Kultúra buniek cicavcov: Základy a techniky
Bunkové kultúry cicavcov sú základnou technikou biologického výskumu, ktorá umožňuje vedcom študovať bunky v kontrolovanom prostredí mimo živých organizmov. Tento proces zahŕňa izoláciu buniek z tkanív, ich udržiavanie v starostlivo kontrolovaných podmienkach a ich rozmnožovanie na rôzne experimentálne účely. Bunkové kultúry cicavcov sú kľúčové pre pochopenie bunkových procesov, mechanizmov chorôb a vývoj nových terapií vrátane tých, ktoré využívajú nesmrteľné bunkové línie
Kľúčové poznatky:
- Bunky možno izolovať z tkanív pomocou metód enzymatického rozkladu alebo explantátovej kultúry
- Primárne bunky majú obmedzenú životnosť, zatiaľ čo imortalizované bunkové línie sa môžu množiť neobmedzene dlho
- Podmienky kultivácie vrátane zloženia rastového média sú rozhodujúce pre prežitie a proliferáciu buniek
- Bunky sa môžu pestovať v suspenzii alebo ako adherentné kultúry v závislosti od ich typu a výskumných potrieb
- Medzi bežné kultivačné médiá patria MEM, DMEM a RPMI 1640, pričom každé z nich je prispôsobené pre špecifické typy buniek
- Typické podmienky rastu zahŕňajú teplotu 37 °C, 5 % CO2 a 95 % relatívnu vlhkosť
- Čoraz častejšie sa používajú alternatívy séra, ako je ľudský trombocytový lyzát (hPL), aby sa predišlo možným problémom s kontamináciou
Techniky izolácie buniek
Proces vytvárania bunkovej kultúry sa začína izoláciou buniek z tkanív. Existuje niekoľko metód, ako to dosiahnuť, pričom každá z nich je vhodná pre rôzne typy tkanív a výskumné ciele. V prípade krvných vzoriek je izolácia buniek pomerne jednoduchá, pričom sa na kultiváciu zameriavajú predovšetkým biele krvinky vzhľadom na ich rastové schopnosti. Pevné tkanivá si vyžadujú zložitejšie techniky izolácie. Jedna z bežných metód zahŕňa enzymatickú digesciu, pri ktorej sa na rozklad extracelulárnej matrice používajú enzýmy ako kolagenáza, trypsín alebo pronáza, čím sa jednotlivé bunky uvoľnia do suspenzie. Výskumníci môžu tiež použiť metódu explantátovej kultúry, pri ktorej sa malé kúsky tkaniva umiestnia priamo do rastového média, čím sa umožní bunkám migrovať a množiť sa. Výber medzi týmito metódami často závisí od konkrétneho typu tkaniva, požadovanej bunkovej populácie a zamýšľaného experimentálneho použitia. Je dôležité poznamenať, že bunky izolované priamo z organizmu sa označujú ako primárne bunky a až na niektoré výnimky, ako sú nádorové bunky, majú zvyčajne obmedzenú životnosť v kultúre, než prejdú senescenciou
Základné produkty pre bunkové kultúry cicavcov
| Názov produktu | Číslo produktu | Kategória | Použitie |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/l glukózy, w: 4 mM L-glutamínu, w: 1,5 g/l NaHCO3, w: 1,0 mM pyruvátu sodného | 820300a | Kultivačné médiá | Všeobecné médium pre rôzne typy buniek cicavcov |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/l glukózy, w: 1,6 mM L-glutamínu, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM pyruvátu sodného, w: 1,2 g/l NaHCO3 | 820400a | Kultivačné médiá | Vhodné pre širokú škálu buniek cicavcov, najmä epitelových buniek |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabilný glutamín, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kultivačné médiá | Bežne používané pre lymfoidné bunky a hybridné bunkové línie |
| Accutase | 830100 | Disociácia buniek | Šetrný roztok na oddeľovanie buniek pre adherentné bunky |
| Zmrazovacie médium CM-1 | 800150 | Kryokonzervácia | Na zmrazenie a dlhodobé skladovanie buniek cicavcov |
| Mraziace médium CM-ACF, bez séra | 800650 | Kryokonzervácia | Médium na zmrazovanie buniek bez živočíšnych zložiek |
| PBS | 860015 | Pufrovací roztok | Na premývanie buniek a udržiavanie rovnováhy pH |
| Médium na rast endotelových buniek | 820731 | Špecializované médium | Optimalizované na kultiváciu endotelových buniek |
| Testovanie mykoplaziem | 900159 | Kontrola kvality | Základné na zisťovanie kontaminácie mykoplazmami v kultúrach |
| Overovanie pravosti bunkových línií - ľudské | 900154 | Kontrola kvality | Overuje identitu ľudských bunkových línií |
Táto tabuľka predstavuje výber základných produktov pre bunkové kultúry cicavcov. Kompletný sortiment produktov pre bunkové kultúry vrátane špecializovaných médií a reagencií nájdete na stránke kategórie Médiá a reagencie.
- šetrná alternatíva trypsínu
Accutase je roztok na oddeľovanie buniek, ktorý spôsobuje revolúciu v odvetví bunkových kultúr. Je to zmes proteolytických a kolagenolických enzýmov, ktorá napodobňuje účinok trypsínu a kolagenázy. Na rozdiel od trypsínu Accutase neobsahuje žiadne cicavčie ani bakteriálne zložky a je oveľa šetrnejší k bunkám, čo z neho robí ideálny roztok na rutinné oddeľovanie buniek od štandardného plastového riadu na kultiváciu tkanív a plastového riadu s adhéznym povlakom. V tomto príspevku na blogu sa budeme venovať výhodám a použitiu Accutase a tomu, ako mení pravidlá hry v oblasti bunkových kultúr.
Výhody Accutase
Accutase má oproti tradičným roztokom trypsínu niekoľko výhod. Po prvé, možno ju použiť vždy, keď je potrebné jemné a účinné oddelenie akejkoľvek adherentnej bunkovej línie, čím priamo nahrádza trypsín. Po druhé, Accutase funguje veľmi dobre na embryonálnych a neurónových kmeňových bunkách a bolo preukázané, že zachováva životaschopnosť týchto buniek po pasážovaní. Po tretie, Accutase zachováva väčšinu epitopov pre následnú analýzu prietokovou cytometriou, takže je ideálna na analýzu markerov bunkového povrchu.
Okrem toho sa Accutase nemusí neutralizovať pri pasážovaní adherentných buniek. Pridaním väčšieho množstva média po rozdelení buniek sa Accutase zriedi, takže už nie je schopná oddeliť bunky. Tým sa eliminuje potreba inaktivácie a šetrí sa čas technikov bunkových kultúr. A nakoniec, Accutase sa nemusí alikvótovať a fľaša je stabilná v chladničke 2 mesiace.
Aplikácie Accutase
Accutase je priamou náhradou roztoku trypsínu a môže sa použiť na pasážovanie bunkových línií. Okrem toho sa Accutase dobre osvedčuje pri oddeľovaní buniek na analýzu mnohých povrchových markerov buniek pomocou prietokovej cytometrie a na triedenie buniek. Medzi ďalšie následné aplikácie ošetrenia Accutase patrí analýza povrchových markerov buniek, test rastu vírusov, proliferácia buniek, testy migrácie nádorových buniek, rutinné pasážovanie buniek, zväčšovanie výroby (bioreaktor) a prietoková cytometria.
Zloženie Accutase
Accutase neobsahuje žiadne cicavčie ani bakteriálne zložky a je zmesou prírodných enzýmov s proteolytickou a kolagenolytickou enzýmovou aktivitou. Je formulovaná v oveľa nižšej koncentrácii ako trypsín a kolagenáza, takže je menej toxická a šetrnejšia, ale rovnako účinná.
Účinnosť Accutase
Ukázalo sa, že Accutase je účinná pri oddeľovaní primárnych a kmeňových buniek a udržiavaní vysokej životaschopnosti buniek v porovnaní s enzýmami živočíšneho pôvodu, ako je trypsín. po 10 minútach sa obnoví 100 % buniek a vďaka autodigescii Accutase nie je na škodu ponechať bunky v Accutase až 45 minút.
Zhrnutie
Na záver možno povedať, že Accutase je výkonné riešenie, ktoré mení pravidlá hry v oblasti bunkových kultúr. Vďaka svojej šetrnosti, účinnosti a všestrannosti je Accutase ideálnou alternatívou trypsínu. Ak hľadáte spoľahlivé a účinné riešenie na oddeľovanie buniek, Accutase je riešenie pre vás.
Fyziologický roztok s fosfátovým pufrom (PBS) je široko používaný tlmivý roztok v biologickom a chemickom výskume. Zohráva kľúčovú úlohu pri udržiavaní rovnováhy pH a osmolarity počas rôznych experimentálnych postupov vrátane spracovania tkanív a bunkových kultúr. Náš roztok PBS je starostlivo pripravený z vysoko čistých zložiek, aby sa zabezpečila stabilita a spoľahlivosť pri každom experimente. Osmolarita a koncentrácie iónov nášho roztoku PBS presne kopírujú koncentrácie v ľudskom tele, takže je izotonický a netoxický pre väčšinu buniek.
Zloženie nášho roztoku PBS
Náš roztok PBS je zmesou fosfátových pufrov a fyziologických roztokov ultračistej kvality s upraveným pH. V 1X pracovnej koncentrácii obsahuje:
8000 mg/l chloridu sodného (NaCl)
200 mg/L chlorid draselný (KCl)
1150 mg/L fosforečnan sodný dvojzložkový bezvodý (Na2HPO4)
200 mg/L Fosforečnan draselný jednozložkový bezvodý (KH2PO4)
Toto zloženie zabezpečuje optimálne pH a iónovú rovnováhu, vhodné pre širokú škálu biologických aplikácií.
Aplikácie nášho roztoku PBS
Náš roztok PBS je ideálny na rôzne aplikácie v biologickom výskume. Vďaka svojim izotonickým a netoxickým vlastnostiam je vhodný na riedenie látok a oplachovanie bunkových nádob. Roztoky PBS obsahujúce EDTA sú účinné na uvoľnenie prichytených a zhlukovaných buniek. Do PBS by sa však nemali pridávať dvojmocné kovy, ako napríklad zinok, pretože môžu spôsobiť zrážanie. V takýchto prípadoch sa odporúčajú Goodove pufre. Okrem toho je náš roztok PBS prijateľnou alternatívou vírusového transportného média na transport a skladovanie RNA vírusov vrátane SARS-CoV-2.
Kontrola kvality
Sterilne filtrované
Skladovanie a trvanlivosť
Skladujte pri teplote +2 °C až +25 °C, chránené pred svetlom.
Po otvorení skladujte pri teplote 2 °C až 25 °C a spotrebujte do 24 mesiacov.
Podmienky prepravy
Okolitá teplota
Údržba
Uchovávajte v chlade pri teplote +2°C až +8°C v tme. Vyhnite sa zmrazovaniu a častému zohrievaniu na +37 °C, pretože sa tým znižuje kvalita výrobku.
Neohrievajte médium na teplotu vyššiu ako 37 °C ani nepoužívajte nekontrolované zdroje tepla, napríklad mikrovlnné zariadenia.
Ak sa má použiť len časť média, odoberte požadované množstvo a pred použitím ho zohrejte na izbovú teplotu.
Zloženie
Kategória
Zložky
Koncentrácia (mg/l)
Soli
Chlorid draselný
200
Fosforečnan draselný monobázický bezvodý
200
Chlorid sodný
8000
Fosforečnan sodný dvojzložkový bezvodý
1150
Metóda analýzy
CLS ponúka krátkodobé aj dlhodobé testovanie na detekciu mykoplazmy. V prvom prípade sa vzorky testujú ihneď po príchode, zatiaľ čo v druhom prípade sa začne kultivácia buniek a bunky sa testujú po 14 dňoch kultivácie bez antibiotík. Testovanie mykoplaziem sa vykonáva pomocou dvojbodového detekčného systému so súpravou PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) a súpravou Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Vzorky
Na rýchly test poskytnite minimálne 50 µl bunkovej suspenzie obsahujúcej 50 000 buniek. Bunkovú suspenziu možno dodať pri teplote okolia.
Pre prémiový test poskytnite minimálne 1 milión buniek vo vhodnom zmrazovacom médiu, aby sa zabezpečila robustná a zdravá kultúra na kultiváciu a následné testovanie buniek. Vzorky zasielajte na suchom ľade.
Vyplňte formulár na testovanie vzoriek mykoplazmy a priložte ho k zásielke vzoriek.
Kolorimetrický reportérový test
Tento test je kolorimetrický test na báze buniek. V prítomnosti mykoplazmy indukuje reportérová bunková línia signalizačnú kaskádu, ktorá spustí zmenu farby média z červenej na modrú. Test sa vykonáva v 96-jamkových viacjadrových platničkách. Signály sa detekujú v mikrotitračnom spektrofotometri pri vlnovej dĺžke 620
- 655 nm. Detegujú sa všetky druhy mykoplaziem a acholeplaziem, ale aj iné kontaminanty v bunkovej kultúre, ako sú baktérie.
Izotermická amplifikácia
Izotermická amplifikácia je rýchly a spoľahlivý test založený na izotermickej amplifikácii DNA špecifickej pre mykoplazmu v kombinácii s detekciou v reálnom čase pomocou farbiva interkalujúceho DNA. Test je schopný detegovať šesť najbežnejších druhov, ktoré predstavujú > 95 % kontaminácií: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis a A.laidlawii. Vďaka sekvenčnej homológii sa zistia aj iné druhy mykoplaziem (M.pneumoniae, M.gallisepticum a M.synoviae). Na určenie, či je vzorka mykoplazma pozitívna alebo negatívna, sa skúma teplota topenia (Tm).
Záver: Kľúčová úloha kultúr cicavčích buniek v modernom výskume
Bunkové kultúry cicavcov spôsobili revolúciu v biologickom a lekárskom výskume a poskytli vedcom výkonné nástroje na štúdium komplexných bunkových procesov, mechanizmov chorôb a potenciálnych terapeutických zásahov. Od izolácie primárnych buniek až po vývoj imortalizovaných bunkových línií sa táto technika stala nepostrádateľnou súčasťou moderného vedeckého súboru nástrojov
Cesta bunkových kultúr cicavcov sa začína starostlivými technikami izolácie, pokračuje cez starostlivé udržiavanie buniek v špecializovaných médiách a vrcholí širokou škálou aplikácií v rôznych oblastiach štúdia. Či už ide o výskum rakoviny, objavovanie liečiv alebo základnú bunkovú biológiu, schopnosť pestovať a manipulovať s bunkami cicavcov in vitro otvorila nevídané možnosti vedeckého bádania
Kľúčom k úspechu kultivácie buniek cicavcov sú starostlivo kontrolované podmienky, v ktorých sa bunky udržiavajú. Od zloženia rastových médií až po presné parametre prostredia v inkubátoroch - každý aspekt je optimalizovaný tak, aby čo najlepšie napodobňoval prirodzené podmienky buniek. Táto pozornosť venovaná detailom zabezpečuje spoľahlivosť a reprodukovateľnosť experimentov, ktoré sú základom správnej vedeckej praxe
Vývoj imortalizovaných bunkových línií, ako sú napríklad široko používané bunky HeLa, ďalej rozšíril možnosti bunkových kultúr. Tieto bunkové línie poskytujú konzistentné, ľahko dostupné bunkové modely, ktoré urýchlili výskum v mnohých disciplínach
Pri pohľade do budúcnosti sa bunkové kultúry cicavcov naďalej vyvíjajú. Pokroky v technikách 3D kultivácie, vývoji organoidov a používaní chemicky definovaných médií posúvajú hranice možností bunkových kultúr. Tento vývoj sľubuje, že modely in vitro sa ešte viac priblížia komplexnosti systémov in vivo, čo môže spôsobiť revolúciu v objavovaní liekov, personalizovanej medicíne a našom chápaní ľudskej biológie
Na záver možno konštatovať, že bunkové kultúry cicavcov zostávajú dynamickou a nevyhnutnou technikou vo výskume v oblasti vied o živej prírode. Jej ďalšie zdokonaľovanie a uplatňovanie bude nepochybne zohrávať kľúčovú úlohu pri riešení niektorých z najnaliehavejších otázok v biológii a medicíne a bude hnacou silou vedeckého pokroku v nasledujúcich rokoch