Hướng dẫn toàn diện về việc đông lạnh tế bào: Đảm bảo tính sống sót và vô trùng

Đông lạnh tế bào là quy trình quan trọng trong quản lý nuôi cấy tế bào, đảm bảo lưu trữ lâu dài và bảo quản các dòng tế bào quý giá. Dù làm việc với tế bào người hay động vật, việc tuân thủ các quy trình chính xác và duy trì kỹ thuật vô trùng nghiêm ngặt là yếu tố then chốt để đạt được đông lạnh thành công.

Hướng dẫn này cung cấp các hướng dẫn chi tiết về vật liệu, hóa chất cần thiết và các bước thực hiện để đông lạnh tế bào một cách hiệu quả, đồng thời duy trì khả năng sống và vô trùng của chúng. Bằng cách tuân thủ các hướng dẫn này, các nhà nghiên cứu có thể tự tin lưu trữ và sau đó hồi sinh các dòng tế bào với mức độ mất mát khả năng sống tối thiểu, duy trì tính toàn vẹn và độ tin cậy của kết quả thí nghiệm.

Để bắt đầu, việc thiết lập một môi trường làm việc vô trùng là điều cần thiết. Kỹ thuật vô trùng đúng cách đóng vai trò quan trọng trong việc ngăn ngừa nhiễm khuẩn và đảm bảo tính vô trùng của các dòng tế bào.

Kỹ thuật vô trùng

Tuân thủ các kỹ thuật vô trùng trong suốt quá trình để đảm bảo tính vô trùng của các văn hóa tế bào.

Quy trình đông lạnh tế bào toàn diện

Sơ đồ này cung cấp hướng dẫn trực quan chi tiết về các bước quan trọng trong quá trình đông lạnh tế bào đúng cách. Tuân thủ các quy trình này để đảm bảo độ sống và tính toàn vẹn của tế bào trong quá trình bảo quản lạnh.

Chuẩn bị dung dịch đông lạnh

Chuẩn bị môi trường đông lạnh bảo vệ tế bào theo loại tế bào:

Dung dịch nuôi cấy chứa FBS: 90% FBS + 10% DMSO hoặc 70% dung dịch nuôi cấy, 20% FBS và 10% DMSO
Tế bào cần glycerol: 90% FBS + 10% glycerol

Xem xét sử dụng môi trường đông lạnh đã được pha sẵn của chúng tôi:

Dung dịch đông lạnh CM-1: Dành cho các quy trình yêu cầu dung dịch chứa huyết thanh bò non (FBS)
Môi trường đông lạnh CM-ACF - không chứa huyết thanh: Cho lựa chọn thay thế không chứa FBS

Ghi nhãn và tài liệu

Ghi nhãn ống đông lạnh với các thông tin sau:

Ngày
Tên nhà nghiên cứu
Số lượng tế bào
Số lần nhân bản
Loại tế bào
Thông tin bổ sung (ví dụ: biến đổi gen)

Chuẩn bị tế bào

Đối với tế bào bám dính:

Theo dõi tế bào cho đến khi đạt 85–95% mật độ phủ
Hút bỏ môi trường nuôi cấy cũ
Rửa lớp tế bào đơn lớp bằng PBS không chứa canxi và magiê
Tách tế bào bằng Accutase, trypsin hoặc trypsin-EDTA và trung hòa bằng môi trường nuôi cấy nếu cần
Chuyển hỗn hợp tế bào vào ống Falcon 50 mL

Đối với tế bào dạng huyền phù:

Kiểm tra mật độ và tình trạng sức khỏe của tế bào dưới kính hiển vi
Chuyển hỗn hợp tế bào trực tiếp vào ống Falcon 50 mL

Đếm tế bào và ly tâm

Đếm tế bào bằng kính hiển vi đếm tế bào hoặc máy đếm tế bào tự động
Ly tâm ở 300g trong 3-5 phút ở nhiệt độ phòng để tạo cặn tế bào
Hút cẩn thận dịch trên, tránh làm xáo trộn lớp tế bào lắng
Hâm nóng dung dịch đông lạnh đã chuẩn bị lên 37°C trước khi sử dụng

Bảo quản đông lạnh

Hòa tan lại khối tế bào trong dung dịch đông lạnh với nồng độ 2,0 triệu tế bào/mL cho tế bào bám dính và 5 triệu tế bào/mL cho tế bào lơ lửng, hoặc nồng độ mong muốn
Chia nhỏ 1,0 mL (hoặc nhiều hơn nếu cần) của hỗn hợp tế bào vào ống đông lạnh có nhãn
Sử dụng phương pháp đông lạnh chậm trước khi chuyển tế bào vào lưu trữ lâu dài

? Phương pháp	? Các bước
❄️ Đông lạnh thủ công	1️⃣ Đặt tế bào vào môi trường đông lạnh trong tủ đông 4°C trong 40 phút. 2️⃣ Chuyển sang tủ đông -80°C trong 24 giờ. 3️⃣ Bảo quản tế bào trong nitơ lỏng để bảo quản lâu dài
? Sử dụng Mr. Frosty	1️⃣ Chuẩn bị tế bào trong ống cryovial với dung dịch đông lạnh. 2️⃣ Đặt ống cryovials vào hộp Mr. Frosty. 3️⃣ Bảo quản ở -80°C trong 24 giờ trước khi chuyển sang nitơ lỏng
? Tủ đông điều khiển tốc độ	1️⃣ Cài đặt thiết bị để giảm nhiệt độ từ từ. 2️⃣ Đặt các tế bào đã chuẩn bị vào tủ đông. 3️⃣ Sau chu kỳ đông lạnh, chuyển tế bào sang nitơ lỏng

Bảo quản ống cryovial ở nhiệt độ dưới -130°C hoặc trong nitơ lỏng để bảo quản lâu dài.

Vật liệu và hóa chất

ống cryovials 1–2 mL
Thiết bị đông lạnh CoolCell® hoặc tủ đông có tốc độ kiểm soát
Dung dịch đông lạnh bảo vệ (ví dụ: dung dịch bảo vệ đông lạnh tự chế, CM-1, CM-ACF hoặc dung dịch chuyên dụng)
Huyết thanh bò thai (FBS) hoặc môi trường nuôi cấy đã qua sử dụng
DMSO hoặc glycerol
PBS không chứa canxi và magiê
Accutase, Trypsin hoặc Trypsin-EDTA (cho tế bào bám dính)
ống Falcon 15 mL hoặc 50 mL
Kính hiển vi đếm tế bào hoặc máy đếm tế bào tự động
Máy ly tâm