Đi tới trang chủ
Giỏ hàng 0,00 €*
Hiển thị tất cả các danh mục Nền tảng sàng lọc GPCR quy mô lớn dựa trên tế bào HEK Quay lại

Nền tảng sàng lọc GPCR quy mô lớn dựa trên tế bào HEK

Receptor liên kết với protein G (GPCR) là gia đình lớn nhất của các protein màng trong bộ gen người và chiếm khoảng 34% tổng số mục tiêu thuốc. Tại Cytion, chúng tôi nhận thức rằng việc phát triển các liệu pháp nhắm mục tiêu GPCR hiệu quả đòi hỏi các nền tảng sàng lọc dựa trên tế bào mạnh mẽ, có khả năng đo lường chính xác sự kích hoạt thụ thể trên hàng nghìn đến hàng triệu hợp chất. Tế bào HEK293 đã trở thành vật chủ ưa thích cho việc biểu hiện và sàng lọc chức năng GPCR, cung cấp sự kết hợp độc đáo giữa biểu hiện thụ thể hiệu quả, nền thụ thể nội sinh thấp và tương thích với nhiều định dạng thử nghiệm.

Điểm chính

  • Tế bào HEK293 cung cấp nền tảng lý tưởng cho biểu hiện GPCR dị hợp với sự can thiệp tối thiểu từ các thụ thể nội sinh
  • Các định dạng thử nghiệm đa dạng—dòng canxi, cAMP, tuyển dụng β-arrestin—cho phép phân tích toàn diện các con đường tín hiệu
  • Các hệ thống xử lý chất lỏng tự động và máy đọc plate cho phép tốc độ sàng lọc vượt quá 100.000 hợp chất mỗi ngày
  • Các chiến lược phát triển dòng tế bào ổn định cân bằng giữa yêu cầu thông lượng và tính nhất quán của thử nghiệm
  • Phát hiện agonism có thiên hướng yêu cầu các kết quả đa dạng trên các con đường tín hiệu khác nhau
Nền tảng sàng lọc cao thông lượng GPCR dựa trên HEK293 Các con đường tín hiệu GPCR GPCR Gαs ↑cAMP Gαq ↑Ca²⁺ β-arr Tuyển dụng Công nghệ thử nghiệm Dòng canxi Fluo-4/Fura-2 FLIPR/Đọc tấm thử nghiệm cAMP HTRF/AlphaScreen GloSensor β-Arrestin PathHunter BRET/NanoBiT Gen báo cáo CRE-Luc NFAT-Luc Quy trình làm việc HTS Gieo tế bào 384/1536 giếng Hợp chất Thêm Phát hiện Đọc kết quả Phân tích Lựa chọn kết quả Ưu điểm của HEK293 trong sàng lọc GPCR Nền thấp Ít nội sinh Biểu hiện GPCR Tín hiệu sạch/tiếng ồn Biểu hiện cao Hiệu quả chuyển gen Nhà điều hòa CMV mạnh 10⁵-10⁶ thụ thể/tế bào Tín hiệu hoàn chỉnh Tất cả các loại G protein Có mặt các protein trung gian Kết nối với con đường tự nhiên Tương thích với thử nghiệm Ổn định trong microplate Thích ứng với môi trường lơ lửng Xử lý tự động Chỉ số thông lượng sàng lọc Định dạng Số giếng/đĩa Hợp chất/Ngày 96 giếng 96 5.000-10.000 384 giếng 384 20.000-50.000 1.536 giếng 1536 100.000-500.000 3456 giếng 3456 500.000-1.000.000+ Phát triển dòng tế bào ổn định 1. Thiết kế vector có dấu hiệu chọn lọc 2. Điện chuyển gen vào tế bào gốc HEK293 3. Lựa chọn kháng sinh (2-4 tuần) 4. Cloning tế bào đơn (FACS/pha loãng giới hạn) 5. Màn hình dòng tế bào cho biểu hiện/chức năng 6. Lưu trữ tế bào và kiểm tra độ ổn định Thời gian thực hiện: 3-6 tháng © Cytion - Hỗ trợ phát hiện thuốc cho thụ thể G protein (GPCR)

Tại sao tế bào HEK293 vượt trội trong sàng lọc GPCR

Tế bào HEK293 đã trở thành tiêu chuẩn thực tế cho các thử nghiệm chức năng GPCR nhờ một số ưu điểm nội tại. Thứ nhất, mức biểu hiện GPCR nội sinh tương đối thấp của chúng giúp giảm thiểu tín hiệu nền có thể làm nhiễu các nghiên cứu về thụ thể ngoại lai. Khác với một số dòng tế bào ung thư có biểu hiện nhiều GPCR ở mức độ có ý nghĩa chức năng, tế bào HEK293 cung cấp một nền tảng sạch sẽ cho việc biểu hiện thụ thể.

Thứ hai, tế bào HEK293 biểu hiện tất cả các phân lớp chính của protein G (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) ở mức đủ để hỗ trợ sự kết hợp đa dạng của thụ thể. Bộ tín hiệu hoàn chỉnh này cho phép nghiên cứu tương tác tự nhiên giữa thụ thể và protein G mà không cần đồng biểu hiện các phân lớp cụ thể của protein G.

Thứ ba, tế bào HEK293 có khả năng chuyển gen hiệu quả bằng nhiều loại thuốc thử, đạt tỷ lệ chuyển gen vượt quá 90%. Hiệu quả này dẫn đến mức biểu hiện thụ thể cao—thường từ 10⁵ đến 10⁶ thụ thể trên mỗi tế bào—cung cấp cửa sổ tín hiệu mạnh mẽ ngay cả đối với các thụ thể có hiệu suất kết hợp khiêm tốn.

Tế bào HEK293T (300189) của chúng tôi có hiệu suất chuyển gen đặc biệt cao cho biểu hiện tạm thời của GPCR, khiến chúng trở thành lựa chọn lý tưởng cho việc đặc trưng thụ thể ban đầu và phát triển thử nghiệm trước khi cam kết tạo dòng tế bào ổn định.

Lựa chọn định dạng thử nghiệm cho sàng lọc GPCR

Thử nghiệm dòng canxi: Các thụ thể kết hợp với Gαq kích hoạt phospholipase C, gây giải phóng canxi từ các kho dự trữ nội bào. Các chất chỉ thị huỳnh quang nhạy cảm với canxi như Fluo-4, Fura-2 hoặc các chỉ thị canxi được mã hóa di truyền cho phép đo lường thời gian thực phản ứng này. Các thiết bị đọc huỳnh quang trên đĩa như FLIPR có thể đo đồng thời các dao động canxi trên toàn bộ đĩa 384 hoặc 1536 giếng, đạt năng suất vượt quá 100.000 điểm dữ liệu mỗi ngày.

thử nghiệm cAMP: Các thụ thể liên kết với Gαs kích thích adenylyl cyclase, làm tăng nồng độ cAMP nội bào, trong khi các thụ thể liên kết với Gαi ức chế sản xuất cAMP. Nhiều công nghệ thử nghiệm phát hiện sự thay đổi cAMP, bao gồm thử nghiệm miễn dịch cạnh tranh (HTRF, AlphaScreen), phương pháp dựa trên biosensor (GloSensor) và thử nghiệm gen báo cáo (CRE-luciferase). Mỗi công nghệ có ưu điểm riêng về độ nhạy, động học và năng suất.

tuyển dụng β-Arrestin: Kích hoạt GPCR kích hoạt quá trình tuyển dụng β-arrestin đến thụ thể, một quá trình có thể đo lường thông qua các xét nghiệm bổ sung protein. Các công nghệ như PathHunter (bổ sung mảnh enzyme) và NanoBiT (luciferase phân tách) cung cấp các kết quả nhạy cảm, độc lập với con đường tín hiệu, áp dụng cho tất cả các loại thụ thể bất kể sở thích kết hợp với protein G.

Thử nghiệm gen báo cáo: Hệ thống báo cáo chuyển mã đo lường các sự kiện tín hiệu hạ lưu, cung cấp khả năng khuếch đại để tăng độ nhạy. Các báo cáo CRE-luciferase phát hiện kích hoạt con đường cAMP, NFAT-luciferase phản ứng với tín hiệu canxi, và SRE-luciferase theo dõi nhiều con đường. Mặc dù chậm hơn so với đo lường trực tiếp các chất trung gian thứ hai, các thử nghiệm gen báo cáo cung cấp tỷ lệ tín hiệu trên nền rất tốt.

Chiến lược phát triển dòng tế bào ổn định

Các chiến dịch sàng lọc quy mô lớn thường yêu cầu dòng tế bào ổn định biểu hiện thụ thể GPCR mục tiêu ở mức độ nhất quán trên hàng tỷ giếng thử nghiệm. Phát triển dòng tế bào ổn định bắt đầu từ thiết kế vector tích hợp cả thụ thể và dấu hiệu chọn lọc, cho phép thuần hóa các tế bào được chuyển gen ổn định.

Dòng tế bào HEK293 (300192) của chúng tôi được sử dụng làm dòng tế bào cha mẹ tiêu chuẩn cho việc tạo ra dòng tế bào ổn định. Sau khi chuyển gen và chọn lọc bằng kháng sinh (thường kéo dài 2-4 tuần), các tế bào sống sót được nhân lên bằng phương pháp phân chia tế bào đơn lẻ thông qua pha loãng giới hạn hoặc phân loại tế bào bằng ánh sáng huỳnh quang (FACS). Các dòng tế bào riêng lẻ sau đó được nhân lên và đặc trưng hóa về mức độ biểu hiện thụ thể, độ mạnh phản ứng chức năng và độ bền vững của thử nghiệm.

Các thuộc tính chất lượng quan trọng cho việc sàng lọc dòng tế bào bao gồm tính ổn định biểu hiện qua nhiều thế hệ, tính nhất quán về dược lý so với tiêu chuẩn tham chiếu và hiệu suất mạnh mẽ trong các định dạng đĩa thu nhỏ. Các ngân hàng tế bào đã được xác nhận nên được thiết lập sớm trong chiến dịch sàng lọc để đảm bảo hiệu suất nhất quán suốt quá trình.

Đối với các thời gian biểu được đẩy nhanh, các tế bào HEK293 EBNA (300264) của chúng tôi cho phép biểu hiện ổn định từ các vectơ episomal, có thể giảm thời gian phát triển trong khi duy trì tính nhất quán trong biểu hiện.

Xem xét về thu nhỏ và tự động hóa

Để tối đa hóa năng suất sàng lọc, cần thu nhỏ quy mô xuống các định dạng 384 giếng, 1536 giếng hoặc thậm chí 3456 giếng. Tế bào HEK293 thích nghi tốt với việc gieo tế bào mật độ cao trong thể tích nhỏ, tuy nhiên có thể cần tối ưu hóa mật độ tế bào, điều kiện gieo tế bào và thời gian ủ cho mỗi lần chuyển đổi định dạng.

Tế bào HEK293 thích nghi với môi trường lơ lửng mang lại lợi thế cho các quy trình sàng lọc tự động. Tế bào HEK293 thích nghi với môi trường lơ lửng (300686) của chúng tôi có thể được phân phối trực tiếp từ bình nuôi cấy vào đĩa thử nghiệm mà không cần xử lý bằng trypsin, giảm các bước thao tác và cải thiện tính nhất quán. Tính tương thích với các thiết bị xử lý chất lỏng tự động cho phép thực hiện các chiến dịch sàng lọc hoàn toàn tự động.

Yêu cầu về độ ổn định của đĩa thử nghiệm thay đổi tùy theo định dạng. Các thử nghiệm dòng canxi thường yêu cầu đo lường trong vòng vài giờ sau khi tải thuốc nhuộm, trong khi các thử nghiệm cAMP và β-arrestin có thể cho phép ủ qua đêm trước khi đọc kết quả. Hiểu rõ các hạn chế này giúp lập kế hoạch logistics và lịch trình thiết bị cho quy trình sàng lọc.

Phân tích dữ liệu và xác định kết quả

Các chiến dịch sàng lọc GPCR tạo ra lượng dữ liệu khổng lồ, đòi hỏi các quy trình phân tích mạnh mẽ. Các thông số thống kê bao gồm Z'-factor, tỷ lệ tín hiệu trên nền và hệ số biến động được sử dụng để đánh giá chất lượng thử nghiệm trên từng đĩa. Các đĩa không đạt ngưỡng chất lượng nên được lặp lại thay vì phân tích.

Tiêu chí xác định hợp chất tiềm năng cân bằng giữa độ nhạy và tỷ lệ dương tính giả. Ngưỡng hoạt động 50% kích hoạt hoặc ức chế so với hợp chất tham chiếu cung cấp điểm khởi đầu hợp lý, mặc dù ngưỡng tối ưu phụ thuộc vào thành phần thư viện và mục tiêu chương trình. Xác nhận phản ứng nồng độ của các hợp chất tiềm năng ban đầu loại bỏ các hiện tượng giả và xếp hạng các hợp chất cho các bước tiếp theo.

Nghiên cứu phát hiện thuốc GPCR hiện đại ngày càng nhấn mạnh vào agonism có chọn lọc—các hợp chất ưu tiên kích hoạt một số con đường tín hiệu hơn các con đường khác. Việc phát hiện các hợp chất có chọn lọc yêu cầu các thử nghiệm song song đo lường nhiều con đường (ví dụ: kích hoạt protein G so với tuyển dụng β-arrestin) với sự chú ý cẩn thận đến độ nhạy và động học của thử nghiệm để tránh sai lệch kỹ thuật.

Sản phẩm được khuyến nghị cho sàng lọc GPCR:

Trang web này sử dụng cookie để đảm bảo bạn có trải nghiệm tốt nhất trên trang web của chúng tôi... Thông tin chi tiết.
- Imprint

Chúng tôi đã phát hiện rằng bạn đang ở một quốc gia khác hoặc đang sử dụng ngôn ngữ trình duyệt khác với ngôn ngữ hiện tại đã chọn. Bạn có muốn chấp nhận các cài đặt được đề xuất không?

Đóng