Ľudské primárne bunky

Čo sú primárne ľudské bunky?

Primárne bunky predstavujú najčistejšiu formu príslušných tkanív. Izolujú sa z tkaniva a spracúvajú tak, aby sa mohli usadiť v kultivačnom prostredí s ideálnymi podmienkami. Lepšie napodobňujú stav in vivo a vykazujú normálnu fyziológiu, pretože pochádzajú z tkaniva a nie sú modifikované. Z tohto dôvodu môžu slúžiť ako užitočné modely pre výskum v oblasti bunkovej farmakológie, toxikológie a fyziológie (vrátane štúdií metabolizmu, starnutia a signálnej transdukcie). Je potrebné mať na pamäti, že kultivácia a udržiavanie primárnych buniek je náročnejšie ako v prípade kontinuálnych bunkových línií, pretože majú kratšiu životnosť a po určitom počte bunkových delení prestanú delenie (alebo starnú). Štúdie signálnych dráh buniek komplikuje prirodzená variabilita primárnych buniek získaných od darcov a v dôsledku postupov subkultivácie. Pred začatím štúdií signálnych dráh výskumníci často vykonávajú skríning s cieľom zistiť, či bunky reagujú na bežne používané podnety. Aby sa zabránilo plytvaniu času a peňazí, primárne bunky možno pred skríningom stimulovať s cieľom aktivovať hlavné signálne dráhy.

Prečo používať ľudské primárne bunky?

Ako bunky na testovanie sa bežne používajú imortalizované bunkové línie. Vedci však uznali, že biologické zmeny spôsobené použitím týchto línií môžu byť na škodu pri skúmaní ich fyziologického významu. Použitie primárnych ľudských buniek zvyšuje fyziologickú hodnotu údajov získaných prostredníctvom bunkových kultúr a tieto bunky sa čoraz viac považujú za dôležité pri skúmaní biologických procesov, priebehu ochorení a vývoji liekov.

Ľudské primárne bunky sa široko využívajú v in vitro štúdiách medzibunkovej a intracelulárnej komunikácie, vývojovej biológie a mechanizmov ležiacich v základe rakoviny, Parkinsonovej choroby a cukrovky, ako aj v mnohých ďalších predklinických a výskumných oblastiach biologického výskumu. Výskumníci už dlho používajú imortalizované bunkové línie na štúdium funkcie tkanív; bunkové línie so zjavnými mutáciami a chromozómovými abnormalitami však nemusia byť dobrými náhradami normálnych buniek a vývoja ochorenia v jeho počiatočných štádiách. Presnejší model konkrétneho typu tkanivovej bunky je teraz možné dosiahnuť použitím primárnych ľudských buniek izolovaných z daného tkaniva a udržiavaných v kultivačných médiách a doplnkoch pre primárne bunky.

Čo je primárna bunková kultúra?

Namiesto použitia imortalizovaných bunkových línií spočíva primárna bunková kultúra v pestovaní buniek priamo z mnohobunkového organizmu mimo tela. V niektorých krajinách, napríklad vo Veľkej Británii, existuje právne uznanie skutočnosti, že primárne bunkové kultúry sú reprezentatívnejšie pre tkanivá in vivo než bunkové línie. Primárne bunky však na rast potrebujú správny substrát a živiny a po určitom počte delení vyvinú fenotyp starnutia, ktorý spôsobuje, že sa prestanú trvalo deliť. Tieto dva faktory motivujú vytvorenie bunkových línií. Tak prirodzene imortalizované primárne bunky (napr. HeLa bunky), ako aj umelo imortalizované primárne bunky (napr. HEK bunky) je možné v bunkovej kultúre kultivovať neobmedzene dlho.

Ľudské primárne bunky podľa typov tkanív

Epitelové bunky, fibroblasty, keratinocyty, melanocyty, endoteliálne bunky, svalové bunky, imunitné bunky a kmeňové bunky, ako sú mezenchýmové kmeňové bunky, patria medzi najčastejšie používané ľudské primárne bunky vo vedeckom výskume. Na začiatku sú kultúry heterogénne (predstavujú zmes typov buniek prítomných v tkanive) a in vitro ich možno udržať nažive len určitú dobu. Transformácia je in vitro proces, ktorý umožňuje manipuláciu s ľudskými primárnymi bunkami s cieľom získania neobmedzeného počtu subkultúr. Transformácia môže prebiehať prirodzene alebo ju môžu vyvolať chemikálie či vírusy. Po genetickej transformácii sa primárna kultúra môže pri dostatočnom množstve živín a priestoru neobmedzene deliť a vytvoriť tak imortalizovanú sekundárnu bunkovú líniu.

Endoteliálne bunky

Liečba rakoviny, hojenie rán, výskum bunkovej signalizácie, vysokokapacitné a obsahovo bohaté skríningy a toxikologické skríningy sú len niektoré z oblastí, ktoré môžu ťažiť z využitia primárnych endoteliálnych buniek ako výskumného nástroja.

Keratinocyty

Keratinocyty, získané z epidermis buď z kože dospelého človeka, alebo z predkožky novorodenca, zohrávajú kľúčovú úlohu pri štúdiu kožných ochorení, ako je psoriáza a rakovina.

Epitelové bunky

Od štúdií rakoviny až po toxikologické výskumy sa primárne epitelové bunky ukázali ako neoceniteľné zdroje pre modelovanie prirodzených obranných mechanizmov organizmu.

Fibroblasty

Indukcia pluripotentných kmeňových buniek (iPS) a štúdium hojenia rán sú len niektoré z mnohých spôsobov využitia primárnych fibroblastov.

Imunitné bunky

Mononukleárne bunky periférnej krvi, skrátene PBMC, sú mononukleárne bunky krvi s okrúhlym bunkovým jadrom. Patria medzi ne hlavne lymfocyty a monocyty, ktoré plnia dôležité funkcie v priebehu imunitnej reakcie. Mononukleárne bunky periférnej krvi sa často používajú na diagnostiku infekcií alebo na zistenie možnej ochrany po očkovaní. Poznatky o bunkovej imunitnej odpovedi sprostredkovanej T-bunkami sú často kľúčové.

Melanocyty

Melanocyty, špecializované kožné bunky produkujúce pigment melanín, slúžia ako modely pre výskum v oblastiach, ako je hojenie rán, toxicita, melanóm, kožná reakcia na ultrafialové (UV) žiarenie, kožné ochorenia a kozmetika.

Kmeňové bunky

Kmeňové bunky majú potenciál diferencovať sa na širokú škálu typov buniek. Vďaka svojej schopnosti diferenciácie poskytujú nové možnosti pre modelovanie ľudských tkanív a zdravotných stavov.

Mezenchymálne kmeňové bunky

Mezenchymálne kmeňové bunky, známe aj ako MSC, možno získať z rôznych ľudských zdrojov, ako je kostná dreň, tuk (tukové tkanivo), tkanivo pupočníka (Whartonova želatina) a plodová voda (tekutina obklopujúca plod), a dajú sa kultivovať in vitro. Tieto dospelé stromálne kmeňové bunky majú schopnosť vyvinúť sa do širokej škály buniek. Medzi tieto bunky patria napríklad kostné bunky, chrupavkové bunky, svalové bunky, nervové bunky, kožné bunky a bunky rohovky.

Bunky hladkého svalstva

V dutých orgánoch vystielajú primárne bunky hladkého svalstva (SMC) vnútornú stenu a sprostredkúvajú kontraktilitu. Okrem rakoviny a iných ochorení sa SMC môžu použiť na modelovanie fibrózy pri hypertenzii.

Primárne bunky a bunkové línie

Či už spontánnou mutáciou, ako v prípade transformovaných rakovinových bunkových línií, alebo zámernou zmenou, ako pri umelej produkcii rakovinových génov, získali kontinuálne bunkové línie schopnosť nekonečne sa rozmnožovať (sú imortalizované). Spravidla sú kontinuálne bunkové línie spoľahlivejšie a ich manipulácia je pohodlnejšia ako v prípade primárnych buniek. Môžu sa neobmedzene množiť a poskytujú rýchly prístup k dôležitým údajom. Použitie kontinuálnych bunkových línií má určité obmedzenia, vrátane skutočnosti, že sú geneticky modifikované/transformované, čo môže zmeniť ich fyziologické vlastnosti a nezodpovedať podmienkam in vivo, a že sa to môže v priebehu času pri značnom počte pasáží ďalej meniť.

Pokroky v kultivácii primárnych buniek

Primárne bunky majú povesť, že sa s nimi ťažko pracuje. Tento proces sa však stáva jednoduchším než kedykoľvek predtým vďaka pokroku v kultivácii primárnych buniek, dostupnosti komerčných primárnych buniek s plne optimalizovanými protokolmi a novým analytickým technikám, ktoré vyžadujú menej úsilia.

Prechod z dvojrozmernej na trojrozmernú bunkovú kultúru sa považuje za významný míľnik v tejto oblasti. Tkanivovo špecifická architektúra, interakcie medzi bunkami a mechanická/biochemická signalizácia môžu byť v 2D kultúre oslabené. Biologická hodnota týchto kultúr má teda svoje obmedzenia.

Na druhej strane trojrozmerná bunková kultúra umožňuje bunkám expandovať a interagovať s trojrozmernou extracelulárnou štruktúrou. To umožňuje bunkám vzájomne interagovať a komunikovať s extracelulárnou matricou, čím sa trojrozmerné kultúry stávajú fyziologicky relevantnejšími. Presnosť tejto metódy pri predpovedaní reakcií in vivo z nej urobila revolučnú metódu v oblastiach, ako je objavovanie a vývoj liekov. Z tohto dôvodu najmodernejšie technológie, ako sú organoidy odvodené od pacientov a „orgány na čipe“, poskytujú vysoko kontextové modely pre skríning a vývoj liekov.

Generovanie primárnych buniek je úzkym miestom v primárnej kultivácii. Na prekonanie tohto problému je zvyčajne potrebný väčší objem tkaniva, čo môže byť náročné dosiahnuť. Cestou vpred je však zlepšená analytická citlivosť. Napríklad potreba kultivovať veľké množstvá primárnych buniek sa znižuje využitím technológie na úrovni jednotlivých buniek, ktorá zahŕňa sekvenovanie, western blotting a hmotnostnú cytometriu.

Sľubné vyhliadky pre kultiváciu primárnych buniek

Celkové ťažkosti spojené s kultiváciou primárnych buniek sa zmierňujú vďaka technologickému pokroku. Táto metóda zase rýchlo nahrádza ostatné ako zlatý štandard v štúdiu a praxi bunkovej a molekulárnej biológie. Výroba vakcín, náhrada orgánov, terapie kmeňovými bunkami, výskum rakoviny a mnoho ďalších oblastí môže výrazne profitovať z neustáleho pokroku v kultivácii primárnych buniek.

Tipy a triky pre kultiváciu primárnych buniek

Požiadavky na expanziu buniek

Dve najbežnejšie metódy kultivácie primárnych buniek sú v suspenzii alebo na povrchu (2D). Niektoré bunky sú schopné voľne plávať v krvnom riečisku bez toho, aby sa k povrchu vôbec pripájali (napríklad bunky pochádzajúce z periférnej krvi). Niektoré bunkové línie boli geneticky upravené tak, aby prosperovali v suspenzných kultúrach, kde môžu dosiahnuť hustoty nedosiahnuteľné v podmienkach 2D rastu. Primárne bunky, ktoré na rast in vitro potrebujú ukotvenie, sa nazývajú adhezívne bunky a patria medzi ne aj bunky nachádzajúce sa v pevných tkanivách. Na zlepšenie adhéznych vlastností a dodanie ďalších signálov potrebných na rast a diferenciáciu sa tieto bunky zvyčajne kultivujú v plochých, nepovlečených plastových nádobách, prípadne na mikronosičoch. Tieto mikronosiče môžu byť povlečené proteínmi extracelulárnej matice (napríklad kolagénom a laminínom). Médium používané v bunkovej kultúre pozostáva zo základného média, ktoré bolo doplnené o vhodné rastové faktory a cytokíny. Bunkový inkubátor je špeciálny typ laboratórneho inkubátora, ktorý sa používa na kultiváciu a udržiavanie buniek pri špecifickej teplote a zmesi plynov (zvyčajne 37 °C, 5 % CO₂ pre bunky cicavcov). V závislosti od typu kultivovaných buniek sa optimálne podmienky môžu veľmi líšiť. V závislosti od typov pestovaných buniek bude optimálne rastové médium obsahovať jedinečnú kombináciu faktorov, vrátane, ale nielen, pH, koncentrácie glukózy, rastových faktorov a prítomnosti ďalších živín.

Prítomnosť antibiotík v rastovom médiu je kľúčová počas zakladania primárnej kultúry, aby sa zabránilo kontaminácii z hostiteľskej tkanivovej vzorky. Niektoré antibiotické režimy zahŕňajú kombináciu gentamicínu, penicilínu, streptomycínu a amfotericínu B. Používanie antibiotík počas dlhšieho časového obdobia sa však neodporúča, pretože niektoré látky (napríklad amfotericín B) môžu byť z dlhodobého hľadiska pre bunky toxické.

Väčšina primárnych buniek prechádza senescenciou a po určitom počte zdvojnásobení populácie prestáva delenie, čo znamená, že je kľúčové udržať ich nažive po izolácii. Dlhodobá životaschopnosť buniek si vyžaduje odborné techniky kultivácie buniek a ideálne kultivačné podmienky (vrátane správneho média, správnej teploty, správnej zmesi plynov, správneho pH, správnej koncentrácie rastových faktorov, prítomnosti živín a prítomnosti glukózy). Keďže mnohé z rastových faktorov používaných na obohatenie kultivačných médií sa získavajú z zvieracej krvi (zložky odvodené z krvi predstavujú riziko kontaminácie), odporúča sa ich použitie minimalizovať alebo sa im úplne vyhnúť. Dôležité je tiež dodržiavanie aseptických postupov.

Subkultivácia a udržiavanie

Keď sa izolované bunky priľnú k povrchu kultivačnej misky, znamená to začiatok fázy udržiavania. Priľnutie sa zvyčajne vyskytuje 24 hodín po začatí kultivácie. Bunky by sa mali subkultivovať, keď dosiahnu určité percento konfluencie a aktívne sa množia. Keďže bunky po dosiahnutí konfluencie môžu prechádzať diferenciáciou a po pasáži vykazovať pomalšiu proliferáciu, je najlepšie subkultivovať primárne bunkové kultúry skôr, ako dosiahnu 100 % konfluencie.

Subkultivácia v čerstvých médiách udržiava exponenciálny rast buniek závislých na ukotvení. Subkultivácia monovrstiev narúša inter- a intracelulárne interakcie na povrchu buniek. Na extrakciu adhezívnych primárnych buniek z monovrstiev alebo tkanív sa používajú nízke koncentrácie proteolytických enzýmov, ako je trypsín/EDTA. Po disociácii a zriedení do roztoku s jednotlivými bunkami sa bunky spočítajú a prenesú do čerstvých kultivačných nádob, kde sa opäť pripevnia a rozmnožia.

Kryokonzervácia a obnovenie

Kryokonzervácia zachováva živé bunky ich zmrazením pri nízkych teplotách. Kryokonzervácia a rozmrazovanie ľudských primárnych buniek zabraňuje ich smrti a poškodeniu počas skladovania a používania. Ľudské primárne bunky sa kryoprotektujú pomocou DMSO alebo glycerolu (pri správnej teplote a s kontrolovanou rýchlosťou zmrazovania). Proces zmrazovania musí prebiehať postupne, rýchlosťou -1 °C za minútu, aby sa zabránilo tvorbe ľadových kryštálov. Dlhodobé skladovanie vyžaduje tekutý dusík (-196 °C) alebo teploty pod -130 °C.

Na rozmrazenie kryokonzervovaných buniek stačí ponoriť zmrazené bunky do vodného kúpeľa s teplotou 37 °C na približne 1 až 2 minúty. Ľudské primárne bunky by sa nemali po rozmrazení z mrazničky odstreďovať (pretože sú mimoriadne citlivé na poškodenie počas zotavovania sa z kryokonzervácie). Je vhodné na nasadenie buniek ihneď po rozmrazení a podporuje ich priľnutie v kultúrach počas prvých 24 hodín po nasadení. 1 Po priľnutí kryokonzervovaných primárnych buniek je potrebné odstrániť použité kultivačné médium (pretože DMSO je pre primárne bunky škodlivé a môže spôsobiť pokles životaschopnosti po rozmrazení).