Công nghệ chuyển hóa HEK293 để tăng cường quá trình glycosyl hóa protein

Glycosylation là một trong những sửa đổi sau dịch mã quan trọng nhất ảnh hưởng đến hiệu quả, độ ổn định và tính miễn dịch của protein điều trị. Tại Cytion, chúng tôi nhận thức rằng việc sản xuất protein tái tổ hợp với cấu trúc glycan tối ưu đòi hỏi sự hiểu biết sâu sắc về chuyển hóa tế bào và cơ chế glycosyl hóa. Tế bào HEK293 cung cấp một nền tảng ưu việt cho sản xuất glycoprotein, vì nguồn gốc nhân loại của chúng đảm bảo các mẫu glycosyl hóa tương tự như protein nội sinh của con người—một lợi thế quan trọng so với các hệ thống biểu hiện không phải con người.

Điểm chính

• Tế bào HEK293 sản xuất cấu trúc glycan tương thích với con người, vượt trội hơn tế bào CHO đối với một số liệu pháp điều trị
• Bổ sung tiền chất đường nucleotide trực tiếp tăng cường độ chiếm chỗ của các vị trí glycosyl hóa
• Điều kiện nuôi cấy bao gồm nhiệt độ, pH và oxy hòa tan có ảnh hưởng sâu sắc đến cấu trúc glycan
• Các phương pháp công nghệ gen cho phép tùy chỉnh cấu trúc glycan cho các ứng dụng dược phẩm cụ thể
• Các chiến lược đặc trưng phân tích là thiết yếu cho đánh giá chất lượng glycoprotein

Lợi thế glycosylation của tế bào HEK293

Tế bào thận phôi người 293 (HEK293) có khả năng glycosyl hóa đặc biệt, giúp chúng nổi bật so với các hệ thống biểu hiện động vật có vú khác. Khác với tế bào buồng trứng chuột Trung Quốc (CHO), chỉ sản xuất axit sialic liên kết α2,3, tế bào HEK293 biểu hiện cả hai enzym sialyltransferase α2,3 và α2,6, tạo ra cấu trúc glycan tương tự hơn với glycoprotein tự nhiên của con người.

Sự khác biệt này có ý nghĩa điều trị quan trọng. Nhiều glycoprotein trong huyết thanh người, bao gồm immunoglobulin và yếu tố đông máu, chứa tỷ lệ lớn axit sialic liên kết α2,6. Các protein điều trị được sản xuất trong tế bào HEK293 có thể có hồ sơ dược động học cải thiện và độ miễn dịch thấp hơn so với các sản phẩm tương đương được sản xuất từ tế bào CHO.

Tế bào HEK293 của chúng tôi (300192) cung cấp một điểm khởi đầu tuyệt vời cho sản xuất glycoprotein, với đặc tính tăng trưởng mạnh mẽ đồng thời duy trì hệ thống glycosyl hóa tự nhiên. Đối với các ứng dụng yêu cầu hiệu suất chuyển gen cao hơn, tế bào HEK293T của chúng tôi (300189) cho phép nghiên cứu biểu hiện nhanh chóng.

Chuyển hóa đường nucleotide và công nghệ tiền chất

Hiệu quả glycosylation phụ thuộc cơ bản vào sự sẵn có của các chất cho đường nucleotide trong lưới nội chất và bộ Golgi. Các phân tử đường hoạt hóa này—bao gồm UDP-glucose, UDP-galactose, UDP-N-acetylglucosamine, GDP-mannose, GDP-fucose và CMP-sialic acid—là chất nền cho các enzym glycosyltransferase xây dựng chuỗi glycan.

Các phương pháp công nghệ chuyển hóa có thể tăng cường nguồn cung cấp đường nucleotide thông qua nhiều cơ chế. Bổ sung trực tiếp các monosaccharide như galactose, mannose hoặc N-acetylmannosamine (ManNAc) vào môi trường nuôi cấy cung cấp các chất nền cho con đường cứu vãn, mà tế bào có thể chuyển đổi thành các đường nucleotide tương ứng. Việc bổ sung ManNAc ở nồng độ 10-40 mM đã được chứng minh là làm tăng đáng kể mức độ sialylation trong các dòng tế bào khác nhau.

Các phương pháp di truyền cung cấp giải pháp lâu dài hơn. Việc biểu hiện quá mức các enzym chính trong các con đường tổng hợp đường nucleotide—bao gồm CMP-sialic acid synthetase, UDP-glucose pyrophosphorylase hoặc GDP-mannose pyrophosphorylase—có thể duy trì mức độ cao của các tiền chất mà không cần bổ sung môi trường nuôi cấy.

Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy để cải thiện chất lượng glycan

Các thông số môi trường có tác động sâu sắc đến kết quả glycosylation, thường sánh ngang với các sửa đổi di truyền về ảnh hưởng đến cấu trúc glycan. Giảm nhiệt độ từ 37°C xuống 32-34°C trong giai đoạn sản xuất đã được chứng minh là tăng cường sialylation, có thể thông qua sự kết hợp giữa thời gian lưu trú kéo dài của protein trong Golgi và giảm hoạt động của sialidase.

PH môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến cả hoạt động của glycosyltransferase và độ ổn định của glycan. Duy trì pH trong khoảng 6.8–7.2 thường hỗ trợ glycosylation tối ưu, mặc dù điểm tối ưu cụ thể có thể thay đổi tùy thuộc vào protein mục tiêu và cấu trúc glycan mong muốn. pH dưới 6.5 có thể thúc đẩy quá trình phân cắt axit sialic, làm giảm sialylation đầu cuối.

Mức oxy hòa tan ảnh hưởng đến chuyển hóa tế bào và do đó ảnh hưởng đến quá trình glycosylation. Trong điều kiện thiếu oxy (dưới 20% bão hòa không khí), sự phát triển và năng suất tế bào có thể bị suy giảm, trong khi mức oxy vừa phải (30-50% bão hòa không khí) thường hỗ trợ quá trình glycosylation mạnh mẽ. Điều kiện quá oxy có thể tạo ra các loài oxy phản ứng gây hại cho glycoprotein hoặc can thiệp vào cơ chế glycosylation.

Môi trường DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a) của chúng tôi cung cấp một công thức cơ bản tuyệt vời cho sản xuất glycoprotein, với thành phần dinh dưỡng cân bằng hỗ trợ cả sự phát triển của tế bào và quá trình xử lý sau dịch mã.

Công nghệ di truyền để tùy chỉnh quá trình glycosylation

Các công cụ công nghệ gen hiện đại cho phép điều chỉnh chính xác khả năng glycosylation của tế bào HEK293 để sản xuất protein có cấu trúc glycan tùy chỉnh. Công nghệ CRISPR/Cas9 đã cách mạng hóa lĩnh vực này, cho phép loại bỏ hiệu quả các glycosyltransferase cụ thể hoặc giới thiệu các hoạt động enzym mới.

Kháng thể không có fucosyl hóa là một ứng dụng nổi bật của công nghệ glycosylation. Việc loại bỏ gen FUT8, mã hóa enzym α1,6-fucosyltransferase, loại bỏ quá trình fucosyl hóa lõi khỏi N-glycan. Kháng thể không có fucosyl hóa cho thấy sự tăng cường đáng kể về độc tính tế bào phụ thuộc kháng thể (ADCC), một đặc tính mong muốn cho các liệu pháp ung thư.

Ngược lại, việc biểu hiện quá mức các enzym glycosyltransferase có thể tăng cường các sửa đổi cụ thể. Việc giới thiệu β1,4-N-acetylglucosaminyltransferase III (GnT-III) tạo ra kháng thể có N-acetylglucosamine phân cắt, một sửa đổi khác liên quan đến chức năng hiệu ứng tăng cường. Việc biểu hiện quá mức galactosyltransferases và sialyltransferases tăng cường việc đóng nắp glycan cuối cùng, có thể cải thiện thời gian bán hủy trong huyết thanh.

Đối với các ứng dụng nuôi cấy tế bào trong môi trường lỏng hỗ trợ sản xuất glycoprotein quy mô lớn, các tế bào HEK293 thích nghi với môi trường lỏng (300686) của chúng tôi có thể được công nghệ hóa thêm để tích hợp các sửa đổi glycosyl hóa mong muốn.

Các chiến lược phân tích để đánh giá glycosylation

Để đặc trưng hóa glycan một cách toàn diện, cần áp dụng nhiều phương pháp phân tích bổ sung cho nhau. Phân tích glycan đã giải phóng bằng sắc ký tương tác hydrophilic (HILIC) kết hợp với phát hiện huỳnh quang cung cấp bản đồ glycan chi tiết với độ nhạy cao. Phổ khối (Mass spectrometry) giúp xác nhận cấu trúc và phát hiện các biến đổi bất ngờ.

Phân tích glycosylation cụ thể vị trí giải quyết tính đa dạng vốn có trong glycoprotein. Bản đồ glycopeptide bằng LC-MS/MS tiết lộ cả tỷ lệ chiếm chỗ của các vị trí glycosylation riêng lẻ và cấu trúc glycan hiện diện tại mỗi vị trí. Thông tin này rất quan trọng để hiểu mối quan hệ cấu trúc-chức năng và đảm bảo tính nhất quán giữa các lô.

Các phương pháp sàng lọc nhanh hỗ trợ phát triển quy trình và kiểm soát chất lượng. Các thử nghiệm dựa trên lectin, điện di mao quản và kháng thể đặc hiệu glycan cho phép đánh giá nhanh các thuộc tính glycan quan trọng mà không cần chuẩn bị mẫu phức tạp.

Sản phẩm được khuyến nghị cho sản xuất glycoprotein:

• Tế bào HEK293 (300192) - Mô hình glycosylation tự nhiên của con người
• Tế bào HEK293T (300189) - Hiệu suất chuyển gen cao cho các nghiên cứu nhanh
• Tế bào HEK293 thích nghi với môi trường lơ lửng (300686) - Nền tảng sản xuất có thể mở rộng
• DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a) - Được tối ưu hóa cho sản xuất glycoprotein