Ľudské primárne bunky

Čo sú ľudské primárne bunky?

Primárne bunky sú najčistejšou reprezentáciou príslušných tkanív. Sú izolované z tkaniva a spracované tak, aby sa mohli usadiť v kultivačnom prostredí s ideálnymi podmienkami. Presnejšie napodobňujú stav in vivo a vykazujú normálnu fyziológiu, pretože sú odvodené z tkaniva, a nie modifikované. Z tohto dôvodu môžu slúžiť ako užitočné modely pre výskum bunkovej farmakológie, toxikológie a fyziológie (vrátane štúdií metabolizmu, starnutia a prenosu signálov). Majte na pamäti, že primárne bunky sú náročnejšie na kultiváciu a udržiavanie ako kontinuálne bunkové línie, pretože majú kratšiu životnosť a po určitom počte delení sa prestanú deliť (alebo starnú). Štúdie bunkových signálnych dráh komplikuje prirodzená variabilita primárnych buniek získaných od darcov a prostredníctvom subkultúrnych postupov. Pred začatím štúdií signalizácie výskumníci často vykonávajú skríning, aby zistili, či bunky reagujú na bežne používané podnety. Aby sa predišlo plytvaniu časom a peniazmi, primárne bunky sa môžu pred skríningom stimulovať na aktiváciu hlavných signálnych dráh.

Prečo používať ľudské primárne bunky?

Na testovanie buniek sa bežne používajú imortalizované bunkové línie. Hoci vedci uznali, že biologické zmeny spôsobené bunkovými líniami môžu byť škodlivé pri skúmaní ich fyziologického významu. Používanie ľudských primárnych buniek zlepšuje fyziologickú hodnotu údajov získaných prostredníctvom bunkových kultúr a čoraz viac sa považujú za dôležité pri štúdiu biologických procesov, priebehu chorôb a vývoji liekov.

Ľudské primárne bunky sa široko využívajú v in vitro štúdiách medzibunkovej a vnútrobunkovej komunikácie, vývojovej biológie a mechanizmov, ktoré sú základom rakoviny, Parkinsonovej choroby a cukrovky, ako aj v mnohých iných predklinických a investigatívnych oblastiach biologického výskumu. Výskumníci už dlho používajú imortalizované bunkové línie na štúdium funkcie tkanív; bunkové línie so zjavnými mutáciami a chromozomálnymi abnormalitami však nemusia byť dobrými náhradami normálnych buniek a vývoja ochorenia v jeho počiatočných štádiách. Presnejší model špecifického typu buniek tkaniva možno teraz dosiahnuť použitím ľudských primárnych buniek izolovaných z tohto tkaniva a udržiavaných v primárnych kultivačných médiách a doplnkoch.

Čo je primárna bunková kultúra?

Namiesto používania imortalizovaných bunkových línií zahŕňa primárna bunková kultúra pestovanie buniek priamo z mnohobunkového organizmu mimo tela. V niektorých krajinách, napríklad v Spojenom kráľovstve, existuje právne uznanie skutočnosti, že primárne bunkové kultúry sú reprezentatívnejšie pre tkanivá in vivo ako bunkové línie. Napriek tomu primárne bunky potrebujú na svoj rast správny substrát a živiny a po určitom počte delení sa u nich vyvinie senescentný fenotyp, ktorý spôsobí, že sa natrvalo prestanú deliť. Tieto dva faktory motivujú vytváranie bunkových línií. Prirodzene imortalizované primárne bunky (napr. bunky HeLa) aj umelo imortalizované primárne bunky (napr. bunky HEK) sa môžu v bunkovej kultúre kultivovať neobmedzene dlho.

Ľudské primárne bunky podľa typov tkanív

Epitelové bunky, fibroblasty, keratinocyty, melanocyty, endotelové bunky, svalové bunky, imunitné bunky a kmeňové bunky, ako sú mezenchymálne kmeňové bunky, patria medzi najčastejšie používané ľudské primárne bunky vo vedeckých štúdiách. Na začiatok treba povedať, že tieto kultúry sú heterogénne (predstavujú zmes typov buniek prítomných v tkanive) a možno ich udržať pri živote in vitro len určitý čas. Transformácia je proces in vitro, ktorý umožňuje manipuláciu s ľudskými primárnymi bunkami na neobmedzený počet subkultúr. Transformácia môže prebiehať prirodzene alebo môže byť vyvolaná chemickými látkami alebo vírusmi. Po absolvovaní genetickej transformácie sa primárna kultúra môže neobmedzene deliť na imortalizovanú sekundárnu bunkovú líniu, ak má dostatok živín a priestoru.

Endotelové bunky

Liečba rakoviny, hojenie rán, výskum bunkovej signalizácie, vysoko výkonný a vysoko obsahový skríning a toxikologický skríning sú len niektoré z oblastí, ktoré môžu mať prospech z použitia primárnych endotelových buniek ako výskumného nástroja.

Keratinocyty

Keratinocyty získané z epidermy buď dospelej ľudskej kože, alebo novorodeneckej predkožky zohrávajú kľúčovú úlohu pri štúdiu kožných ochorení, ako je psoriáza a rakovina.

Epitelové bunky

Primárne epitelové bunky sa ukázali byť neoceniteľným zdrojom na modelovanie prirodzenej obranyschopnosti organizmu, od štúdií rakoviny až po toxikologické výskumy.

Fibroblasty

Indukcia pluripotentných kmeňových buniek (iPS) a štúdium hojenia rán sú len niektoré z mnohých využití primárnych fibroblastov.

Imunitné bunky

Mononukleárne bunky periférnej krvi, skrátene PBMC, sú jednojadrové bunky krvi s okrúhlym bunkovým jadrom. Zahŕňajú najmä lymfocyty a monocyty, ktoré v priebehu imunitnej odpovede preberajú dôležité funkcie. Mononukleárne bunky periférnej krvi sa často používajú na diagnostiku infekcií alebo na zisťovanie možnej ochrany pred očkovaním. Vhľad do bunkovej imunitnej odpovede sprostredkovanej T-bunkami je často kľúčový.

Melanocyty

Melanocyty, špecializované kožné bunky, ktoré produkujú pigment melanín, sú užitočné ako modely pre výskum tém, ako je hojenie rán, toxicita, melanóm, kožná odpoveď na ultrafialové (UV) žiarenie, kožné choroby a kozmetika.

Kmeňové bunky

Kmeňové bunky majú potenciál diferencovať sa na širokú škálu typov buniek. Vďaka svojej schopnosti diferencovať sa poskytujú nové možnosti modelovania ľudských tkanív a zdravotných stavov.

Mezenchýmové kmeňové bunky

Mezenchýmové kmeňové bunky, známe aj ako MSC, možno získať z rôznych ľudských zdrojov, ako je kostná dreň, tuk (tukové tkanivo), tkanivo pupočníka (Whartonovo želé) a plodová voda (tekutina obklopujúca plod), a možno ich expandovať in vitro. Tieto dospelé stromálne kmeňové bunky majú schopnosť vyvinúť sa do širokej škály typov buniek. Niektoré z týchto typov buniek zahŕňajú kostné bunky, bunky chrupavky, svalové bunky, nervové bunky, kožné bunky a bunky rohovky.

Hladké svalové bunky

V dutých orgánoch primárne hladké svalové bunky (SMC) lemujú vnútro a sprostredkúvajú kontraktilitu. Okrem rakoviny a iných ochorení sa SMC môžu použiť na modelovanie hypertenznej fibrózy.

Primárne bunky a bunkové línie

Buď spontánnou mutáciou, ako v transformovaných rakovinových bunkových líniách, alebo zámernou zmenou, ako pri umelej produkcii rakovinových génov, získali kontinuálne bunkové línie potenciál nekonečného množenia (imortalizácia). Kontinuálne bunkové línie sú spravidla spoľahlivejšie a vhodnejšie na prácu ako primárne bunky. Môžu sa donekonečna rozširovať a poskytujú rýchly prístup k dôležitým údajom. Používanie kontinuálnych bunkových línií má určité obmedzenia vrátane skutočnosti, že sú geneticky modifikované/transformované, čo môže zmeniť fyziologické vlastnosti a nezodpovedať stavu in vivo, a že sa to môže časom ďalej meniť pri výraznom pasážovaní.

Pokroky v primárnej bunkovej kultúre

Primárne bunky majú notoricky známu povesť buniek, s ktorými sa ťažko pracuje. Tento proces sa však stáva jednoduchším ako kedykoľvek predtým vďaka vývoju v oblasti primárnych bunkových kultúr, dostupnosti komerčných primárnych buniek s plne optimalizovanými protokolmi a novým analytickým technikám, ktoré vyžadujú menej vstupných údajov.

Posun od dvojrozmernej ku trojrozmernej bunkovej kultúre sa považuje za významný míľnik v tejto oblasti. Tkanivovo špecifická architektúra, interakcie medzi bunkami a mechanická/biochemická signalizácia môžu byť v dvojrozmernej kultúre oslabené. Biologická hodnota týchto kultúr je teda obmedzená.

Na druhej strane 3D bunkové kultúry umožňujú bunkám expandovať a interagovať s 3D extracelulárnym rámcom. Bunky tak môžu interagovať medzi sebou navzájom a s extracelulárnou matricou, vďaka čomu sú 3D kultúry fyziologicky relevantnejšie. Vďaka presnosti tejto metódy pri predpovedaní reakcií in vivo sa stala revolučnou v oblastiach, ako je objavovanie a vývoj liekov. Z tohto dôvodu poskytujú najmodernejšie technológie, ako sú organoidy získané od pacientov a orgány na čipe, vysoko kontextuálne modely na skríning a vývoj liekov.

Generovanie primárnych buniek je úzkym miestom v primárnej kultúre. Na jej prekonanie sa zvyčajne vyžaduje väčší objem tkaniva, čo môže byť náročné. Lepšia analytická citlivosť však poskytuje cestu vpred. Potreba kultivovať veľké množstvá primárnych buniek sa napríklad znižuje používaním jednobunkovej technológie, ktorá zahŕňa sekvenovanie, western blotting a hmotnostnú cytometriu.

Sľubné vyhliadky pre primárne bunkové kultúry

Celkové ťažkosti primárnych bunkových kultúr sa zmierňujú technologickým pokrokom. Na druhej strane táto metóda rýchlo nahrádza ostatné ako zlatý štandard v štúdiu a praxi bunkovej a molekulárnej biológie. Výroba vakcín, náhrada orgánov, terapia kmeňovými bunkami, výskum rakoviny a mnohé ďalšie oblasti môžu mať veľký prospech z pokračujúceho pokroku v oblasti primárnych bunkových kultúr.

Tipy a triky pre primárne bunkové kultúry

Potreby expanzie buniek

Dve najbežnejšie metódy kultivácie primárnych buniek sú v suspenzii alebo na povrchu (2D). Niektoré bunky sú schopné voľne plávať v krvnom riečisku bez toho, aby niekedy priľnuli k povrchu (napríklad bunky získané z periférnej krvi). Rôzne bunkové línie boli vyvinuté tak, aby sa im darilo v suspenzných kultúrach, kde môžu dosiahnuť hustotu nedosiahnuteľnú v podmienkach 2D rastu. Primárne bunky, ktoré potrebujú ukotvenie, aby mohli rásť in vitro, sa nazývajú adherentné bunky a patria medzi ne aj tie, ktoré sa nachádzajú v pevných tkanivách. Na zlepšenie adhéznych vlastností a dodávanie ďalších signálov potrebných na rast a diferenciáciu sa tieto bunky zvyčajne kultivujú v plochej nepotiahnutej plastovej nádobe, ale občas aj v mikronosiči. Táto posledná možnosť môže byť potiahnutá proteínmi extracelulárnej matrice (ako je kolagén a laminín). Médium používané pri kultivácii buniek pozostáva zo základného média, ktoré bolo doplnené vhodnými rastovými faktormi a cytokínmi. Bunkový inkubátor je špeciálny typ laboratórneho inkubátora, ktorý sa používa na kultiváciu a udržiavanie buniek pri špecifickej teplote a zmesi plynov (zvyčajne 37 °C, 5 % CO2 pre bunky cicavcov). V závislosti od typu kultivovanej bunky môžu byť optimálne podmienky veľmi odlišné. V závislosti od typu pestovaných buniek bude mať optimálne rastové médium jedinečnú kombináciu faktorov, okrem iného vrátane pH, koncentrácie glukózy, rastových faktorov a prítomnosti iných živín.

Antibiotiká v rastovom médiu sú počas zakladania primárnej kultúry kľúčové, aby sa zabránilo kontaminácii z hostiteľského tkaniva. Niektoré antibiotické režimy obsahujú kombináciu gentamicínu, penicilínu, streptomycínu a amfotericínu B. Používanie antibiotík počas dlhšieho obdobia sa však neodporúča, pretože niektoré činidlá (ako napríklad amfotericín B) môžu byť pre bunky dlhodobo toxické.

Väčšina primárnych buniek prechádza senescenciou a prestáva sa deliť po určitom počte zdvojení populácie, preto je veľmi dôležité, aby sa po izolácii udržali pri živote. Dlhodobá životaschopnosť buniek si vyžaduje odborné techniky kultivácie buniek a ideálne kultivačné podmienky (vrátane správneho média, správnej teploty, správnej zmesi plynov, správneho pH, správnej koncentrácie rastových faktorov, prítomnosti živín a prítomnosti glukózy). Keďže mnohé rastové faktory používané na doplnenie médií sa získavajú zo zvieracej krvi (zložky pochádzajúce z krvi majú potenciál kontaminácie), odporúča sa minimalizovať ich používanie alebo sa im úplne vyhnúť. Je tiež dôležité používať aseptickú techniku.

Subkultúra a údržba

Keď izolované bunky priľnú k povrchu kultivačnej misky, znamená to začiatok udržiavacej fázy. K prichyteniu zvyčajne dochádza 24 hodín po začatí kultivácie. Bunky by sa mali subkultúrovať, keď dosiahnu určité percento konfluencie a aktívne sa replikujú. Keďže postkonfluentné bunky môžu po pasáži podliehať diferenciácii a vykazovať pomalšiu proliferáciu, je najlepšie subkultúrovať primárne bunkové kultúry pred dosiahnutím 100 % konfluencie.

Subkultivácia v čerstvých médiách udržiava exponenciálny rast buniek závislých od ukotvenia. Subkultivácia monovrstvy narúša medzibunkové a vnútrobunkové interakcie na povrchu buniek. Na extrakciu adherentných primárnych buniek z monovrstiev alebo tkanív sa používajú nízke koncentrácie proteolytických enzýmov, ako je trypsín/EDTA. Po disociácii a zriedení do jednobunkového roztoku sa bunky spočítajú a prenesú do čerstvých kultivačných nádob, aby sa znovu pripojili a rozmnožili.

Kryokonzervácia a regenerácia

Kryokonzervácia uchováva živé bunky zmrazením pri nízkych teplotách. Kryokonzervácia a rozmrazovanie ľudských primárnych buniek zabraňuje odumieraniu a poškodeniu buniek počas skladovania a používania. Ľudské primárne bunky sa kryoprotektúrujú pomocou DMSO alebo glycerolu (pri správnej teplote a kontrolovanej rýchlosti zmrazovania). Proces zmrazovania musí byť postupný, pri -1 °C každú minútu, aby sa zabránilo tvorbe ľadových kryštálov. Dlhodobé skladovanie si vyžaduje tekutý dusík (-196 °C) alebo teploty nižšie ako -130 °C.

Na rozmrazenie kryokonzervovaných buniek stačí ponoriť ich do vodného kúpeľa s teplotou 37 °C na približne 1 až 2 minúty. Ľudské primárne bunky by sa po rozmrazení z mrazničky nemali centrifugovať (pretože sú mimoriadne citlivé na poškodenie počas obnovy po kryokonzervácii). Je vhodný na plátovanie buniek ihneď po rozmrazení a podporuje prichytenie v kultúrach počas prvých 24 hodín po plátovaní. 1 Po pripojení kryokonzervovaných primárnych buniek je potrebné odstrániť použité médium (keďže DMSO je pre primárne bunky škodlivý a môže spôsobiť pokles životaschopnosti po rozmrazení).