Skríning CRISPR v bunkových líniách: Funkčná analýza celého genómu

Technológia CRISPR-Cas9 spôsobila revolúciu vo funkčnej genomike, pretože umožňuje systematické skúmanie funkcie génov v celých genómoch v kultivovaných bunkách. V spoločnosti Cytion si uvedomujeme, že naše bunky a bunkové línie slúžia ako výkonné platformy pre skríningové aplikácie CRISPR, ktoré identifikujú gény riadiace rôzne bunkové procesy od proliferácie až po rezistenciu na lieky. V rámci skríningov CRISPR sa do bunkových populácií zavádzajú knižnice obsahujúce tisíce až státisíce vodiacich RNA (sgRNA), čím sa vytvárajú masívne kolekcie, v ktorých každá bunka dostáva inú genetickú poruchu. Aplikovaním selektívnych tlakov a sledovaním, ktoré sgRNA sa obohacujú alebo vyčerpávajú, výskumníci systematicky identifikujú gény nevyhnutné pre prežitie, gény poskytujúce rezistenciu voči terapeutikám alebo gény regulujúce akýkoľvek selektovateľný fenotyp. Tento nestranný prístup funkčnej genomiky urýchlil objavy v biológii rakoviny, imunológii, infekčných chorobách a základnej bunkovej biológii, čím sa kultivované bunky zmenili na motory systematických biologických objavov.

Návrh a dodávanie knižníc CRISPR

Genómové knižnice CRISPR obsahujú sekvencie sgRNA zamerané na každý gén kódujúci proteíny v genóme, zvyčajne so 4 až 10 vodítkami na gén, aby sa zabezpečilo robustné pokrytie a zohľadnila sa premenlivá účinnosť vodítok. Knižnice pre celý ľudský genóm obsahujú 70 000 - 100 000 sekvencií sgRNA, zatiaľ čo cielené knižnice zamerané na podmnožiny, ako sú kinázy, epigenetické regulátory alebo metabolické enzýmy, umožňujú hlbšie pokrytie s menším počtom konštrukcií. Kvalita knižnice má rozhodujúci vplyv na úspešnosť skríningu - vodítka musia účinne indukovať knockout a zároveň sa vyhýbať účinkom mimo cieľa, ktoré by mátali interpretáciu.

Štandardom na zavádzanie knižníc sgRNA do bunkových populácií zostáva dodávka pomocou lentivirových vírusov. Zoskupený lentivírus obsahujúci kompletnú knižnicu sgRNA infikuje bunky pri nízkej multiplicite infekcie (MOI), zvyčajne 0,3 - 0,5, čím sa zabezpečí, že väčšina infikovaných buniek dostane len jeden konštrukt sgRNA. Táto požiadavka na jednu poruchu na bunku zabraňuje zmätkom spôsobeným bunkami s viacerými knockoutmi. Po transdukcii sa selekciou antibiotikami odstránia neinfikované bunky, čím sa získajú populácie, v ktorých každá bunka nesie definovanú genetickú poruchu. V prípade bunkových línií Cytion sa účinnosť transdukcie líši podľa typu bunky - suspenzné bunky sa často transdukujú efektívne, zatiaľ čo niektoré adherentné línie vyžadujú optimalizáciu koncentrácie vírusu, polybren a spinokuláciu.

Zastúpenie knižnice - počet buniek obsahujúcich každú sgRNA - kriticky ovplyvňuje kvalitu obrazovky. Celogénomové obrazovky vyžadujú udržiavanie 500 - 1 000 buniek na sgRNA počas celého experimentu, aby sa zabránilo stochastickej strate sprievodcov z náhodných účinkov vzorkovania. Pre knižnicu so 100 000 sgRNA to vyžaduje počiatočné populácie s 50 - 100 miliónmi buniek a udržiavanie proporcionálneho počtu prostredníctvom selekcie a pasážovania. Nedostatočné zastúpenie vnáša šum, ktorý zakrýva skutočné zásahy a vytvára falošne pozitívne výsledky z náhodného vypadávania.

Skríningy negatívnej selekcie: Identifikácia základných génov

Skríningy negatívnej selekcie identifikujú gény potrebné na prežitie buniek alebo ich proliferáciu v štandardných kultivačných podmienkach. Bunky sa transdukujú s knižnicami sgRNA, selektujú sa na integráciu a potom sa priebežne pasážujú 2 - 4 týždne, pričom sa zachováva zastúpenie knižnice. sgRNA zamerané na základné gény sa vyčerpávajú, pretože bunky obsahujúce tieto knockouty sa nerozmnožujú alebo umierajú. Porovnaním množstva sgRNA v konečnom časovom bode v porovnaní s počiatočnou populáciou (T0) sa zistí, ktoré gény sú potrebné pre fitness v experimentálnych podmienkach.

Screeny esenciálnych génov vytvárajú mapy závislosti špecifické pre bunkové línie, ktoré odhaľujú slabé miesta využiteľné na terapeutické zásahy. Rakovinové bunkové línie často závisia od onkogénov alebo zložiek dráh, ktoré normálne bunky nevyžadujú, čo predstavuje potenciálne terapeutické ciele. Napríklad bunky HeLa vykazujú charakteristické závislosti od génov podporujúcich rýchlu proliferáciu a riadenie genomickej nestability. V rámci projektu Cancer Dependency Map (Mapa závislosti rakoviny) sa vykonali skríningy CRISPR v celom genóme na stovkách rakovinových bunkových línií, pričom sa katalogizovali genetické závislosti a korelovali s genomickými vlastnosťami s cieľom predpovedať zraniteľnosť špecifickú pre pacienta.

V rámci skríningov esenciality špecifických pre daný kontext sa porovnávajú závislosti génov v rôznych podmienkach alebo bunkových líniách. Paralelné skríningy v normálnych a transformovaných bunkách alebo v bunkách s rôznym genetickým pozadím identifikujú syntetické letálne interakcie, pri ktorých sa strata génu ukáže ako letálna len v špecifických kontextoch. Tieto kontextovo špecifické závislosti poskytujú terapeutické okná - zacielenie na gény, ktoré sú nevyhnutné v rakovine, ale nepotrebné v normálnych tkanivách, minimalizuje toxicitu. V prípade bunkových línií Cytion, ktoré predstavujú rôzne tkanivové pôvody a transformačné stavy, komparatívny CRISPR skríning mapuje genetickú architektúru bunkových závislostí.

Skríningy pozitívnej selekcie: Mechanizmy rezistencie a prežitia

Pri skríningoch pozitívnej selekcie sa uplatňujú selektívne tlaky, ktoré zabíjajú väčšinu buniek, a obohacujú sa o sgRNA, ktoré poskytujú prežitie alebo odolnosť. Pri skríningoch rezistencie na liečivá sa bunky infikované knižnicou ošetrujú terapeutikami v koncentráciách, ktoré zabíjajú nemodifikované bunky. Prežívajúce bunky sú obohatené o sgRNA, ktoré narušujú ciele liečiv, aktivujú cesty rezistencie alebo blokujú proapoptotickú signalizáciu. Identifikácia týchto génov odhaľuje mechanizmy účinku liečiv a potenciálne mechanizmy rezistencie, ktoré by sa mohli objaviť v klinickej praxi.

Skríningy rezistencie voči toxínom identifikujú gény potrebné na absorpciu, aktiváciu alebo následnú cytotoxicitu toxínu. Napríklad skríning s toxínom záškrtu obohacuje sgRNA zamerané na receptor toxínu a zložky membránovej dopravy potrebné na vstup toxínu. Skríningy citlivosti na patogény vystavujú bunky vírusom alebo bakteriálnym toxínom a identifikujú hostiteľské faktory nevyhnutné pre infekciu. Tieto obrazovky mapujú bunkové mechanizmy využívané patogénmi a odhaľujú potenciálne terapeutické ciele na blokovanie infekcie.

Skríningy nezávislosti od rastových faktorov umožňujú kultiváciu buniek v zníženom množstve séra alebo s odňatím špecifického rastového faktora, pričom sa identifikujú gény, ktorých narušenie umožňuje proliferáciu nezávislú od rastových faktorov. Tieto zásahy často predstavujú nádorové supresory alebo negatívne regulátory rastových signálnych dráh. Pochopenie dráh umožňujúcich nezávislosť od rastových faktorov osvetľuje mechanizmy progresie rakoviny a identifikuje potenciálne ciele pre kombinované terapie, ktoré zabraňujú vzniku rezistencie.

Skríningy CRISPR založené na FACS

Fluorescenčne aktivované triedenie buniek umožňuje skríning génov regulujúcich akýkoľvek fluorescenčne merateľný fenotyp. Bunky exprimujúce fluorescenčný reportér pod kontrolou dráhy záujmu sú transdukované knižnicami sgRNA a potom triedené na základe expresie reportéra. Bunky s vysokou a nízkou expresiou reportéra sa zbierajú oddelene a početnosť sgRNA sa porovnáva medzi populáciami. Obohatené sgRNA identifikujú pozitívne regulátory (obohatené v populácii s nízkou expresiou pri vyradení) a negatívne regulátory (obohatené v populácii s vysokou expresiou pri prerušení).

Skríny povrchových markerov triedia bunky na základe farbenia protilátkami na povrchové proteíny buniek. Tieto obrazovky identifikujú regulátory prezentácie antigénov, ligandy kontrolných bodov imunitného systému alebo adhézne molekuly. Na účely vývoja imunoterapie sa pomocou skríningov založených na FACS identifikovali gény kontrolujúce expresiu PD-L1, čím sa odhalili cielené dráhy, ktoré by mohli zvýšiť odpoveď na imunoterapiu. Schopnosť triediť na základe endogénnej expresie proteínov namiesto technických reportérov rozširuje rozsah skríningu na akýkoľvek proteín s vhodnými protilátkami.

Viacparametrový FACS umožňuje sofistikované fenotypové rozlišovanie. Súčasné meranie viacerých markerov identifikuje gény špecificky ovplyvňujúce určité bunkové populácie alebo stavy. Napríklad triedenie na základe veľkosti a zrnitosti v kombinácii s farbivami životaschopnosti rozlišuje apoptotické bunky od zdravých, čo umožňuje skríning regulátorov apoptózy. Hlavným obmedzením zostáva priepustnosť - skríningy na báze FACS si vyžadujú viac buniek ako jednoduché selekcie na prežitie a narážajú na praktické limity, pokiaľ ide o počet buniek, ktoré možno triediť, čo potenciálne obmedzuje veľkosť alebo zastúpenie knižnice.

Skríny CRISPR založené na obrazoch

Automatizovaná mikroskopia v kombinácii s analýzou obrazu umožňuje skríning morfologických fenotypov, ktoré nie sú prístupné FACS. Bunky infikované knižnicami sgRNA (jeden alebo niekoľko vodičov na jamku) sa fixujú a zobrazujú, čím sa získajú stovky morfologických znakov na bunku. Strojové učenie klasifikuje fenotypy a identifikuje vodiče, ktoré spôsobujú charakteristické morfologické zmeny. Na rozdiel od skupinových obrazoviek sa pri usporiadaných formátoch zachováva priestorové oddelenie porúch, čo umožňuje odčítanie na základe mikroskopie.

Morfologické obrazovky organel identifikujú gény regulujúce mitochondriálne siete, Golgiho štruktúru, jadrovú morfológiu alebo organizáciu cytoskeletu. Tieto obrazovky odhalili mechanizmy kontroly kvality udržiavajúce funkciu organel a identifikovali gény koordinujúce dynamiku organel s priebehom bunkového cyklu. V prípade bunkových línií Cytion s dobre charakterizovanou morfológiou môže skríning založený na obrazoch identifikovať jemné fenotypy, ktoré sú neviditeľné pre iné čítanie.

Obrazové skríningy živých buniek sledujú dynamické procesy, ako je delenie buniek, migrácia alebo signalizácia vápnika v priebehu času. Časozberné zobrazovanie vyradených buniek odhaľuje gény riadiace načasovanie delenia, orientáciu mitotického vretienka alebo rýchlosť a smer migrácie. Bohatosť zobrazovacích údajov je na úkor priepustnosti - obrazovky s maticami skúmajú menej porúch ako skupinové obrazovky, hoci cielené knižnice zamerané na špecifické génové rodiny vyvažujú pokrytie s praktickými obmedzeniami.

Analýza a overovanie zásahov

Po výbere a zbere vzoriek sa extrahuje genómová DNA a oblasť sgRNA sa amplifikuje pomocou PCR s primermi vrátane adaptérov na sekvenovanie. Hlbokým sekvenovaním sa kvantifikuje množstvo každej sgRNA, pričom sa generujú počty čítaní porovnávané medzi experimentálnymi a kontrolnými vzorkami. Výpočtové nástroje ako MAGeCK, BAGEL alebo JACKS štatisticky vyhodnocujú obohatenie alebo vyčerpanie, pričom zohľadňujú testovanie viacerých hypotéz v tisícoch génov.

Zásahy s vysokou spoľahlivosťou vykazujú konzistentné účinky vo viacerých nezávislých sgRNA zameraných na ten istý gén. Gény, na ktorých sa prejavujú účinky len jedného alebo dvoch vodičov, pravdepodobne predstavujú skôr artefakty mimo cieľa ako skutočné zásahy. Štatistické metódy agregujú dôkazy naprieč jednotlivými sprievodcami na gén, čím sa zvyšuje sila na odhalenie skutočných pozitívnych výsledkov a zároveň sa znižuje počet falošných objavov z jednotlivých sprievodcov mimo cieľa. Kontrolné vodítka zamerané na známe základné gény alebo necieľové kontroly overujú výkonnosť skríningu a kalibrujú štatistické prahy.

Validačné experimenty potvrdzujú zásahy obrazovky pomocou nezávislých sgRNA alebo ortogonálnych metód vyradenia. Jednotlivé sgRNA sa klonujú a testujú v skríningovej bunkovej línii a v ideálnom prípade v ďalších bunkových líniách, aby sa posúdila reprodukovateľnosť a zovšeobecniteľnosť. Záchranné experimenty s opätovnou expresiou cieľového génu z cDNA bez cieľovej sekvencie sgRNA potvrdzujú cieľové účinky. Pri validácii terapeutického cieľa sa testovaním zásahov v paneloch bunkových línií Cytion, ktoré predstavujú rôzne genetické pozadie, identifikujú všeobecne použiteľné závislosti v porovnaní so závislosťami špecifickými pre daný kontext.

Varianty a pokročilé prístupy skríningu

Skríningy CRISPRi a CRISPRa využívajú katalyticky mŕtvy Cas9 spojený s transkripčnými represormi alebo aktivátormi, čo umožňuje reverzibilné vyradenie alebo aktiváciu génu namiesto trvalého vyradenia. Tieto prístupy zabraňujú zmätkom spôsobeným úplnou stratou génu, modelujú zmeny expresie génu namiesto nulových mutácií a umožňujú skríning regulačných prvkov nekódujúcich proteíny. V prípade esenciálnych génov, pri ktorých vyradenie spôsobuje letalitu, môže čiastočné vyradenie pomocou CRISPRi odhaliť fenotypy závislé od dávky a terapeutické okná.

Skríningy s editormi báz zavádzajú presné bodové mutácie namiesto inzercií/delecií, čo umožňuje systematickú mutagenézu proteínových domén alebo regulačných prvkov. Eskrínové editácie základného kódu sľubujú ešte väčšiu presnosť, zavádzajúc alebo opravujúc špecifické mutácie. Tieto obrazovky novej generácie umožnia systematické rozoberanie vzťahov medzi štruktúrou a funkciou proteínov a skúmanie variantov súvisiacich s chorobami vo veľkom rozsahu.

Kombinované obrazovky s použitím knižníc s dvojitou sgRNA systematicky testujú génové páry a identifikujú genetické interakcie vrátane syntetickej letality, supresie a epistázy. Hoci sú kombinované obrazovky technicky náročné kvôli faktoriálnemu nárastu zložitosti knižníc, mapujú genetické siete a identifikujú kombinované terapeutické stratégie. Cielené kombinatorické skríningy zamerané na dvojice génov, ktoré sa dajú liečiť, odhaľujú kombinované terapie, ktoré by mohli zabrániť rezistencii alebo zvýšiť účinnosť v porovnaní s liečbou jednotlivými liekmi.

Aplikácie pri objavovaní a vývoji liekov

CRISPR obrazovky urýchľujú identifikáciu cieľov systematickým testovaním, ktoré gény po narušení vytvárajú požadované terapeutické fenotypy. Skríny závislosti od rakoviny identifikujú gény, ktoré sú nevyhnutné špeciálne v rakovinových bunkách a predstavujú potenciálne terapeutické ciele. Skríningy v bunkách odvodených od pacienta alebo v paneloch izogénnych bunkových línií stratifikujú ciele podľa genetického kontextu, čo umožňuje prístupy presnej medicíny, ktoré prispôsobujú terapie biomarkerom pacienta.

Štúdie mechanizmu účinku zlúčenín s neznámymi cieľmi využívajú CRISPR skríningy na identifikáciu génov spôsobujúcich rezistenciu alebo citlivosť. Ak narušenie špecifického génu spôsobí rezistenciu na zlúčeninu, tento gén pravdepodobne kóduje cieľ alebo zložku dráhy nevyhnutnú pre aktivitu lieku. Tento prístup objasnil mechanizmy zavedených aj nových terapeutík, urýchlil klinický vývoj a identifikoval biomarkery na výber pacientov.

Pri skríningových testoch CRISPR sa bunky ošetrujú subletálnymi dávkami liečiva, pričom sa identifikujú gény, ktoré po narušení spôsobujú rezistenciu. Tieto gény predstavujú potenciálne mechanizmy, ktorými sa nádory môžu vyhnúť liečbe, čo umožňuje vývoj kombinovaných stratégií blokujúcich cesty rezistencie. V prípade bunkových línií Cytion, ktoré modelujú rôzne typy rakoviny, skríning rezistencie poskytuje informácie pre návrh klinických skúšok a stratégie monitorovania pacientov.

Výzvy a osvedčené postupy

Účinky mimo cieľa zostávajú problémom napriek zlepšeným algoritmom návrhu sgRNA. Niektoré vodidlá štiepia neúmyselné genomické miesta so sekvenčnou podobnosťou s cieľom, čo môže spôsobiť fenotypy nesúvisiace so zamýšľaným narušením génu. Použitie viacerých nezávislých vodičov na gén a štatistická agregácia medzi vodičmi zmierňuje tento problém. Validácia najlepších zásahov pomocou ortogonálnych metód potvrdzuje účinky na cieľ.

Výsledky skríningu môže ovplyvniť neúplná alebo oneskorená kinetika vyradenia. Niektoré sgRNA strihajú neefektívne a spôsobujú skôr čiastočné vyradenie ako úplné vyradenie. Stabilita proteínov znamená, že knockout na úrovni DNA/RNA si vyžaduje čas na degradáciu existujúceho proteínu, kým sa prejavia fenotypy. Skríningy musia prebiehať dostatočne dlho po selekcii na úplné odstránenie proteínu, zvyčajne 7-14 dní v závislosti od polčasu rozpadu cieľového proteínu a zdvojnásobenia buniek.

Kontrola kvality skríningu zahŕňa monitorovanie zastúpenia knižnice, potvrdenie aktivity Cas9 a overenie očakávaného správania kontrolných vodičov. Sekvenovanie počiatočných populácií potvrdzuje komplexnosť a zastúpenie knižnice. Návody zamerané na známe esenciálne gény by mali vykazovať silnú depléciu v skríningoch s negatívnou selekciou, zatiaľ čo necieľové kontroly by sa nemali výrazne meniť. Odchýlky od očakávaného správania kontrol naznačujú technické problémy, ktoré si vyžadujú riešenie pred interpretáciou experimentálnych výsledkov.

Budúce smery a rozšírenie aplikácií

Perturb-seq kombinuje skríning CRISPR so sekvenovaním RNA v jednej bunke, pričom profiluje transkriptomické reakcie na tisíce genetických perturbácií súčasne. Tento prístup mapuje, ako sa narušenie génov šíri molekulárnymi sieťami, a odhaľuje regulačné vzťahy a architektúru dráh. V prípade bunkových línií Cytion poskytujú súbory údajov Perturb-seq komplexnú funkčnú charakterizáciu, ktorá dopĺňa tradičné skríningové prístupy.

Skríning CRISPR in vivo rozširuje združený skríning na zvieracie modely a identifikuje gény kontrolujúce rast nádoru, metastázovanie alebo odpoveď na imunoterapiu vo fyziologicky relevantných súvislostiach. Bunky infikované knižnicou sa implantujú do myší a nádory sa vyberú na kvantifikáciu sgRNA. Gény obohatené v rastúcich nádoroch predstavujú hnacie sily in vivo, ktoré sa potenciálne prehliadli pri skríningu bunkových kultúr. Tieto prístupy sú mostom medzi štúdiami bunkových línií a klinickou aplikáciou.

Pre spoločnosť Cytion a komunitu bunkových kultúr sa skríning CRISPR zmenil z pasívnych experimentálnych modelov na aktívne nástroje na objavovanie. Systematické funkčné skúmanie, ktoré umožňuje skríning celého genómu, naďalej odhaľuje základné biologické a terapeutické možnosti a upevňuje kultivované bunky ako nepostrádateľné nástroje pre moderný biologický výskum a vývoj liekov.