Màn hình CRISPR trên dòng tế bào: Phân tích chức năng toàn bộ bộ gen

Công nghệ CRISPR-Cas9 đã cách mạng hóa lĩnh vực di truyền học chức năng, cho phép phân tích hệ thống chức năng gen trên toàn bộ bộ gen trong các tế bào nuôi cấy. Tại Cytion, chúng tôi nhận thức rằng các tế bào và dòng tế bào của chúng tôi là nền tảng mạnh mẽ cho các ứng dụng sàng lọc CRISPR, giúp xác định các gen điều khiển các quá trình tế bào đa dạng từ sự phát triển đến kháng thuốc. Các thử nghiệm CRISPR tổng hợp đưa các thư viện chứa hàng nghìn đến hàng trăm nghìn phân tử hướng dẫn RNA (sgRNAs) vào quần thể tế bào, tạo ra các bộ sưu tập khổng lồ nơi mỗi tế bào nhận được một sự can thiệp di truyền khác nhau. Bằng cách áp dụng áp lực chọn lọc và theo dõi các sgRNA nào trở nên phong phú hoặc suy giảm, các nhà nghiên cứu có thể xác định hệ thống các gen thiết yếu cho sự sống còn, gen mang lại khả năng kháng thuốc, hoặc gen điều chỉnh bất kỳ biểu hiện chọn lọc nào. Phương pháp phân tích gen chức năng không thiên vị này đã thúc đẩy quá trình khám phá trong sinh học ung thư, miễn dịch học, bệnh truyền nhiễm và sinh học tế bào cơ bản, biến các tế bào nuôi cấy thành công cụ cho việc khám phá sinh học hệ thống.

Thiết kế và phân phối thư viện CRISPR

Thư viện CRISPR quy mô toàn bộ bộ gen chứa các trình tự sgRNA nhắm vào mọi gen mã hóa protein trong bộ gen, thường có 4-10 trình tự hướng dẫn cho mỗi gen để đảm bảo độ bao phủ mạnh mẽ và bù đắp cho hiệu suất hướng dẫn biến đổi. Thư viện toàn bộ bộ gen người chứa 70.000-100.000 trình tự sgRNA, trong khi các thư viện tập trung nhắm vào các nhóm gen cụ thể như kinase, điều hòa biểu sinh hoặc enzym chuyển hóa cho phép bao phủ sâu hơn với ít cấu trúc tổng thể hơn. Chất lượng thư viện ảnh hưởng quyết định đến thành công của quá trình sàng lọc—các hướng dẫn phải kích hoạt knockout hiệu quả đồng thời tránh các tác động ngoài mục tiêu làm nhiễu loạn kết quả.

Vận chuyển bằng lentivirus vẫn là tiêu chuẩn để đưa thư viện sgRNA vào quần thể tế bào. Lentivirus được trộn chứa toàn bộ thư viện sgRNA nhiễm vào tế bào với tỷ lệ nhiễm thấp (MOI), thường là 0,3-0,5, đảm bảo hầu hết tế bào nhiễm chỉ nhận một cấu trúc sgRNA. Yêu cầu này về một sự can thiệp di truyền trên mỗi tế bào ngăn chặn sự nhiễu loạn từ các tế bào có nhiều đột biến. Sau quá trình chuyển gen, lựa chọn kháng sinh loại bỏ các tế bào không bị nhiễm, tạo ra quần thể tế bào mỗi tế bào mang một sự can thiệp di truyền xác định. Đối với dòng tế bào Cytion, hiệu suất chuyển gen thay đổi tùy theo loại tế bào – tế bào treo thường chuyển gen hiệu quả trong khi một số dòng tế bào bám dính yêu cầu tối ưu hóa nồng độ virus, polybrene và quá trình spinoculation.

Đại diện thư viện — số lượng tế bào chứa mỗi sgRNA — có ảnh hưởng quan trọng đến chất lượng sàng lọc. Các thử nghiệm toàn bộ bộ gen yêu cầu duy trì 500-1000 tế bào cho mỗi sgRNA trong suốt thí nghiệm để tránh mất ngẫu nhiên các hướng dẫn do hiệu ứng lấy mẫu ngẫu nhiên. Đối với thư viện 100.000 sgRNA, điều này đòi hỏi khởi đầu với quần thể 50-100 triệu tế bào và duy trì số lượng tương ứng qua quá trình chọn lọc và nhân giống. Đại diện không đủ gây ra nhiễu làm mờ các kết quả chính xác và tạo ra kết quả dương tính giả do mất ngẫu nhiên.

Màn hình chọn lọc âm tính: Xác định gen thiết yếu

Màn hình chọn lọc âm tính xác định các gen cần thiết cho sự sống còn hoặc phát triển của tế bào trong điều kiện nuôi cấy tiêu chuẩn. Tế bào được chuyển gen bằng thư viện sgRNA, chọn lọc dựa trên tích hợp, sau đó được truyền liên tục trong 2-4 tuần trong khi duy trì đại diện của thư viện. Các sgRNA nhắm vào gen thiết yếu sẽ cạn kiệt khi các tế bào chứa các đột biến này không thể phát triển hoặc chết. So sánh độ phong phú của sgRNA tại thời điểm cuối cùng so với quần thể ban đầu (T0) sẽ cho thấy các gen nào là cần thiết cho sự thích nghi trong điều kiện thí nghiệm.

Các thử nghiệm gen thiết yếu tạo ra bản đồ phụ thuộc đặc trưng cho dòng tế bào, tiết lộ các điểm yếu có thể khai thác cho can thiệp điều trị. Các dòng tế bào ung thư thường phụ thuộc vào các gen ung thư hoặc thành phần đường dẫn không cần thiết cho tế bào bình thường, đại diện cho các mục tiêu điều trị tiềm năng. Ví dụ, các tế bào HeLa có các phụ thuộc đặc trưng vào các gen hỗ trợ sự phát triển nhanh chóng và quản lý sự không ổn định gen. Dự án Bản đồ Phụ thuộc Ung thư đã thực hiện các sàng lọc CRISPR toàn bộ gen trên hàng trăm dòng tế bào ung thư, lập danh mục các phụ thuộc di truyền và liên kết chúng với các đặc điểm gen để dự đoán các điểm yếu cụ thể của bệnh nhân.

Các thử nghiệm về tính thiết yếu cụ thể theo ngữ cảnh so sánh sự phụ thuộc gen giữa các điều kiện hoặc dòng tế bào. Thực hiện các thử nghiệm song song trên tế bào bình thường so với tế bào biến đổi, hoặc trên tế bào có nền tảng di truyền khác nhau, xác định các tương tác chết tổng hợp, nơi việc mất gen chỉ gây chết trong các ngữ cảnh cụ thể. Các sự phụ thuộc cụ thể theo ngữ cảnh này cung cấp các cửa sổ điều trị — nhắm mục tiêu vào các gen thiết yếu trong ung thư nhưng không cần thiết trong mô bình thường giúp giảm độc tính. Đối với các dòng tế bào Cytion đại diện cho các nguồn gốc mô và trạng thái biến đổi đa dạng, các thử nghiệm CRISPR so sánh vẽ bản đồ cấu trúc di truyền của các phụ thuộc tế bào.

Màn hình chọn lọc tích cực: Cơ chế kháng thuốc và sinh tồn

Màn hình chọn lọc tích cực áp dụng áp lực chọn lọc tiêu diệt hầu hết các tế bào, làm giàu cho các sgRNA mang lại sự sống sót hoặc kháng thuốc. Màn hình kháng thuốc điều trị các tế bào bị nhiễm thư viện bằng các liệu pháp ở nồng độ tiêu diệt các tế bào chưa được sửa đổi. Các tế bào sống sót được làm giàu cho các sgRNA làm gián đoạn các mục tiêu thuốc, kích hoạt các con đường kháng thuốc hoặc chặn tín hiệu gây apoptosis. Xác định các gen này tiết lộ cơ chế tác động của thuốc và các cơ chế kháng thuốc tiềm ẩn có thể xuất hiện trong lâm sàng.

Các thử nghiệm kháng độc tố xác định các gen cần thiết cho quá trình hấp thu, kích hoạt hoặc độc tính sau đó của độc tố. Ví dụ, thử nghiệm với độc tố bạch hầu làm giàu các sgRNA nhắm vào thụ thể độc tố và các thành phần vận chuyển màng cần thiết cho quá trình xâm nhập của độc tố. Các thử nghiệm nhạy cảm với tác nhân gây bệnh tiếp xúc tế bào với virus hoặc độc tố vi khuẩn, xác định các yếu tố chủ thể cần thiết cho quá trình nhiễm trùng. Các thử nghiệm này đã vạch ra cơ chế tế bào bị tác nhân gây bệnh khai thác, tiết lộ các mục tiêu điều trị tiềm năng để chặn quá trình nhiễm trùng.

Các thử nghiệm độc lập với yếu tố tăng trưởng nuôi cấy tế bào trong môi trường có nồng độ huyết thanh giảm hoặc loại bỏ yếu tố tăng trưởng cụ thể, xác định các gen mà khi bị gián đoạn cho phép tăng trưởng độc lập với yếu tố tăng trưởng. Các kết quả này thường đại diện cho các gen ức chế khối u hoặc các yếu tố điều hòa âm tính của các con đường tín hiệu tăng trưởng. Hiểu rõ các con đường cho phép tăng trưởng độc lập với yếu tố tăng trưởng làm sáng tỏ các cơ chế tiến triển ung thư và xác định các mục tiêu tiềm năng cho các liệu pháp kết hợp ngăn chặn sự xuất hiện của kháng thuốc.

Màn hình CRISPR dựa trên FACS

Phân loại tế bào bằng ánh sáng huỳnh quang (FACS) cho phép sàng lọc các gen điều chỉnh bất kỳ biểu hiện huỳnh quang nào có thể đo lường được. Các tế bào biểu hiện báo cáo huỳnh quang dưới sự kiểm soát của con đường tín hiệu quan tâm được chuyển gen bằng thư viện sgRNA, sau đó được phân loại dựa trên biểu hiện báo cáo. Các tế bào có biểu hiện báo cáo cao và thấp được thu thập riêng biệt, và độ phong phú của sgRNA được so sánh giữa các quần thể. Các sgRNA được làm giàu xác định các yếu tố điều hòa tích cực (được làm giàu trong quần thể biểu hiện thấp khi bị vô hiệu hóa) và các yếu tố điều hòa tiêu cực (được làm giàu trong quần thể biểu hiện cao khi bị gián đoạn).

Màn hình dấu hiệu bề mặt phân loại tế bào dựa trên nhuộm kháng thể cho các protein bề mặt tế bào. Các màn hình này xác định các yếu tố điều hòa trình bày kháng nguyên, các ligand điểm kiểm soát miễn dịch hoặc các phân tử kết dính. Trong phát triển liệu pháp miễn dịch, các màn hình dựa trên FACS đã xác định các gen điều khiển biểu hiện PD-L1, tiết lộ các con đường có thể nhắm mục tiêu để tăng cường phản ứng liệu pháp miễn dịch. Khả năng phân loại dựa trên biểu hiện protein nội sinh thay vì sử dụng báo cáo được thiết kế mở rộng phạm vi màn hình cho bất kỳ protein nào có kháng thể phù hợp.

FACS đa thông số cho phép phân biệt kiểu hình phức tạp. Đo đồng thời nhiều dấu hiệu xác định các gen ảnh hưởng cụ thể đến các quần thể hoặc trạng thái tế bào nhất định. Ví dụ, phân loại dựa trên kích thước và độ hạt kết hợp với thuốc nhuộm khả năng sống phân biệt tế bào apoptosis với tế bào khỏe mạnh, cho phép sàng lọc các yếu tố điều hòa apoptosis. Hạn chế chính vẫn là thông lượng—các sàng lọc dựa trên FACS yêu cầu nhiều tế bào hơn so với các lựa chọn sống sót đơn giản và gặp giới hạn thực tế về số lượng tế bào có thể phân loại, có thể hạn chế kích thước thư viện hoặc đại diện.

Màn hình CRISPR dựa trên hình ảnh

Kính hiển vi tự động kết hợp với phân tích hình ảnh cho phép sàng lọc các biểu hiện hình thái không thể tiếp cận bằng FACS. Các tế bào bị nhiễm thư viện sgRNA được sắp xếp (một hoặc vài hướng dẫn mỗi giếng) được cố định và chụp ảnh, trích xuất hàng trăm đặc điểm hình thái mỗi tế bào. Học máy phân loại các biểu hiện, xác định các hướng dẫn gây ra những thay đổi hình thái đặc trưng. Khác với các sàng lọc hỗn hợp, định dạng sắp xếp duy trì sự tách biệt không gian của các tác động, cho phép đọc kết quả dựa trên kính hiển vi.

Các thử nghiệm hình thái bào quan xác định các gen điều chỉnh mạng lưới ty thể, cấu trúc Golgi, hình thái nhân hoặc tổ chức cytoskeleton. Các thử nghiệm này đã tiết lộ các cơ chế kiểm soát chất lượng duy trì chức năng bào quan và xác định các gen phối hợp động học bào quan với tiến trình chu kỳ tế bào. Đối với các dòng tế bào Cytion có hình thái được đặc trưng rõ ràng, thử nghiệm dựa trên hình ảnh có thể xác định các biểu hiện tinh tế không thể phát hiện bằng các phương pháp đọc kết quả khác.

Các thử nghiệm hình ảnh tế bào sống theo dõi các quá trình động học như phân chia tế bào, di chuyển hoặc tín hiệu canxi theo thời gian. Hình ảnh thời gian thực của các dòng tế bào knockout mảng cho thấy các gen điều khiển thời gian phân chia, định hướng sợi phân bào hoặc tốc độ và hướng di chuyển. Sự phong phú của dữ liệu hình ảnh đi kèm với chi phí về năng suất—các thử nghiệm mảng kiểm tra ít tác động hơn so với các thử nghiệm tổng hợp, mặc dù các thư viện tập trung vào các gia đình gen cụ thể cân bằng phạm vi bao phủ với các hạn chế thực tế.

Phân tích và Xác minh Kết quả

Sau khi chọn lọc và thu thập mẫu, DNA gen được chiết xuất và vùng sgRNA được khuếch đại bằng PCR với các mồi bao gồm bộ điều chỉnh trình tự. Trình tự sâu định lượng độ phong phú của từng sgRNA, tạo ra số lượng đọc được so sánh giữa các mẫu thí nghiệm và đối chứng. Các công cụ tính toán như MAGeCK, BAGEL hoặc JACKS đánh giá thống kê sự phong phú hoặc suy giảm, tính đến việc kiểm định nhiều giả thuyết trên hàng nghìn gen.

Các kết quả có độ tin cậy cao cho thấy tác động nhất quán trên nhiều sgRNA độc lập nhắm vào cùng một gen. Các gen mà chỉ có một hoặc hai sgRNA cho thấy tác động có thể đại diện cho các tác động ngoài mục tiêu thay vì các kết quả thực sự. Các phương pháp thống kê tổng hợp bằng chứng từ các sgRNA trên mỗi gen, tăng khả năng phát hiện các kết quả thực sự đồng thời giảm các phát hiện sai từ các tác động ngoài mục tiêu của từng sgRNA. Các sgRNA đối chứng nhắm vào các gen thiết yếu đã biết hoặc các đối chứng không nhắm mục tiêu xác nhận hiệu suất của quá trình sàng lọc và hiệu chỉnh ngưỡng thống kê.

Các thí nghiệm xác thực xác nhận các kết quả sàng lọc bằng cách sử dụng sgRNA độc lập hoặc các phương pháp knockout độc lập. Các sgRNA riêng lẻ được nhân bản và thử nghiệm trong dòng tế bào sàng lọc và lý tưởng nhất là trong các dòng tế bào bổ sung để đánh giá tính tái hiện và tính tổng quát. Các thí nghiệm phục hồi tái biểu hiện gen mục tiêu từ cDNA thiếu trình tự mục tiêu của sgRNA xác nhận các tác động đúng mục tiêu. Đối với xác thực mục tiêu điều trị, việc thử nghiệm các kết quả trên các bảng dòng tế bào Cytion đại diện cho các nền tảng di truyền đa dạng xác định các phụ thuộc có tính ứng dụng rộng rãi so với các phụ thuộc cụ thể trong bối cảnh.

Biến thể và các phương pháp sàng lọc nâng cao

Các thử nghiệm CRISPRi và CRISPRa sử dụng Cas9 không hoạt động về mặt xúc tác được gắn với các ức chế hoặc kích hoạt chuyển mã, cho phép ức chế hoặc kích hoạt gen có thể đảo ngược thay vì loại bỏ vĩnh viễn. Các phương pháp này tránh sự nhiễu loạn do mất gen hoàn toàn, mô phỏng sự thay đổi biểu hiện gen thay vì đột biến không hoạt động, và cho phép sàng lọc các yếu tố điều hòa không mã hóa protein. Đối với các gen thiết yếu mà việc loại bỏ gây tử vong, ức chế một phần bằng CRISPRi có thể tiết lộ các biểu hiện phụ thuộc liều lượng và cửa sổ điều trị.

Các thử nghiệm chỉnh sửa cơ sở (base editor) giới thiệu các đột biến điểm chính xác thay vì chèn/xóa, cho phép đột biến hệ thống các miền protein hoặc yếu tố điều hòa. Các thử nghiệm chỉnh sửa Prime hứa hẹn độ chính xác cao hơn, giới thiệu hoặc sửa chữa các đột biến cụ thể. Các thử nghiệm thế hệ tiếp theo này sẽ cho phép phân tích hệ thống mối quan hệ cấu trúc-chức năng của protein và đánh giá các biến thể liên quan đến bệnh tật trên quy mô lớn.

Các thử nghiệm kết hợp sử dụng thư viện dual-sgRNA kiểm tra hệ thống các cặp gen, xác định tương tác di truyền bao gồm chết tổng hợp, ức chế và epistasis. Mặc dù kỹ thuật này thách thức do sự gia tăng phức tạp theo cấp số nhân của thư viện, các thử nghiệm kết hợp vẽ bản đồ mạng lưới di truyền và xác định các chiến lược điều trị kết hợp. Các thử nghiệm kết hợp tập trung vào các cặp gen có thể điều trị bằng thuốc tiết lộ các liệu pháp kết hợp có thể ngăn ngừa kháng thuốc hoặc tăng cường hiệu quả so với điều trị đơn lẻ.

Ứng dụng trong Phát hiện và Phát triển Thuốc

Các thử nghiệm CRISPR đẩy nhanh việc xác định mục tiêu bằng cách kiểm tra hệ thống các gen khi bị gián đoạn sẽ tạo ra các biểu hiện điều trị mong muốn. Các thử nghiệm phụ thuộc vào ung thư xác định các gen thiết yếu cụ thể trong tế bào ung thư, đại diện cho các mục tiêu điều trị tiềm năng. Các thử nghiệm trên tế bào được lấy từ bệnh nhân hoặc các dòng tế bào đồng nhất phân loại các mục tiêu theo bối cảnh di truyền, cho phép các tiếp cận y học chính xác phù hợp với các dấu ấn sinh học của bệnh nhân.

Các nghiên cứu về cơ chế tác động của các hợp chất có mục tiêu chưa biết sử dụng các thử nghiệm CRISPR để xác định các gen gây ra kháng thuốc hoặc nhạy cảm. Nếu việc làm gián đoạn một gen cụ thể gây ra kháng thuốc đối với một hợp chất, gen đó có thể mã hóa mục tiêu hoặc thành phần đường dẫn thiết yếu cho hoạt động của thuốc. Phương pháp này đã làm sáng tỏ cơ chế cho cả các liệu pháp đã được thiết lập và mới, đẩy nhanh phát triển lâm sàng và xác định các dấu ấn sinh học cho việc lựa chọn bệnh nhân.

Các thử nghiệm dự đoán cơ chế kháng thuốc xử lý tế bào bằng liều thuốc không gây chết trong quá trình sàng lọc CRISPR, xác định các gen mà khi bị gián đoạn sẽ gây ra kháng thuốc. Các gen này đại diện cho các cơ chế tiềm năng mà khối u có thể tránh khỏi điều trị, cho phép phát triển các chiến lược kết hợp chặn các con đường kháng thuốc. Đối với các dòng tế bào Cytion mô phỏng các loại ung thư khác nhau, sàng lọc kháng thuốc cung cấp thông tin cho thiết kế thử nghiệm lâm sàng và chiến lược theo dõi bệnh nhân.

Thách thức và Thực hành Tốt nhất

Tác dụng ngoài mục tiêu vẫn là mối quan ngại dù các thuật toán thiết kế sgRNA đã được cải thiện. Một số hướng dẫn cắt các vị trí gen không mong muốn có trình tự tương tự với mục tiêu, có thể gây ra các biểu hiện không liên quan đến sự gián đoạn gen dự định. Sử dụng nhiều hướng dẫn độc lập cho mỗi gen và tổng hợp thống kê giữa các hướng dẫn giúp giảm thiểu vấn đề này. Xác minh các kết quả hàng đầu bằng các phương pháp độc lập xác nhận tác dụng trên mục tiêu.

Động học knockout không hoàn chỉnh hoặc chậm trễ có thể ảnh hưởng đến kết quả sàng lọc. Một số sgRNA cắt không hiệu quả, gây ra sự ức chế một phần thay vì knockout hoàn toàn. Sự ổn định của protein có nghĩa là knockout ở mức DNA/RNA yêu cầu thời gian để protein hiện có phân hủy trước khi các biểu hiện xuất hiện. Các thử nghiệm phải được thực hiện đủ lâu sau khi chọn lọc để đảm bảo loại bỏ hoàn toàn protein, thường là 7-14 ngày tùy thuộc vào thời gian bán hủy của protein mục tiêu và thời gian nhân đôi của tế bào.

Kiểm soát chất lượng sàng lọc bao gồm theo dõi sự đại diện của thư viện, xác nhận hoạt động của Cas9 và xác nhận hành vi dự kiến của các hướng dẫn kiểm soát. Xếp trình tự các quần thể ban đầu xác nhận độ phức tạp và sự đại diện của thư viện. Các hướng dẫn nhắm mục tiêu vào các gen thiết yếu đã biết nên cho thấy sự suy giảm mạnh trong các thử nghiệm chọn lọc âm, trong khi các kiểm soát không nhắm mục tiêu không nên thay đổi đáng kể. Sự lệch khỏi hành vi dự kiến của kiểm soát cho thấy các vấn đề kỹ thuật cần được khắc phục trước khi giải thích kết quả thí nghiệm.

Hướng phát triển tương lai và ứng dụng mở rộng

Perturb-seq kết hợp sàng lọc CRISPR với giải trình tự RNA đơn bào, phân tích phản ứng transcriptomic đối với hàng nghìn sự can thiệp di truyền đồng thời. Phương pháp này vẽ bản đồ cách các sự gián đoạn gen lan truyền qua các mạng lưới phân tử, tiết lộ các mối quan hệ điều hòa và cấu trúc đường dẫn. Đối với các dòng tế bào Cytion, dữ liệu Perturb-seq cung cấp đặc trưng chức năng toàn diện, bổ sung cho các phương pháp sàng lọc truyền thống.

Sàng lọc CRISPR in vivo mở rộng sàng lọc theo nhóm sang các mô hình động vật, xác định các gen điều khiển sự phát triển khối u, di căn hoặc phản ứng với liệu pháp miễn dịch trong các bối cảnh sinh lý học có liên quan. Các tế bào bị nhiễm thư viện được cấy vào chuột, và khối u được thu hoạch để định lượng sgRNA. Các gen được tăng cường trong khối u phát triển đại diện cho các yếu tố thúc đẩy sự thích nghi in vivo có thể bị bỏ qua bởi các sàng lọc trong nuôi cấy tế bào. Các phương pháp này cầu nối giữa các nghiên cứu dòng tế bào và ứng dụng lâm sàng.

Đối với Cytion và cộng đồng nuôi cấy tế bào, sàng lọc CRISPR đã biến các dòng tế bào từ các mô hình thí nghiệm thụ động thành các công cụ khám phá chủ động. Việc phân tích chức năng hệ thống được cho phép bởi sàng lọc toàn bộ bộ gen tiếp tục tiết lộ các nguyên lý sinh học cơ bản và cơ hội điều trị, củng cố vị trí của tế bào nuôi cấy như các công cụ không thể thiếu cho nghiên cứu sinh học hiện đại và phát triển thuốc.