.

Cilvēka primārās šūnas plaši izmanto in vitro pētījumos par starpšūnu un iekššūnu komunikāciju, attīstības bioloģiju, kā arī mehānismiem, kas ir vēža, Parkinsona slimības un diabēta pamatā, kā arī daudzās citās pirmsklīniskās un izpētes bioloģiskās pētniecības jomās. Pētnieki jau sen izmanto nemirstīgas šūnu līnijas, lai pētītu audu funkcijas; tomēr šūnu līnijas ar acīmredzamām mutācijām un hromosomu anomālijām var nebūt labi normālo šūnu aizstājēji un neatspoguļot slimības attīstību tās agrīnās stadijās. Tagad ir iespējams izveidot precīzāku konkrēta audu šūnu tipa modeli, izmantojot cilvēka primārās šūnas, kas izdalītas no šī auda un uzturētas primāro šūnu kultūras barotnēs un piedevās.

Kas ir primārā šūnu kultūra?

Tā vietā, lai izmantotu nemirstīgas šūnu līnijas, primārā šūnu kultūra ietver šūnu audzēšanu tieši no daudzšūnu organisma ārpus ķermeņa. Dažās valstīs, piemēram, Apvienotajā Karalistē, ir juridiski atzīts fakts, ka primārās šūnu kultūras labāk atspoguļo in vivo audus nekā šūnu līnijas. Tomēr primārajām šūnām augšanai nepieciešams atbilstošs substrāts un barības vielas, un pēc noteiktu dalīšanās reižu skaita tās attīsta novecošanās fenotipu, kas liek tām pastāvīgi pārtraukt dalīšanos. Šie divi faktori motivē šūnu līniju izveidi. Gan dabīgi nemirstīgas primārās šūnas (piemēram, HeLa šūnas), gan mākslīgi nemirstīgas primārās šūnas (piemēram, HEK šūnas) var audzēt šūnu kultūrā bezgalīgi ilgi.

Cilvēka primārās šūnas pēc audu tipiem

Epiteliošūnas, fibroblasti, keratinocīti, melanocīti, endotēlija šūnas, muskuļu šūnas, imūnsistēmas šūnas un cilmes šūnas, piemēram, mezenhīmālās cilmes šūnas, ir starp visbiežāk izmantotajām cilvēka primārajām šūnām zinātniskajos pētījumos. Sākumā kultūras ir heterogēnas (tās atspoguļo audā esošo šūnu tipu maisījumu), un tās in vitro var uzturēt dzīvas tikai noteiktu laiku. Transformācija ir in vitro process, kas ļauj manipulēt ar cilvēka primārajām šūnām, lai iegūtu neierobežotu skaitu subkultūru. Transformācija var notikt dabiski vai to var izraisīt ķīmiskas vielas vai vīrusi. Pēc ģenētiskās transformācijas primārā kultūra var bezgalīgi dalīties, veidojot nemirstīgu sekundāro šūnu līniju, ja tai tiek nodrošināts pietiekams barības vielu daudzums un telpa.

Endotēlija šūnas

Vēža ārstēšana, brūču sadzīšana, šūnu signālu pētījumi, augstas caurlaidspējas un augsta satura skrīnings, kā arī toksikoloģiskais skrīnings ir tikai daži no jomām, kurās primāro endotēlija šūnu izmantošana kā pētniecības instruments var sniegt ieguvumus.

Keratinocīti

Keratinocīti, kas iegūti no pieauguša cilvēka ādas epidermas vai jaundzimušā priekšādas, spēlē izšķirošu lomu tādu ādas slimību kā psoriāze un vēzis pētniecībā.

Epitelio šūnas

Sākot no vēža pētījumiem līdz toksikoloģiskajām izpētēm, primārās epitēlija šūnas ir pierādījušas, ka tās ir nenovērtējams resurss organisma dabisko aizsardzības mehānismu modelēšanai.

Fibroblasti

Inducēto pluripotento cilmes šūnu (iPS) radīšana un brūču sadzīšanas pētīšana ir tikai daži no daudzajiem primāro fibroblastu izmantošanas veidiem.

Imūnsistēmas šūnas

Perifērās asins mononukleārās šūnas, saīsināti PBMC, ir asins mononukleārās šūnas ar apaļu šūnu kodolu. Tās galvenokārt ietver limfocītus un monocītus, kuriem ir svarīgas funkcijas imūnreakcijas gaitā. Perifērās asins mononukleārās šūnas bieži izmanto infekciju diagnosticēšanai vai iespējamās vakcinācijas aizsardzības noteikšanai. Izpratne par T šūnu mediēto šūnu imūnreakciju bieži vien ir izšķiroša.

Melanocīti

Melanocīti, specializētas ādas šūnas, kas ražo pigmentu melanīnu, ir noderīgi kā modeļi pētījumos par tādām tēmām kā brūču sadzīšana, toksicitāte, melanoma, ādas reakcija uz ultravioleto (UV) starojumu, ādas slimības un kosmētika.

Cilmes šūnas

Cilmes šūnām piemīt spēja diferenciēties dažādos šūnu tipos. Pateicoties šai diferenciācijas spējai, tās paver jaunas iespējas cilvēka audu un veselības stāvokļu modelēšanai.

Mezenhīmālās cilmes šūnas

Mezenhīmālās cilmes šūnas, kas pazīstamas arī kā MSC, var iegūt no dažādiem cilvēka avotiem, piemēram, kaulu smadzenēm, taukiem (taukaudiem), nabassaites audiem (Vartona želeja) un amnija šķidrumam (šķidrumam, kas apņem augli), un tās var pavairot in vitro. Šīm pieaugušo stromas cilmes šūnām piemīt spēja attīstīties par dažādiem šūnu tipiem. Daži no šiem šūnu tipiem ir kaulu šūnas, skrimšļu šūnas, muskuļu šūnas, neironu šūnas, ādas šūnas un radzenes šūnas.

Gludo muskuļu šūnas

Dobajos orgānos primārās gludo muskuļu šūnas (SMC) izklāj iekšpusi un nodrošina kontraktilitāti. Papildus vēža un citu slimību pētījumiem, SMC var izmantot, lai modelētu hipertensijas fibrozi.

Primārās šūnas un šūnu līnijas

Vai nu spontānas mutācijas rezultātā, kā transformētās vēža šūnu līnijās, vai arī ar apzinātu pārveidošanu, piemēram, mākslīgi radot vēža gēnus, nepārtrauktas šūnu līnijas ir ieguvušas spēju bezgalīgi vairoties (tās ir imortalizētas). Parasti nepārtrauktas šūnu līnijas ir uzticamākas un ērtāk izmantojamas nekā primārās šūnas. Tās var pavairoties bezgalīgi un nodrošina ātru piekļuvi būtiskiem datiem. Nepārtraukto šūnu līniju izmantošanai ir noteikti ierobežojumi, tostarp fakts, ka tās ir ģenētiski modificētas/transformētas, kas var mainīt fizioloģiskās īpašības un neatbilst in vivo apstākļiem, un ka tas laika gaitā var turpināt mainīties, veicot ievērojamu pasāžēšanu.

Sasniegumi primāro šūnu kultivēšanā

Primārām šūnām ir slava, ka ar tām ir grūti strādāt. Tomēr šis process kļūst vieglāks nekā jebkad agrāk, pateicoties attīstībai primāro šūnu kultivēšanā, komerciāli pieejamām primārām šūnām ar pilnībā optimizētiem protokoliem un jaunām analīzes metodēm, kurām nepieciešams mazāks ieguldījums.

Pāreja no divdimensionālās uz trīsdimensionālo šūnu kultūru tiek uzskatīta par nozīmīgu pagrieziena punktu šajā jomā. Divdimensionālajā kultūrā var būt vājināta audu specifiskā arhitektūra, šūnu savstarpējās mijiedarbības un mehāniskā/bioķīmiskā signālu pārraide. Tādējādi šo kultūru bioloģiskajai vērtībai ir noteikti ierobežojumi.

No otras puses, trīsdimensiju šūnu kultūra ļauj šūnām vairoties un mijiedarboties ar trīsdimensiju ekstracelulāro struktūru. Tas ļauj šūnām mijiedarboties gan savā starpā, gan ar ekstracelulāro matricu, padarot trīsdimensiju kultūras fizioloģiski atbilstošākas. Šīs metodes precizitāte in vivo reakciju prognozēšanā ir padarījusi to revolucionāru tādās jomās kā zāļu atklāšana un izstrāde. Tāpēc modernākās tehnoloģijas, piemēram, no pacientiem iegūti organoīdi un „orgāni uz mikroshēmas”, nodrošina ļoti kontekstuālus modeļus zāļu skrīningam un izstrādei.

Primāro šūnu iegūšana ir šaurā vieta primārajā kultūrā. Lai to pārvarētu, parasti ir nepieciešams lielāks audu apjoms, ko var būt grūti iegūt. Tomēr uzlabotā analītiskā jutība paver ceļu uz priekšu. Piemēram, nepieciešamību kultivēt lielus primāro šūnu daudzumus samazina vienšūnu tehnoloģijas izmantošana, kas ietver sekvencēšanu, Western blotting un masu citometriju.

Daudzsološas perspektīvas primāro šūnu kultivēšanai

Tehnoloģiskie sasniegumi mazina vispārējās grūtības, kas saistītas ar primāro šūnu kultivēšanu. Savukārt šī metode strauji aizstāj citas metodes kā zelta standarts šūnu un molekulārās bioloģijas pētījumos un praksē. Vakcīnu ražošana, orgānu aizstāšana, cilmes šūnu terapijas, vēža pētījumi un daudzas citas jomas varēs gūt ievērojamu labumu no nepārtrauktajiem sasniegumiem primāro šūnu kultivēšanas jomā.

Padomi un triki primāro šūnu kultivēšanai

Šūnu pavairošanas vajadzības

Divas visbiežāk izmantotās primāro šūnu kultivēšanas metodes ir suspensijā vai uz virsmas (2D). Dažas šūnas spēj brīvi peldēt asinsritē, nekad nepielipdamas pie virsmas (piemēram, tās, kas iegūtas no perifērās asinis). Ir izveidotas dažādas šūnu līnijas, kas labi attīstās suspensijas kultūrās, kur tās var sasniegt blīvumu, kas nav sasniedzams 2D augšanas apstākļos. Primārās šūnas, kurām in vitro augšanai nepieciešama piestiprināšanās, sauc par adhezīvām šūnām, un tās ietver arī tās, kas atrodamas cietos audos. Lai uzlabotu adhezijas īpašības un nodrošinātu citus augšanai un diferenciācijai nepieciešamos signālus, šīs šūnas parasti kultivē plakānā, nepārklātā plastmasas traukā, bet dažreiz arī uz mikronesējvielas. Pēdējā minētā var būt pārklāta ar ekstracelulārās matricas proteīniem (piemēram, kolagēnu un laminīnu). Šūnu kultūrā izmantotais barotnes sastāv no pamata barotnes, kas papildināta ar atbilstošiem augšanas faktoriem un citokīniem. Šūnu inkubators ir īpaša laboratorijas inkubatora veida ierīce, ko izmanto šūnu audzēšanai un uzturēšanai noteiktā temperatūrā un gāzu maisījumā (parasti 37 °C, 5 % CO₂ zīdītāju šūnām). Atkarībā no kultivējamā šūnu veida optimālie apstākļi var būt ļoti atšķirīgi. Atkarībā no audzēto šūnu veida optimālajai augšanas barotnei būs unikāla faktoru kombinācija, tostarp, bet ne tikai, pH, glikozes koncentrācija, augšanas faktori un citu barības vielu klātbūtne.

Antibiotikas augšanas vidē ir ļoti svarīgas primārās kultūras izveides laikā, lai novērstu inficēšanos no saimniekaudiem. Dažās antibiotiku shēmās tiek izmantota gentamicīna, penicilīna, streptomicīna un amfotericīna B kombinācija. Tomēr antibiotiku lietošana ilgstošā laika periodā nav ieteicama, jo daži reaģenti (piemēram, amfotericīns B) ilgtermiņā var būt toksiski šūnām.

Lielākā daļa primāro šūnu noveco un pārtrauc dalīties pēc noteiktu populācijas dubultošanās reižu skaita, tāpēc ir ļoti svarīgi tās saglabāt dzīvas pēc izdalīšanas. Šūnu dzīvotspējas nodrošināšanai ilgtermiņā nepieciešamas profesionālas šūnu kultivēšanas metodes un ideāli kultivēšanas apstākļi (tostarp piemērota barotne, pareiza temperatūra, atbilstošs gāzu maisījums, pareizs pH līmenis, atbilstoša augšanas faktoru koncentrācija, barības vielu klātbūtne un glikozes klātbūtne). Tā kā daudzi no augšanas faktoriem, ko izmanto barotnes papildināšanai, tiek iegūti no dzīvnieku asinīm (no asinīm iegūtās sastāvdaļas var būt piesārņotas), ieteicams to lietošanu samazināt līdz minimumam vai vispār izvairīties no tās. Ir svarīgi arī ievērot aseptiskas metodes.

Subkultivēšana un uzturēšana

Kad izolētās šūnas pieķeras kultūras trauka virsmai, tas iezīmē uzturēšanas fāzes sākumu. Pieķeršanās parasti notiek 24 stundas pēc kultūras uzsākšanas. Šūnas jāpārkultivē, kad tās ir sasniegušas noteiktu konfluences procentu un aktīvi vairojas. Tā kā pēc konfluences sasniegšanas šūnas var sākt diferenciēties un pēc pasāžas parādīt lēnāku proliferāciju, vislabāk ir pārkultivēt primārās šūnu kultūras, pirms tās sasniedz 100 % konfluenci.

Subkultivēšana svaigā barotnē uztur eksponenciālu pieaugumu šūnām, kas ir atkarīgas no piestiprināšanās. Monoslāņu subkultivēšana pārtrauc starpšūnu un intracelulārās mijiedarbības ar šūnu virsmu. Lai atdalītu adhezīvās primārās šūnas no monoslāņiem vai audiem, izmanto zemas koncentrācijas proteolītiskos enzīmus, piemēram, tripsīnu/EDTA. Pēc disociācijas un atšķaidīšanas līdz vienšūnu šķīdumam šūnas tiek saskaitītas un pārvietotas uz svaigiem kultivēšanas traukiem, lai tās atkārtoti piestiprinātos un vairotos.

Krioprezervācija un atjaunošana

Krioprezervācija ļauj saglabāt dzīvas šūnas, tās sasaldējot zemās temperatūrās. Cilvēka primāro šūnu krioprezervācija un atkausēšana novērš šūnu nāvi un bojājumus uzglabāšanas un lietošanas laikā. Cilvēka primārās šūnas tiek aizsargātas pret kriogēnu iedarbību, izmantojot DMSO vai glicerīnu (pareizā temperatūrā un ar kontrolētu sasaldēšanas ātrumu). Sasaldēšanas procesam jānotiek pakāpeniski, pazeminot temperatūru par -1 °C katru minūti, lai novērstu ledus kristālu veidošanos. Ilgtermiņa uzglabāšanai nepieciešams šķidrais slāpeklis (-196 °C) vai temperatūra zem -130 °C.

Lai atkausētu kriokonservētās šūnas, pietiek ar to iegremdēšanu 37 °C ūdens vannā aptuveni 1–2 minūtes. Cilvēka primārās šūnas nedrīkst centrifugēt pēc izņemšanas no saldētavas (jo tās ir ārkārtīgi jutīgas pret bojājumiem atgūšanās posmā pēc kriokonservācijas). Šo metodi var izmantot šūnu izsēšanai uz šķīvja tūlīt pēc atkausēšanas, un tā veicina šūnu piestiprināšanos kultūrās pirmajās 24 stundās pēc izsēšanas. 1 Pēc tam, kad kriokonservētās primārās šūnas ir piestiprinājušās, izlietotais barotnes šķidrums ir jāizsūc (jo DMSO ir kaitīgs primārajām šūnām un var izraisīt dzīvotspējas samazināšanos pēc atkausēšanas).