In ấn sinh học với dòng tế bào: Từ cấu trúc mô in 2D đến 3D

In 3D là công nghệ đột phá cho phép đặt chính xác các tế bào sống, vật liệu sinh học và phân tử sinh hoạt trong không gian để tạo ra các cấu trúc mô có kiến trúc xác định, tái tạo tổ chức mô tự nhiên. Tại Cytion, chúng tôi nhận thức rằng các dòng tế bào đã được thiết lập mang lại nhiều ưu điểm so với tế bào nguyên thủy trong ứng dụng in 3D, bao gồm khả năng mở rộng không giới hạn, hành vi được đặc trưng rõ ràng, chất lượng ổn định và giảm thiểu các hạn chế đạo đức. Việc chuyển đổi từ nuôi cấy lớp đơn hai chiều truyền thống sang các cấu trúc in sinh học ba chiều sử dụng tế bào và dòng tế bào yêu cầu xem xét cẩn thận về công thức mực sinh học, phương pháp in, phản ứng của tế bào với stress cơ học trong quá trình đặt và các quy trình trưởng thành sau in. Phương pháp sản xuất tiên tiến này cho phép tạo ra các mô hình mô phức tạp cho sàng lọc thuốc, mô phỏng bệnh tật và nghiên cứu sinh học cơ bản với sự kiểm soát chưa từng có về thành phần tế bào, tổ chức không gian và các đặc điểm vi cấu trúc.

Công thức bioink và tính chất rheological

Công thức của bioink là yếu tố quan trọng nhất quyết định thành công của in sinh học, đòi hỏi sự cân bằng cẩn thận giữa các đặc tính in, tương thích với tế bào và tính toàn vẹn cấu trúc sau khi in. Bioink lý tưởng thể hiện hành vi giảm độ nhớt khi chịu lực cắt, với độ nhớt giảm khi chịu lực cắt trong quá trình ép đùn, sau đó phục hồi nhanh chóng khi lắng đọng để duy trì độ chính xác của cấu trúc in. Độ nhớt thường dao động từ 30 đến 6×10⁷ mPa·s tùy thuộc vào phương pháp in, với các hệ thống dựa trên ép đùn yêu cầu độ nhớt cao hơn (≥1000 mPa·s) để duy trì hình dạng so với các phương pháp in phun mực cần độ nhớt thấp (3-12 mPa·s) để hình thành giọt. Nồng độ tế bào trong bioink thường dao động từ 1×10⁶ đến 2×10⁷ tế bào trên mililit, cân bằng giữa mật độ tế bào đủ để hình thành mô và nguy cơ tắc nghẽn vòi in cũng như độ nhớt vật liệu quá cao. Các vật liệu nền phổ biến của bioink bao gồm alginate, gelatin, gelatin methacrylate (GelMA), axit hyaluronic và agarose, thường được kết hợp trong các công thức đa thành phần để tối ưu hóa tính chất cơ học, động học phân hủy và hoạt tính sinh học. Đối với các tế bào và dòng tế bào của Cytion, việc tối ưu hóa thành phần bioink dựa trên thực nghiệm là cần thiết để đáp ứng yêu cầu bám dính đặc thù của từng loại tế bào và độ nhạy cảm với ứng suất cơ học trong quá trình in.

Hệ thống in sinh học dựa trên ép đùn

In sinh học dựa trên ép đùn là công nghệ được áp dụng rộng rãi nhất do chi phí thiết bị tương đối thấp, tương thích với bioink có độ nhớt cao và mật độ tế bào cao, cũng như khả năng mở rộng để sản xuất các cấu trúc có kích thước centimet. Các hệ thống này phân phối các sợi liên tục của vật liệu chứa tế bào qua các vòi phun hình trụ có đường kính từ 100 đến 500 micromet, với quá trình lắng đọng được điều khiển bằng áp suất khí nén, chuyển động cơ học bằng vít hoặc cơ chế piston. Áp lực cắt mà tế bào trải qua trong quá trình ép qua vòi phun là mối quan tâm chính, với cường độ phụ thuộc vào đường kính vòi phun, áp suất áp dụng và độ nhớt của bioink theo nguyên lý cơ học chất lỏng. Tế bào trải qua ứng suất cắt đỉnh tại thành vòi phun, có thể gây tổn thương màng tế bào, giảm khả năng sống sót và thay đổi biểu hiện gen nếu quá mức. Việc tối ưu hóa yêu cầu cân bằng giữa đường kính vòi phun và áp suất ép để đạt được độ phân giải mong muốn đồng thời duy trì khả năng sống sót của tế bào thường trên 80%. Khả năng in sinh học đa vật liệu cho phép lắng đọng đồng thời hoặc tuần tự các loại tế bào và vật liệu khác nhau, hỗ trợ tạo ra các cấu trúc mô dị thể với thành phần được định nghĩa không gian. Cấu hình vòi phun đồng trục cho phép in trực tiếp các cấu trúc ống rỗng hữu ích cho quá trình mạch máu hóa, với vật liệu lõi sau đó được loại bỏ để tạo ra các lumen thông thoáng được lót bằng tế bào nội mô.

Inkjet và in sinh học dựa trên giọt

Công nghệ in sinh học bằng mực phun được phát triển từ hệ thống in tài liệu thương mại cho phép đặt chính xác các giọt chứa tế bào có thể tích picoliter, cung cấp khả năng tạo mẫu không gian độ phân giải cao và tốc độ in nhanh phù hợp cho các ứng dụng có sản lượng cao. Hệ thống in mực phun nhiệt tạo ra bong bóng hơi thông qua các yếu tố gia nhiệt điện trở, tạo ra các xung áp suất để phun giọt từ đầu in, trong khi hệ thống piezoelectric sử dụng biến dạng do điện áp gây ra trên các tinh thể piezoelectric để tạo ra sóng âm đẩy giọt. Lo ngại về tính khả thi của tế bào ban đầu đã hạn chế việc áp dụng các phương pháp in phun nhiệt do sự tăng nhiệt độ tạm thời, nhưng các hệ thống được tối ưu hóa cho thấy tổn thương nhiệt tối thiểu với nhiệt độ được duy trì dưới ngưỡng критический và thời gian tiếp xúc giới hạn trong microgiây. Hệ thống piezoelectric tránh được stress nhiệt nhưng yêu cầu điều chỉnh cẩn thận các thông số âm thanh để cân bằng độ tin cậy hình thành giọt với stress cơ học lên tế bào. Độ nhớt của bioink cho hệ thống in phun phải duy trì dưới khoảng 12 mPa·s để cho phép hình thành giọt, giới hạn các lựa chọn vật liệu so với các phương pháp dựa trên ép đùn và thường yêu cầu liên kết chéo sau khi lắng đọng để đạt được độ ổn định cấu trúc. Độ chính xác cao và năng suất của in phun sinh học khiến nó đặc biệt phù hợp cho các ứng dụng yêu cầu các mẫu không gian được định nghĩa của nhiều loại tế bào, chẳng hạn như mô hình đồng nuôi cấy hoặc tạo gradient cho sàng lọc thuốc sử dụng tế bào HeLa và các dòng tế bào đã được thiết lập khác.

Inkjet sinh học hỗ trợ laser và tạo mẫu độ phân giải cao

In ấn sinh học hỗ trợ laser (LAB), còn được gọi là chuyển giao laser hướng về phía trước, đạt được độ phân giải không gian cao nhất trong các công nghệ in ấn sinh học, cho phép lắng đọng các tế bào đơn lẻ hoặc nhóm tế bào nhỏ với độ chính xác ở cấp độ micromet. Hệ thống LAB bao gồm nguồn laser xung, một tấm cho tế bào được phủ vật liệu hấp thụ năng lượng và mực sinh học chứa tế bào, cùng với một tấm nhận được đặt gần tấm cho tế bào. Các xung laser tập trung làm bay hơi lớp hấp thụ năng lượng, tạo ra các bong bóng áp suất cao đẩy các giọt chứa tế bào từ tấm cho lên tấm nhận với kiểm soát không gian chính xác. Độ phân giải từ 10-50 micromet và tỷ lệ sống sót của tế bào vượt quá 95% có thể đạt được với các thông số tối ưu, vượt trội so với các phương pháp in sinh học khác. Tính chất không có vòi phun của LAB loại bỏ ứng suất cắt liên quan đến quá trình ép đùn và ngăn chặn các vấn đề tắc nghẽn thường gặp trong các hệ thống có vòi phun khi in các hỗn hợp tế bào có độ nhớt cao hoặc mật độ cao. Tuy nhiên, các hệ thống LAB yêu cầu thiết bị quang học phức tạp và tối ưu hóa cẩn thận các thông số laser bao gồm bước sóng, thời gian xung, mật độ năng lượng và kích thước điểm tiêu cự để cân bằng độ tin cậy in với tỷ lệ sống sót của tế bào. Khả năng in tế bào với độ phân giải đơn tế bào khiến LAB đặc biệt hữu ích cho các ứng dụng yêu cầu tổ chức không gian chính xác, như nuôi cấy chung neuron-glia hoặc nghiên cứu tín hiệu tế bào-tế bào ở khoảng cách xác định.

Stereolithography (SLA) và Digital Light Processing (DLP)

Stereolithography (SLA) và Digital Light Processing (DLP) trong in sinh học sử dụng quá trình quang trùng hợp từng lớp của hydrogel chứa tế bào có khả năng quang trùng hợp để nhanh chóng tạo ra các cấu trúc ba chiều phức tạp với độ phân giải từ 25-100 micromet. Khác với các phương pháp dựa trên lắng đọng xây dựng cấu trúc thông qua việc đặt vật liệu theo thứ tự, các phương pháp dựa trên ánh sáng liên kết chéo toàn bộ lớp cùng lúc, giảm đáng kể thời gian sản xuất cho các hình học phức tạp. Hệ thống DLP chiếu các mẫu ánh sáng tương ứng với toàn bộ mặt cắt lớp bằng mảng gương vi mô kỹ thuật số, trong khi hệ thống SLA quét tia laser tập trung để vẽ các mẫu lớp, với DLP thường cung cấp tốc độ in nhanh hơn. Mực sinh học có thể liên kết quang học chứa các chất khởi động quang học tạo ra các loài phản ứng khi tiếp xúc với ánh sáng, kích hoạt quá trình polymer hóa hoặc liên kết chéo của các tiền chất hydrogel như gelatin methacrylate, polyethylene glycol diacrylate hoặc hyaluronic acid methacrylate. Sự sống còn của tế bào phụ thuộc quan trọng vào nồng độ chất khởi động quang học, cường độ ánh sáng và thời gian tiếp xúc, vì các loài oxy phản ứng được tạo ra trong quá trình khởi động quang học có thể gây hại cho các thành phần tế bào. Các hệ thống tối ưu hóa đạt được độ sống sót sau in từ 75-95% thông qua việc sử dụng chất khởi động quang tương thích với tế bào (lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate), nồng độ chất khởi động quang thấp (0,05-0,5%) và thời gian tiếp xúc ánh sáng được tối thiểu hóa. Khả năng sản xuất nhanh chóng các mạng lưới mạch máu phức tạp và cấu trúc mô tinh vi khiến SLA/DLP đặc biệt hứa hẹn cho các ứng dụng organ-on-chip và công nghệ mô, mặc dù yêu cầu các vật liệu quang liên kết tương thích và quản lý cẩn thận động học quang trùng hợp.

Quá trình trưởng thành sau in và tối ưu hóa nuôi cấy

Các cấu trúc sinh học được in 3D ngay sau khi sản xuất thường có tương tác tế bào-tế bào hạn chế, lắng đọng ma trận ngoại bào tối thiểu và các đặc tính cơ học chủ yếu do vật liệu bioink quyết định chứ không phải đặc tính của mô sinh học. Quá trình nuôi cấy sau in là cần thiết để cho phép tế bào lan rộng từ hình dạng ban đầu là hình cầu, thiết lập các liên kết tế bào-tế bào, tiết và tổ chức ma trận ngoại bào nội sinh, và phát triển các chức năng đặc trưng của mô. Thời gian nuôi cấy yêu cầu dao động từ vài ngày đến vài tuần tùy thuộc vào loại tế bào, độ phức tạp của cấu trúc và ứng dụng dự định, với các tế bào hoạt động chuyển hóa thường yêu cầu thay đổi môi trường nuôi cấy thường xuyên hơn để ngăn ngừa cạn kiệt dinh dưỡng và tích tụ chất chuyển hóa. Bổ sung các yếu tố tăng trưởng, hormone và các phân tử sinh học khác đặc hiệu cho mô vào môi trường nuôi cấy có thể thúc đẩy quá trình trưởng thành và nâng cao đặc tính chức năng, mặc dù yêu cầu cụ thể phụ thuộc vào loại tế bào và biểu hiện mong muốn. Kích thích cơ học thông qua dòng chảy, kéo giãn tuần hoàn hoặc nén ép thúc đẩy quá trình trưởng thành và phát triển chức năng của các loại tế bào nhạy cảm với cơ học, mô phỏng điều kiện tải trọng sinh lý. Đối với các bioink chứa thành phần phân hủy sinh học, sự tiến triển theo thời gian của các đặc tính cơ học phản ánh cả quá trình phân hủy ma trận và tích tụ ma trận do tế bào tiết ra, đòi hỏi sự cân bằng cẩn thận giữa tốc độ phân hủy và tốc độ lắng đọng ma trận. Theo dõi quá trình trưởng thành thông qua đánh giá hình thái, phân tích biểu hiện gen và các thử nghiệm chức năng cho phép tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy và xác định thời điểm thích hợp để tiến hành các thử nghiệm thí nghiệm trên các mô in sinh học.

Ứng dụng trong sàng lọc thuốc và mô hình hóa bệnh tật

Các cấu trúc mô in sinh học sử dụng các dòng tế bào đã được thiết lập từ danh mục của Cytion cung cấp các nền tảng mạnh mẽ cho sàng lọc hợp chất dược phẩm và mô hình hóa bệnh tật với tính liên quan sinh lý cao hơn so với các văn hóa hai chiều truyền thống. Khả năng kiểm soát chính xác thành phần tế bào, tổ chức không gian và các đặc điểm vi kiến trúc cho phép nghiên cứu hệ thống các mối quan hệ cấu trúc-chức năng và tạo ra các mô hình mô có thể tái tạo phù hợp cho các quy trình sàng lọc quy mô lớn. Các mô hình ung thư được in sinh học với các dòng tế bào ung thư, tế bào sợi mô liên kết và tế bào nội mô trong các bố cục không gian xác định tái tạo tốt hơn các đặc điểm của môi trường vi mô ung thư, bao gồm gradient thiếu oxy, sự thâm nhập thuốc không đồng đều và tương tác giữa mô liên kết và khối u ảnh hưởng đến phản ứng điều trị. Các mô hình mô gan tích hợp các dòng tế bào gan trong các cấu trúc xác định cho thấy sự biểu hiện cytochrome P450 và chức năng chuyển hóa được cải thiện so với các mô hình nuôi cấy truyền thống, nâng cao độ chính xác dự đoán trong sàng lọc độc tính gan. Các mô hình mô thần kinh được in sinh học với tổ chức chính xác giữa neuron và tế bào glia cho phép nghiên cứu cơ chế bệnh lý thoái hóa thần kinh và sàng lọc các hợp chất bảo vệ thần kinh. Ưu điểm về tính tái hiện của in sinh học so với các mô hình ba chiều được tạo thủ công giúp tiêu chuẩn hóa quy trình, điều cần thiết cho việc chấp thuận quy định và tích hợp vào các quy trình phát triển dược phẩm. Tuy nhiên, việc xác minh kết quả so với các kết quả in vivo vẫn là yếu tố quan trọng để xác lập độ tin cậy của khả năng dự đoán.