Cilvēka primārās šūnas

Kas ir cilvēka primārās šūnas?

Primārās šūnas ir tīrākā attiecīgo audu atveidojums. Tās tiek izolētas no audiem un apstrādātas tā, lai tās varētu iedzīvoties kultūrā ideālos apstākļos. Tās vairāk atdarina in vivo stāvokli un uzrāda normālu fizioloģiju, jo ir iegūtas no audiem, nevis modificētas. Tāpēc tās var kalpot kā noderīgi modeļi šūnu farmakoloģijas, toksikoloģijas un fizioloģijas pētījumiem (tostarp metabolisma, novecošanās un signālu pārneses pētījumiem). Paturiet prātā, ka primārās šūnas ir grūtāk kultivēt un uzturēt nekā nepārtrauktas šūnu līnijas, jo to dzīves ilgums ir īsāks un pēc noteikta šūnu dalīšanās skaita tās pārstāj dalīties (vai noveco). Šūnu signālu ceļu pētījumus sarežģī primāro šūnu, kas iegūtas no donoriem un subkultūru praksē, raksturīgā mainība. Pirms signālu pētījumu uzsākšanas pētnieki bieži veic skrīningu, lai noteiktu, vai šūnas reaģē uz parasti izmantotiem stimuliem. Lai izvairītos no laika un naudas izšķērdēšanas, primārās šūnas pirms skrīninga var stimulēt, lai aktivizētu galvenos signalizācijas ceļus.

Kāpēc izmantot cilvēka primārās šūnas?

Nemortalizētas šūnu līnijas parasti izmanto kā šūnu testu. Lai gan zinātnieki ir atzinuši, ka šūnu līniju izraisītās bioloģiskās izmaiņas var būt kaitīgas, pētot to fizioloģisko nozīmi. Cilvēka primāro šūnu izmantošana uzlabo šūnu kultūru iegūto datu fizioloģisko vērtību, un tās arvien vairāk tiek uzskatītas par svarīgām bioloģisko procesu, slimību attīstības un zāļu izstrādes pētniecībā.

Cilvēka primārās šūnas tiek plaši izmantotas in vitro pētījumos par starpšūnu un intracelulāro komunikāciju, attīstības bioloģiju, vēža, Parkinsona slimības un diabēta pamatmehānismiem, kā arī daudzās citās pirmsklīnisko un pētniecisko bioloģisko pētījumu jomās. Pētnieki jau sen izmanto imortalizētas šūnu līnijas audu funkciju izpētei; tomēr šūnu līnijas ar acīmredzamām mutācijām un hromosomālām anomālijām var nebūt labs normālu šūnu un slimības attīstības agrīnā stadijā labu aizstājējs. Precīzāku konkrēta audu šūnu tipa modeli tagad var iegūt, izmantojot no šiem audiem izolētas cilvēka primārās šūnas, kas tiek uzturētas primāro šūnu kultūru barotnēs un uztura bagātinātājos.

Kas ir primārā šūnu kultūra?

Tā vietā, lai izmantotu imortalizētas šūnu līnijas, primārajā šūnu kultūrā tiek audzētas šūnas tieši no daudzšūnu organisma ārpus ķermeņa. Dažās valstīs, piemēram, Apvienotajā Karalistē, ir juridiski atzīts, ka primārās šūnu kultūras ir reprezentatīvākas in vivo audiem nekā šūnu līnijas. Tomēr primārajām šūnām augšanai ir nepieciešams atbilstošs substrāts un barības vielas, un pēc noteikta dalīšanās reižu skaita tām attīstās senescents fenotips, kas izraisa to pastāvīgu dalīšanās pārtraukšanu. Abi šie faktori pamudina izveidot šūnu līnijas. Gan dabiski imortalizētas primārās šūnas (piemēram, HeLa šūnas), gan mākslīgi imortalizētas primārās šūnas (piemēram, HEK šūnas) var bezgalīgi ilgi kultivēt šūnu kultūrā.

Cilvēka primārās šūnas pēc audu tipiem

Epitēlija šūnas, fibroblasti, keratinocīti, melanocīti, endotēlija šūnas, muskuļu šūnas, imūnšūnas un cilmes šūnas, piemēram, mezenhimālās cilmes šūnas, ir vienas no visbiežāk zinātniskajā pētniecībā izmantotajām cilvēka primārajām šūnām. Pirmkārt, šīs kultūras ir heterogēnas (pārstāv audu šūnu tipu sajaukumu), un tās var uzturēt dzīvas in vitro tikai noteiktu laiku. Transformācija ir in vitro process, kas ļauj manipulēt ar cilvēka primārajām šūnām neierobežotu subkultūru skaitu. Transformācija var notikt dabiski vai arī to var izraisīt ar ķīmiskām vielām vai vīrusiem. Pēc ģenētiskās transformācijas primārā kultūra var dalīties neierobežoti ilgi, veidojot nemortalizētu sekundāro šūnu līniju, ja tai ir pietiekami daudz barības vielu un vietas.

Endotēlija šūnas

Vēža ārstēšana, brūču dzīšana, šūnu signālu izpēte, augstas veiktspējas un augsta satura skrīnings un toksikoloģijas skrīnings ir tikai dažas no jomām, kurās primārās endotēlija šūnas var izmantot kā pētniecības instrumentu.

Keratinocīti

Keratinocītiem, kas iegūti no pieauguša cilvēka ādas epidermas vai jaundzimušā priekšāda, ir būtiska nozīme tādu ādas slimību pētniecībā kā psoriāze un vēzis.

Epitēlija šūnas

Sākot ar vēža pētījumiem un beidzot ar toksikoloģiskiem pētījumiem, primārās epitēlija šūnas ir izrādījušās nenovērtējams resurss organisma dabisko aizsargspēju modelēšanai.

Fibroblasti

Plūripotento cilmes šūnu (iPS) inducēšana un brūču dzīšanas pētījumi ir tikai daži no daudzajiem primāro fibroblastu izmantošanas veidiem.

Imūnšūnas

Perifēro asiņu mononukleārās šūnas, saīsinājumā PBMC, ir asins mononukleārās šūnas ar apaļu šūnu kodolu. Tās galvenokārt ir limfocīti un monocīti, kas imūnās atbildes reakcijas laikā uzņemas svarīgas funkcijas. Perifēro asiņu mononukleārās šūnas bieži izmanto, lai diagnosticētu infekcijas vai noteiktu iespējamo vakcinācijas aizsardzību. Bieži vien izšķiroša nozīme ir T-šūnu mediētās šūnu imūnās atbildes reakcijas izpētei.

Melanocīti

Melanocīti - specializētas ādas šūnas, kas ražo pigmentu melanīnu, - ir noderīgi kā modeļi pētījumiem par tādām tēmām kā brūču dzīšana, toksicitāte, melanoma, ādas reakcija uz ultravioleto (UV) starojumu, ādas slimības un kosmētika.

Cilmes šūnas

Cilmes šūnām ir potenciāls diferencēties dažādos šūnu tipos. Pateicoties to spējai diferencēties, tās sniedz jaunas iespējas cilvēka audu un veselības stāvokļa modelēšanai.

Mezenhīma cilmes šūnas

Mezenhīma cilmes šūnas, pazīstamas arī kā MSC, var iegūt no dažādiem cilvēka avotiem, piemēram, kaulu smadzenēm, taukiem (taukaudi), nabassaites audiem (Vartona želeja) un amnija šķidruma (šķidrums ap augli), un tās var paplašināt in vitro. Šīm pieaugušo stromālajām cilmes šūnām ir spēja attīstīties par dažādiem šūnu tipiem. Daži no šiem šūnu tipiem ir kaulu šūnas, skrimšļa šūnas, muskuļu šūnas, nervu šūnas, ādas šūnas un radzenes šūnas.

Gludās muskuļu šūnas

Dobuļu orgānu iekšpusē primārās gludās muskulatūras šūnas (SMC) izklāj iekšpusi un nodrošina kontraktilitāti. SMC var izmantot ne tikai vēža un citu slimību gadījumā, bet arī hipertensijas fibrozes modelēšanai.

Primārās šūnas un šūnu līnijas

Vai nu spontānu mutāciju rezultātā, kā tas ir transformētās vēža šūnu līnijās, vai tīši pārveidojot, kā tas ir mākslīgi radot vēža gēnus, nepārtrauktas šūnu līnijas ir ieguvušas iespēju bezgalīgi vairoties (immortalized). Parasti nepārtrauktas šūnu līnijas ir uzticamākas un ērtāk izmantojamas nekā primārās šūnas. Tās var paplašināties neierobežoti ilgi un nodrošina ātru piekļuvi būtiskiem datiem. Nepārtraukto šūnu līniju izmantošanai ir daži ierobežojumi, tostarp tas, ka tās ir ģenētiski modificētas/transformētas, kas var izmainīt fizioloģiskās īpašības un neatbilst in vivo stāvoklim, un ka tas var vēl vairāk mainīties laika gaitā, veicot ievērojamu pasāžu.

Panākumi primāro šūnu kultūru jomā

Primārajām šūnām ir slikta reputācija, jo ar tām ir grūti strādāt. Tomēr šis process kļūst vieglāks nekā jebkad agrāk, pateicoties primārās šūnu kultūras attīstībai, komerciālu primāro šūnu pieejamībai ar pilnībā optimizētiem protokoliem un jaunām analīzes metodēm, kas prasa mazāk resursu.

Pāreja no divdimensiju uz trīsdimensiju šūnu kultūrām tiek uzskatīta par nozīmīgu pavērsienu šajā jomā. Divdimensiju kultūrā var tikt vājināta audu specifiskā arhitektūra, šūnu un šūnu mijiedarbība un mehāniskā/bioķīmiskā signalizācija. Tādējādi šo kultūru bioloģiskā vērtība ir ierobežota.

No otras puses, 3D šūnu kultūras ļauj šūnām paplašināties un mijiedarboties ar 3D ārpusšūnu struktūru. Tas ļauj šūnām mijiedarboties savā starpā un ar ārpusšūnu matricu, padarot 3D kultūras fizioloģiski atbilstošākas. Šīs metodes precizitāte in vivo reakciju prognozēšanā ir padarījusi to revolucionāru tādās jomās kā zāļu atklāšana un izstrāde. Tāpēc modernākās tehnoloģijas, piemēram, no pacientiem iegūti organoīdi un orgāni uz mikroshēmas, nodrošina ļoti kontekstuālus modeļus zāļu skrīningam un izstrādei.

Primāro šūnu veidošana ir vāja vieta primārajā kultūrā. Lai to pārvarētu, parasti ir nepieciešams lielāks audu apjoms, un to var būt grūti sasniegt. Tomēr uzlabota analītiskā jutība nodrošina iespēju virzīties uz priekšu. Piemēram, nepieciešamību kultivēt lielu daudzumu primāro šūnu samazina vienas šūnas tehnoloģijas izmantošana, kas ietver sekvenēšanu, Western blotting un masas citometriju.

Daudzsološas primārās šūnu kultūras perspektīvas

Tehnoloģiskā attīstība mazina primārās šūnu kultūras vispārējās grūtības. Savukārt šī metode strauji aizstāj citas metodes kā zelta standarts šūnu un molekulārās bioloģijas pētniecībā un praksē. Vakcīnu ražošana, orgānu aizvietošana, cilmes šūnu terapija, vēža pētījumi un daudz kas cits var gūt lielu labumu no nepārtrauktiem sasniegumiem primāro šūnu kultūru jomā.

Primārās šūnu kultūras padomi un triki

Šūnu paplašināšanas vajadzības

Divas izplatītākās primārās šūnu kultivēšanas metodes ir kultivēšana suspensijā vai uz virsmas (2D). Dažas šūnas var brīvi peldēt asinsritē, nekad nepielipstot pie virsmas (piemēram, no perifērajām asinīm iegūtās šūnas). Dažādas šūnu līnijas ir izstrādātas tā, lai tās varētu attīstīties suspensijas kultūrās, kur tās var sasniegt blīvumu, kas 2D augšanas apstākļos nav sasniedzams. Primārās šūnas, kurām, lai augtu in vitro, ir nepieciešams stiprinājums, sauc par adherentām šūnām, un tās ir arī cietajos audos esošās šūnas. Lai uzlabotu adhēzijas īpašības un piegādātu citus augšanai un diferenciācijai nepieciešamos signālus, šīs šūnas parasti kultivē plakani nepārklātā plastmasas traukā, bet dažkārt arī mikrodaudzējumā. Pēdējais minētais variants var būt pārklāts ar ekstracelulārā matriksa proteīniem (piemēram, kolagēnu un lamīnu). Šūnu kultūrā izmantotā barotne sastāv no pamata barotnes, kas papildināta ar atbilstošiem augšanas faktoriem un citokīniem. Šūnu inkubators ir īpaša veida laboratorijas inkubators, ko izmanto šūnu kultivēšanai un uzturēšanai noteiktā temperatūrā un gāzu maisījumā (parasti 37 °C, 5 % CO2 zīdītāju šūnām). Atkarībā no kultivējamās šūnas tipa optimālie apstākļi var būt ļoti atšķirīgi. Atkarībā no audzējamo šūnu tipa optimālajai barotnei būs unikāla faktoru kombinācija, tostarp, bet ne tikai, pH, glikozes koncentrācija, augšanas faktori un citu barības vielu klātbūtne.

Antibiotikas augšanas barotnē ir ļoti svarīgas primārās kultūras izveides laikā, lai novērstu piesārņojumu no saimnieka audiem. Daži antibiotiku režīmi ietver gentamicīna, penicilīna, streptomicīna un amfotericīna B kombināciju. Tomēr nav ieteicams lietot antibiotikas ilgāku laiku, jo daži reaģenti (piemēram, amfotericīns B) var būt toksiski šūnām ilgtermiņā.

Lielākā daļa primāro šūnu pēc noteikta skaita populācijas dubultojumu pārstāj dalīties, tāpēc ir ļoti svarīgi tās saglabāt dzīvas arī pēc izolēšanas. Lai šūnas ilgstoši būtu dzīvotspējīgas, ir nepieciešamas prasmīgas šūnu kultivēšanas metodes un ideāli kultivēšanas apstākļi (tostarp atbilstoša barotne, atbilstoša temperatūra, atbilstošs gāzu maisījums, atbilstošs pH, atbilstoša augšanas faktoru koncentrācija, barības vielu klātbūtne un glikozes klātbūtne). Tā kā daudzi no barotņu papildināšanai izmantotajiem augšanas faktoriem ir iegūti no dzīvnieku asinīm (no asinīm iegūtajām sastāvdaļām ir iespējama piesārņošana), to lietošanu ieteicams samazināt līdz minimumam vai no tās vispār izvairīties. Svarīgi ir arī izmantot aseptisku tehniku.

Subkultūras un uzturēšana

Kad izolētās šūnas pieķeras kultūras trauka virsmai, tas iezīmē uzturēšanas fāzes sākumu. Piestiprināšanās parasti notiek 24 stundas pēc kultūras uzsākšanas. Šūnas subkultivējamas, kad tās ir sasniegušas noteiktu konfluences procentu un aktīvi replicējas. Tā kā postkonfluentās šūnas pēc izlaišanas var diferencēties un tām var būt lēnāka proliferācija, vislabāk ir subkulturēt primārās šūnu kultūras, pirms tās sasniedz 100 % konfluenci.

Subkulturēšana svaigā barotnē uztur no enkurēšanas atkarīgo šūnu eksponenciālo augšanu. Subkulturizējot monoslāņus, tiek izjaukta šūnu starpslāņa un intracelulārā šūnu virsmas mijiedarbība. Nelielas proteolītisko enzīmu koncentrācijas, piemēram, tripsīnu/EDTA, izmanto, lai no monoslāņiem vai audiem iegūtu adherētas primārās šūnas. Pēc disociēšanas un atšķaidīšanas vienšūnu šķīdumā šūnas saskaita un pārnes uz svaigām kultūru tvertnēm, lai tās atkal pievienotos un vairotos.

Kriokonservēšana un reģenerācija

Kriokonservēšana saglabā dzīvas šūnas, sasaldējot tās zemā temperatūrā. Kriokonservējot un atkausējot cilvēka primārās šūnas, tiek novērsta šūnu bojāeja un bojājumi uzglabāšanas un lietošanas laikā. Cilvēka primārās šūnas krioprotē, izmantojot DMSO vai glicerīnu (pareizā temperatūrā un ar kontrolētu sasaldēšanas ātrumu). Lai novērstu ledus kristālu veidošanos, sasaldēšanas procesam jābūt pakāpeniskam, ar -1 °C temperatūru katru minūti. Ilgstošai uzglabāšanai nepieciešams šķidrais slāpeklis (-196 °C) vai temperatūra zemāka par -130 °C.

Lai atkausētu kriokonservētas šūnas, pietiek, ja tās iegremdē 37 °C ūdens vannā uz aptuveni 1 līdz 2 minūtēm. Cilvēka primārās šūnas pēc atkausēšanas no saldētavas nedrīkst centrifugēt (jo tās ir ļoti jutīgas pret bojājumiem, atgūstot no kriokonservēšanas). Tas ir piemērots šūnu uzsiešanai uzreiz pēc atkausēšanas, un tas veicina piestiprināšanos kultūrās pirmajās 24 stundās pēc uzsiešanas. 1 Pēc tam, kad kriokonservētās primārās šūnas ir pievienojušās, izlietotā barotne ir jāizņem (jo DMSO ir kaitīgs primārajām šūnām un var izraisīt dzīvotspējas samazināšanos pēc atkausēšanas).