Hệ thống không tế bào cho sản xuất protein: Ưu điểm so với tế bào sống

Sản xuất protein không tế bào (CFPS) là một phương pháp cách mạng trong việc sản xuất protein ngoài môi trường phức tạp của tế bào sống, bằng cách sử dụng các thành phần tế bào được tách chiết trong các hỗn hợp phản ứng được tối ưu hóa. Tại Cytion, mặc dù chuyên môn cốt lõi của chúng tôi tập trung vào tế bào sống và dòng tế bào, chúng tôi nhận thức rằng các hệ thống không tế bào bổ sung cho các phương pháp dựa trên tế bào bằng cách cung cấp những ưu điểm độc đáo cho các ứng dụng cụ thể. Các hệ thống này giải phóng sản xuất protein khỏi các hạn chế về tính khả thi của tế bào, các con đường điều hòa và rào cản màng, cho phép tổng hợp protein độc hại, tích hợp axit amin không tự nhiên, thử nghiệm nhanh các cấu trúc gen và sản xuất trong điều kiện tài nguyên hạn chế. Việc hiểu rõ khi nào nên sử dụng hệ thống không tế bào so với nuôi cấy tế bào truyền thống đòi hỏi phải đánh giá đúng điểm mạnh và hạn chế của từng phương pháp.

Nguyên lý của tổng hợp protein không tế bào

Hệ thống CFPS chứa các thành phần tế bào tối thiểu cần thiết cho tổng hợp protein: ribosome, yếu tố dịch mã, enzym tổng hợp aminoacyl-tRNA, tRNA, axit amin, nguồn năng lượng (ATP, GTP) và hệ thống tái tạo năng lượng. Các thành phần này thường được chuẩn bị dưới dạng dịch tế bào từ vi khuẩn (E. coli), sinh vật nhân thực (hạt lúa mì, tế bào lưới thỏ, tế bào côn trùng hoặc tế bào động vật có vú) hoặc tái tạo từ các thành phần tinh khiết (hệ thống PURE). Khi được cung cấp khuôn DNA hoặc mRNA mã hóa protein mục tiêu, các hệ thống này tổng hợp protein thông qua các cơ chế cơ bản tương tự như tế bào sống nhưng không cần duy trì sự cân bằng nội môi tế bào, tính toàn vẹn màng hoặc các mạng lưới điều hòa. Sự đơn giản hóa này vừa là hạn chế (thiếu các chức năng tế bào) vừa là ưu điểm (loại bỏ sự phức tạp không mong muốn).

Các loại hệ thống không tế bào

Hệ thống không tế bào vi khuẩn, chủ yếu dựa trên dịch chiết E. coli, cung cấp năng suất cao, chi phí thấp và khả năng tối ưu hóa rộng rãi. Tuy nhiên, chúng thiếu các sửa đổi sau dịch mã của tế bào eukaryotic và có thể không gấp nếp đúng cách các protein eukaryotic phức tạp. Dịch chiết mầm lúa mì cung cấp bộ máy dịch mã eukaryotic với hoạt tính nuclease và protease thấp, rất thích hợp để sản xuất protein nguyên vẹn. Dịch chiết tế bào reticulocyte thỏ, giàu các yếu tố dịch mã, xuất sắc trong việc sản xuất lượng nhỏ protein có hoạt tính cao. Dịch chiết tế bào động vật có vú (HeLa, CHO hoặc HEK293) tương thích nhất với cơ chế tế bào người, hỗ trợ quá trình gấp nếp và sửa đổi chính xác. Hệ thống PURE, được tái tạo từ các thành phần tinh khiết của E. coli, cung cấp kiểm soát hoàn toàn về thành phần nhưng yêu cầu chuyên môn cao để chuẩn bị và tối ưu hóa. Lựa chọn giữa các hệ thống này phụ thuộc vào yêu cầu của protein mục tiêu và ứng dụng.

Ưu điểm: Tốc độ và Năng suất

Hệ thống không tế bào tổng hợp protein trong vòng vài phút đến vài giờ, so với hàng ngày cần thiết cho biểu hiện dựa trên tế bào bao gồm biến đổi, chọn lọc thuộc địa, nuôi cấy và kích thích. Tốc độ này cho phép các ứng dụng có năng suất cao: sàng lọc hàng trăm biến thể protein, thử nghiệm các cấu trúc biểu hiện khác nhau hoặc tối ưu hóa các codon và yếu tố điều hòa. Đối với các ứng dụng nghiên cứu yêu cầu thiết kế nhanh, sự tiết kiệm thời gian này là đột phá. Các thư viện lớn các biến thể protein có thể được sản xuất song song trong định dạng microplate, cho phép các nghiên cứu hệ thống về cấu trúc-chức năng hoặc các chiến dịch sàng lọc kháng thể mà sẽ không thực tế nếu sử dụng các phương pháp dựa trên tế bào. Việc loại bỏ các bước cloning, biến đổi và nuôi cấy làm giảm đáng kể thời gian từ gen đến protein.

Ưu điểm: Protein độc hại và khó sản xuất

Một số protein không thể sản xuất trong tế bào sống vì chúng làm gián đoạn các quá trình tế bào thiết yếu. Các protein màng gây vỡ tế bào, protease phân hủy protein tế bào, yếu tố chuyển mã can thiệp vào biểu hiện gen, hoặc protein kích hoạt apoptosis đều đặt ra thách thức cho sản xuất dựa trên tế bào. Hệ thống không tế bào hoàn toàn tránh được những vấn đề này — không có tế bào nào bị tiêu diệt. Tương tự, các protein có xu hướng kết tụ hoặc biến dạng có thể được sản xuất trong hệ thống không tế bào với điều kiện được điều chỉnh (tiềm năng oxy hóa khử được điều chỉnh, chaperone cụ thể hoặc nhiệt độ thay đổi) mà không tương thích với sự sống còn của tế bào. Khả năng này mở rộng không gian protein có thể tiếp cận vượt ra ngoài những gì tế bào sống có thể sản xuất.

Ưu điểm: Tích hợp axit amin không tự nhiên

Hệ thống không tế bào cho phép tích hợp dễ dàng các axit amin không tự nhiên, nhãn huỳnh quang, chất liên kết chéo hoặc nhãn đồng vị cho các nghiên cứu cấu trúc. Bằng cách loại bỏ một axit amin tự nhiên khỏi phản ứng và thay thế bằng một analog, các nhà nghiên cứu có thể thay thế axit amin một cách cụ thể hoặc toàn diện. Cách tiếp cận này cho phép gắn nhãn protein mà không cần hệ thống mã hóa di truyền, sản xuất protein có tính chất mới (độ ổn định cao hơn, khả năng liên kết chéo bằng ánh sáng, các chỉ thị quang phổ) hoặc chuẩn bị protein được gắn nhãn đồng vị cho nghiên cứu NMR mà không cần môi trường nuôi cấy đắt tiền có gắn nhãn đồng vị. Tính mở của phản ứng không tế bào khiến các sửa đổi này đơn giản hơn nhiều so với trong tế bào sống, nơi các rào cản màng và phức tạp chuyển hóa tạo ra trở ngại.

Ưu điểm: Điều chỉnh trực tiếp điều kiện phản ứng

Tính khả dụng của phản ứng không tế bào cho phép tối ưu hóa không thể thực hiện trong tế bào. Các nhà nghiên cứu có thể điều chỉnh trực tiếp pH, độ mạnh ion, tiềm năng oxy hóa-khử, nồng độ ion kim loại hoặc nhiệt độ mà không cần xem xét tính khả thi của tế bào. Các chất xúc tác gấp nếp, chaperone hoặc đồng yếu tố cụ thể có thể được thêm vào với nồng độ chính xác. Đối với protein có liên kết disulfide, cân bằng oxy hóa-khử có thể được điều chỉnh chính xác bằng cách thêm các tỷ lệ cụ thể của glutathione đã khử và đã oxy hóa. Đối với metalloprotein, các ion kim loại phù hợp có thể được bổ sung. Mức độ kiểm soát này đối với môi trường sinh hóa cho phép tối ưu hóa năng suất và gấp protein đúng cách cho các mục tiêu khó khăn không thành công trong môi trường tế bào tiêu chuẩn.

Hạn chế: Các sửa đổi sau dịch mã

Một hạn chế chính của hệ thống không tế bào là sự thiếu hụt hoặc không hoàn chỉnh của các sửa đổi sau dịch mã. Chiết xuất vi khuẩn thiếu hệ thống glycosyl hóa, hệ thống phosphoryl hóa và nhiều sửa đổi eukaryotic khác. Ngay cả chiết xuất eukaryotic cũng có thể có hiệu suất sửa đổi thấp hơn so với tế bào sống. Đối với các protein yêu cầu glycosyl hóa, phosphoryl hóa hoặc các sửa đổi khác để hoạt động, điều này là vấn đề. Các giải pháp một phần tồn tại: dịch mã đồng thời với microsome màng (vesicle có nguồn gốc từ ER) cho phép một số glycosylation và tích hợp màng; bổ sung kinase cụ thể cho phép phosphoryl hóa; các phương pháp liên kết hóa học có thể thêm sửa đổi sau tổng hợp. Tuy nhiên, đối với các protein yêu cầu các sửa đổi phức tạp, trưởng thành, tế bào sống—đặc biệt là tế bào động vật có vú sản xuất protein người chính xác—vẫn ưu việt hơn.

Hạn chế: Khả năng mở rộng và Chi phí

Hệ thống không tế bào thường hoạt động ở quy mô nhỏ (từ microliters đến milliliters), sản xuất lượng protein từ microgram đến milligram. Mặc dù đủ cho nhiều ứng dụng nghiên cứu, điều này vẫn thua xa so với nuôi cấy tế bào sống, vốn thường được mở rộng lên hàng trăm liters và sản xuất lượng protein tính bằng gram. Chi phí hóa chất cho phản ứng không tế bào cao do các thành phần đắt đỏ (nucleotide, axit amin, hệ thống tái tạo năng lượng), khiến sản xuất quy mô lớn không kinh tế. Đối với các ứng dụng yêu cầu lượng protein lớn—sản xuất thuốc, nghiên cứu cấu trúc cần lượng lớn, hoặc enzyme công nghiệp—vi sinh vật sống vẫn là lựa chọn kinh tế hơn nhiều. Hệ thống không tế bào phù hợp hơn cho các ứng dụng quy mô nhỏ, đa dạng cao thay vì sản xuất hàng loạt.

Hạn chế: Ổn định và tích tụ protein

Trong tế bào sống, protein có thể tích tụ với nồng độ cao trong tế bào, được tiết ra vào môi trường nuôi cấy hoặc hình thành các thể bao ổn định để tinh chế sau này. Các phản ứng không tế bào thiếu sự phân chia này, và protein tổng hợp vẫn ở trong hỗn hợp phản ứng thô cùng với tất cả các cơ chế tế bào, enzyme phân hủy và tạp chất. Điều này có thể dẫn đến phân hủy proteolytic theo thời gian. Việc tổng hợp kéo dài yêu cầu các cấu hình dòng chảy liên tục hoặc thẩm tách để cung cấp chất dinh dưỡng và loại bỏ sản phẩm thải, làm tăng độ phức tạp. Quá trình tinh chế từ phản ứng không tế bào có thể đơn giản (sử dụng thẻ liên kết) nhưng vật liệu ban đầu thường loãng và phức tạp hơn so với chiết xuất tế bào, có thể làm giảm năng suất sau khi tinh chế.

Ứng dụng trong Sinh học Tổng hợp và Kỹ thuật Chuyển hóa

Hệ thống không tế bào là nền tảng tuyệt vời để thiết kế thử nghiệm các mạch di truyền tổng hợp trước khi triển khai vào tế bào sống. Các nhà nghiên cứu có thể kiểm tra các trình tự khởi động, vị trí gắn ribosome, yếu tố điều hòa và thiết kế mạch di truyền trong vài giờ thay vì vài ngày, đẩy nhanh đáng kể chu trình thiết kế-xây dựng-kiểm tra. Sự vắng mặt của quá trình chuyển hóa tế bào loại bỏ các tác động nhiễu từ mạng lưới điều hòa tự nhiên, cho phép hiểu rõ hơn về hành vi của các thành phần tổng hợp. Các con đường chuyển hóa đa enzym có thể được tái tạo in vitro, cho phép tối ưu hóa tỷ lệ enzym, điều kiện phản ứng và hệ thống tái chế đồng yếu tố trước khi tích hợp các con đường này vào tế bào sống. Việc thử nghiệm không tế bào này giảm thiểu quá trình thử và sai truyền thống trong công nghệ chuyển hóa.

Ứng dụng trong Sinh học Cấu trúc

Các nhà sinh học cấu trúc sử dụng hệ thống không tế bào để sản xuất protein có gắn nhãn cho phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) hoặc tinh thể học tia X. Việc gắn nhãn đồng vị chọn lọc hoặc đồng nhất (¹⁵N, ¹³C, ²H) có thể dễ dàng đạt được bằng cách sử dụng axit amin có gắn nhãn trong phản ứng không tế bào, tránh việc sử dụng môi trường nuôi cấy có gắn nhãn đồng vị đắt tiền. Đối với các protein màng nổi tiếng khó sản xuất trong tế bào, các hệ thống không tế bào được bổ sung micelle chất tẩy rửa hoặc nanodisc có thể sản xuất protein chức năng trong môi trường màng gần tự nhiên. Màn hình tinh thể hóa quy mô lớn được thực hiện thông qua sản xuất song song nhiều biến thể, cấu trúc có ranh giới khác nhau hoặc protein liên hợp được thiết kế để tăng cường tinh thể hóa. Mặc dù tế bào sống cũng có thể sản xuất protein được đánh dấu đồng vị, sự đơn giản và kiểm soát của các hệ thống không tế bào mang lại lợi thế cho nhiều ứng dụng cấu trúc.

Ứng dụng trong Phát hiện và Thiết kế Kháng thể

Hệ thống không tế bào đẩy nhanh quá trình công nghệ kháng thể bằng cách cho phép sản xuất và sàng lọc nhanh chóng các thư viện kháng thể lớn. Công nghệ hiển thị ribosome vật lý liên kết kiểu gen và kiểu hình bằng cách làm chậm ribosome, cho phép lựa chọn các chất liên kết có ái lực cao từ các thư viện vượt quá 10¹² biến thể — lớn hơn nhiều so với các phương pháp hiển thị dựa trên tế bào. Các mảnh kháng thể (scFv, Fab) có thể được sản xuất trong các định dạng có năng suất cao cho sàng lọc hoạt tính, tối ưu hóa ái lực hoặc nỗ lực nhân hóa. Hệ thống không tế bào cũng cho phép tích hợp có định hướng các chất liên kết chéo hoặc nhãn cho các nghiên cứu sinh lý. Mặc dù tế bào động vật có vú vẫn là yếu tố thiết yếu để sản xuất các kháng thể điều trị đầy đủ chiều dài và có glycosyl hóa, hệ thống không tế bào vượt trội trong các giai đoạn phát hiện và tối ưu hóa, nơi tốc độ và kích thước thư viện là yếu tố quan trọng.

Ứng dụng trong chẩn đoán và xét nghiệm tại điểm chăm sóc

Hệ thống không tế bào cho phép sản xuất protein phân tán cho chẩn đoán, đặc biệt hữu ích trong các môi trường thiếu thốn tài nguyên. Các phản ứng không tế bào được sấy khô có thể được lưu trữ ở nhiệt độ phòng trong nhiều tháng, sau đó được tái tạo với DNA mẫu để sản xuất cảm biến protein, kháng thể hoặc enzyme theo yêu cầu. Khả năng này cho phép triển khai công cụ chẩn đoán tại hiện trường mà không cần chuỗi lạnh. Trong đại dịch COVID-19, hệ thống không tế bào đã được nghiên cứu để sản xuất nhanh kháng nguyên virus cho xét nghiệm huyết thanh hoặc thành phần phân tử cho xét nghiệm chẩn đoán. Tính di động và ổn định của các chất phản ứng không tế bào đông khô khiến chúng trở nên hấp dẫn cho các ứng dụng y tế toàn cầu nơi cơ sở hạ tầng nuôi cấy tế bào truyền thống không có sẵn.

Ứng dụng trong Giáo dục và Thiết kế Mẫu

Sự đơn giản và an toàn của hệ thống không tế bào khiến chúng trở thành công cụ giáo dục tuyệt vời, giới thiệu cho sinh viên các khái niệm sinh học phân tử mà không gặp rủi ro an toàn sinh học liên quan đến các sinh vật biến đổi gen sống. Các bộ kit không tế bào thân thiện với lớp học cho phép thực hiện các thí nghiệm tổng hợp protein thực hành trong vài giờ thay vì nhiều ngày như khi sử dụng biểu hiện vi khuẩn. Đối với thử nghiệm nguyên mẫu nghiên cứu, hệ thống không tế bào đẩy nhanh chu kỳ thiết kế-xây dựng-thử nghiệm: kiểm tra xem một gen có sản xuất protein hay không trước khi đầu tư vào phát triển dòng tế bào, tối ưu hóa sử dụng codon, sàng lọc thẻ liên kết hoặc xác minh cấu trúc trước sản xuất quy mô lớn. Thử nghiệm nguyên mẫu nhanh chóng này giảm thiểu nỗ lực lãng phí vào các cấu trúc không thể biểu hiện, tối ưu hóa quy trình nghiên cứu.

Tích hợp với Hệ thống Tế bào Sống

Thay vì xem hệ thống không tế bào và hệ thống dựa trên tế bào là đối thủ cạnh tranh, các nhà nghiên cứu thông minh sử dụng chúng một cách bổ sung. Hệ thống không tế bào vượt trội trong việc sàng lọc ban đầu, tối ưu hóa và sản xuất các protein khó, trong khi tế bào sống xử lý sản xuất quy mô lớn của các protein có hành vi tốt yêu cầu các sửa đổi phức tạp. Một quy trình làm việc điển hình có thể sử dụng tổng hợp không tế bào để sàng lọc nhanh các biến thể, xác định các cấu trúc tối ưu, sau đó chuyển các cấu trúc thắng cuộc sang tế bào và dòng tế bào để sản xuất quy mô lớn. Hoặc, hệ thống không tế bào có thể sản xuất một enzyme độc hại cho một thử nghiệm cụ thể trong khi các protein đồng hành được sản xuất trong tế bào. Cách tiếp cận tích hợp này tận dụng điểm mạnh của từng hệ thống đồng thời giảm thiểu nhược điểm.

Các tiến bộ gần đây: Năng suất và chức năng được cải thiện

Các tiến bộ liên tục cải thiện hiệu suất của hệ thống tổng hợp không tế bào. Hệ thống tổng hợp không tế bào trao đổi liên tục (CECF) sử dụng thẩm tách để cung cấp chất dinh dưỡng và loại bỏ các sản phẩm phụ ức chế, kéo dài phản ứng từ vài giờ lên vài ngày và tăng đáng kể năng suất. Tối ưu hóa hệ thống tái tạo năng lượng, thường sử dụng creatine phosphate hoặc phosphoenolpyruvate, duy trì mức ATP trong suốt các phản ứng kéo dài. Bổ sung các chaperone, foldase hoặc đồng yếu tố cụ thể cải thiện quá trình gấp và hoạt tính của các protein phức tạp. Các hệ thống lai kết hợp các chiết xuất từ các sinh vật khác nhau tận dụng các ưu điểm bổ sung - ví dụ, sử dụng máy dịch mã vi khuẩn với các chaperone eukaryotic. Các tiến bộ này thu hẹp khoảng cách hiệu suất giữa các hệ thống không tế bào và dựa trên tế bào.

Xét về kinh tế và tính khả thi thương mại

Kinh tế của sản xuất protein không tế bào phụ thuộc mạnh mẽ vào ứng dụng. Đối với các sản phẩm giá trị cao, khối lượng nhỏ—chất phản ứng nghiên cứu, thuốc điều trị cá nhân hóa hoặc thành phần chẩn đoán—hệ thống không tế bào có thể hiệu quả về chi phí mặc dù chi phí chất phản ứng cao. Việc loại bỏ thời gian nuôi cấy, yêu cầu cơ sở vật chất và lao động có thể bù đắp chi phí chất phản ứng. Đối với protein hàng hóa hoặc kháng thể điều trị yêu cầu khối lượng kilogram, quá trình lên men vẫn kinh tế hơn nhiều. Các dịch vụ sản xuất protein không tế bào hiện cung cấp sản xuất protein theo hợp đồng, giúp công nghệ này trở nên khả dụng mà không cần chuyên môn nội bộ. Khi chi phí chất phản ứng giảm nhờ quy mô kinh tế và cải tiến quy trình, hệ thống không tế bào sẽ trở nên khả thi cho các ứng dụng bổ sung, dù có thể không bao giờ thay thế tế bào trong sản xuất quy mô lớn.

Hướng phát triển tương lai và tế bào tổng hợp

Sự tiến hóa cuối cùng của hệ thống không tế bào có thể là tế bào tổng hợp—các khoang nhân tạo chứa máy móc tổng hợp protein không tế bào bên trong các vesicle lipid hoặc giọt, tạo ra các thực thể giống tế bào mà không cần tế bào sống. Các tế bào tổng hợp tối thiểu này có thể thực hiện các chức năng hữu ích (cảm biến sinh học, sản xuất sinh học, vận chuyển thuốc) trong khi đơn giản và dễ kiểm soát hơn so với tế bào sống. Các tiến bộ trong các dự án bộ gen tối thiểu giúp xác định các thành phần thực sự cần thiết, hướng dẫn việc đơn giản hóa hệ thống không tế bào. Các hệ thống dịch mã chính giao sử dụng các cặp cơ sở không tự nhiên hoặc mã di truyền thay thế mở rộng không gian hóa học có thể tiếp cận trong sinh học. Khi các công nghệ này phát triển, sự phân biệt giữa hệ thống không tế bào và tế bào sống có thể mờ nhạt, tạo ra một chuỗi liên tục của các nền tảng sản xuất sinh học và tổng hợp.

Góc nhìn của Cytion: Công nghệ bổ sung

Tại Cytion, mặc dù chuyên môn của chúng tôi tập trung vào việc cung cấp các dòng tế bào sống chất lượng cao cho nghiên cứu và quy trình sinh học, chúng tôi nhận thức rằng các hệ thống không tế bào đóng vai trò bổ sung trong bức tranh rộng lớn của công nghệ sinh học. Các nhà nghiên cứu sử dụng tế bào và dòng tế bào của chúng tôi cho sản xuất protein, thử nghiệm chức năng hoặc mô hình hóa bệnh tật có thể hưởng lợi từ các phương pháp không tế bào cho các ứng dụng cụ thể—màn hình nhanh trước khi cam kết phát triển dòng tế bào ổn định, sản xuất protein độc hại mà tế bào không thể biểu hiện, hoặc tích hợp các sửa đổi không tự nhiên. Hiểu rõ điểm mạnh và hạn chế của cả hệ thống sống và không tế bào cho phép đưa ra quyết định thông minh về nền tảng phù hợp nhất cho từng ứng dụng, từ đó đẩy nhanh quá trình nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực khoa học đời sống.