Kultúra buniek cicavcov: Základy a techniky
Bunkové kultúry cicavcov sú základnou technikou biologického výskumu, ktorá umožňuje vedcom študovať bunky v kontrolovanom prostredí mimo živých organizmov. Tento proces zahŕňa izoláciu buniek z tkanív, ich udržiavanie v starostlivo kontrolovaných podmienkach a ich rozmnožovanie na rôzne experimentálne účely. Bunkové kultúry cicavcov sú kľúčové pre pochopenie bunkových procesov, mechanizmov chorôb a vývoj nových terapií vrátane tých, ktoré využívajú nesmrteľné bunkové línie
Kľúčové poznatky:
- Bunky možno izolovať z tkanív pomocou metód enzymatického rozkladu alebo explantátovej kultúry
- Primárne bunky majú obmedzenú životnosť, zatiaľ čo imortalizované bunkové línie sa môžu množiť neobmedzene dlho
- Podmienky kultivácie vrátane zloženia rastového média sú rozhodujúce pre prežitie a proliferáciu buniek
- Bunky sa môžu pestovať v suspenzii alebo ako adherentné kultúry v závislosti od ich typu a výskumných potrieb
- Medzi bežné kultivačné médiá patria MEM, DMEM a RPMI 1640, pričom každé z nich je prispôsobené pre špecifické typy buniek
- Typické podmienky rastu zahŕňajú teplotu 37 °C, 5 % CO2 a 95 % relatívnu vlhkosť
- Čoraz častejšie sa používajú alternatívy séra, ako je ľudský trombocytový lyzát (hPL), aby sa predišlo možným problémom s kontamináciou
Techniky izolácie buniek
Proces vytvárania bunkovej kultúry sa začína izoláciou buniek z tkanív. Existuje niekoľko metód, ako to dosiahnuť, pričom každá z nich je vhodná pre rôzne typy tkanív a výskumné ciele. V prípade krvných vzoriek je izolácia buniek pomerne jednoduchá, pričom sa na kultiváciu zameriavajú predovšetkým biele krvinky vzhľadom na ich rastové schopnosti. Pevné tkanivá si vyžadujú zložitejšie techniky izolácie. Jedna z bežných metód zahŕňa enzymatickú digesciu, pri ktorej sa na rozklad extracelulárnej matrice používajú enzýmy ako kolagenáza, trypsín alebo pronáza, čím sa jednotlivé bunky uvoľnia do suspenzie. Výskumníci môžu tiež použiť metódu explantátovej kultúry, pri ktorej sa malé kúsky tkaniva umiestnia priamo do rastového média, čím sa umožní bunkám migrovať a množiť sa. Výber medzi týmito metódami často závisí od konkrétneho typu tkaniva, požadovanej bunkovej populácie a zamýšľaného experimentálneho použitia. Je dôležité poznamenať, že bunky izolované priamo z organizmu sa označujú ako primárne bunky a až na niektoré výnimky, ako sú nádorové bunky, majú zvyčajne obmedzenú životnosť v kultúre, než prejdú senescenciou
Základné produkty pre bunkové kultúry cicavcov
| Názov produktu | Číslo produktu | Kategória | Použitie |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/l glukózy, w: 4 mM L-glutamínu, w: 1,5 g/l NaHCO3, w: 1,0 mM pyruvátu sodného | 820300a | Kultivačné médiá | Všeobecné médium pre rôzne typy buniek cicavcov |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/l glukózy, w: 1,6 mM L-glutamínu, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM pyruvátu sodného, w: 1,2 g/l NaHCO3 | 820400a | Kultivačné médiá | Vhodné pre širokú škálu buniek cicavcov, najmä epitelových buniek |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabilný glutamín, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kultivačné médiá | Bežne používané pre lymfoidné bunky a hybridné bunkové línie |
| Accutase | 830100 | Disociácia buniek | Šetrný roztok na oddeľovanie buniek pre adherentné bunky |
| Zmrazovacie médium CM-1 | 800150 | Kryokonzervácia | Na zmrazenie a dlhodobé skladovanie buniek cicavcov |
| Mraziace médium CM-ACF, bez séra | 800650 | Kryokonzervácia | Médium na zmrazovanie buniek bez živočíšnych zložiek |
| PBS | 860015 | Pufrovací roztok | Na premývanie buniek a udržiavanie rovnováhy pH |
| Médium na rast endotelových buniek | 820731 | Špecializované médium | Optimalizované na kultiváciu endotelových buniek |
| Testovanie mykoplaziem | 900159 | Kontrola kvality | Základné na zisťovanie kontaminácie mykoplazmami v kultúrach |
| Overovanie pravosti bunkových línií - ľudské | 900154 | Kontrola kvality | Overuje identitu ľudských bunkových línií |
Táto tabuľka predstavuje výber základných produktov pre bunkové kultúry cicavcov. Kompletný sortiment produktov pre bunkové kultúry vrátane špecializovaných médií a reagencií nájdete na stránke kategórie Médiá a reagencie.
Accutase je pripravený na použitie, sterilne filtrovaný roztok na oddelenie buniek, navrhnutý ako šetrná alternatíva k trypsínu/EDTA na disociáciu adhezívnych cicavčích buniek zo štandardných plastových nádob na tkanivové kultúry a povrchov s adhezívnou vrstvou. Kombinuje proteolytickú a kolagenolytickú enzýmovú aktivitu vo vyváženom soľnom roztoku, aby zabezpečil účinnú, ale kontrolovanú disociáciu, zachoval proteíny na povrchu buniek a podporil vysokú životaschopnosť po pasáži a rýchle opätovné pripojenie.
Zloženie Accutase je založené na Dulbeccovom fosfátovom pufrovanom fyziologickom roztoku (DPBS) s EDTA a fenolovou červenou ako vizuálnym indikátorom pH. Enzýmy sú nemamalského a nebakteriálneho pôvodu, vďaka čomu je Accutase obzvlášť vhodný pre výskum kmeňových buniek, pracovné postupy pri výrobe vakcín a akékoľvek použitie, kde je potrebné minimalizovať kontamináciu pochádzajúcu zo zvierat alebo mikroorganizmov. Roztok sa pri 37 °C automaticky inhibuje, takže po oddelenie nie je potrebné žiadne neutralizačné činidlo ani médium obsahujúce sérum – bunky je možné preniesť priamo do čerstvého média.
Kľúčové vlastnosti
Pripravená na použitie 1x sterilne filtrovaná kvapalina – nie je potrebné riedenie ani rekonštitúcia
Kombinovaná proteolytická a kolagenolytická enzýmová aktivita pre šetrnú disociáciu
Každá šarža je štandardizovaná na definovanú disociačnú aktivitu pre konzistentnosť medzi šaržami
Enzýmy nepochádzajúce z cicavcov ani z baktérií
Automatická inhibícia pri 37 °C – nie je potrebný neutralizačný roztok
Formulované v Dulbeccovom PBS s EDTA
Obsahuje fenolovú červenú ako vizuálny indikátor pH
pH 6,8 – 7,8
Typické použitie
Accutase jemne disociuje širokú škálu adhezívnych a citlivých typov buniek, vrátane ľudských embryonálnych kmeňových buniek (hESCs), ľudských indukovaných pluripotentných kmeňových buniek (iPSCs), neurálnych kmeňových buniek, primárnych neurónov a bežne kultivovaných adhezívnych línií, ako sú HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 a A549. Typické prípady použitia zahŕňajú:
Bežnú subkultiváciu a pasážovanie adhezívnych cicavčích buniek
Šetrná disociácia jednotlivých buniek hESCs, iPSCs a iných citlivých línií
Príprava vzoriek pre prietokovú cytometriu a analýzu FACS
Analýzu markerov na povrchu buniek, kde záleží na integritě epitopu
Testovanie migrácie, proliferácie a apoptózy buniek
Testovanie kľudového stavu prostredníctvom štúdií o deprivácii séra a transfekcii onkogénov
Testovanie migrácie nádorových buniek a buniek neurálnej lišty
Zvýšenie produkcie v pracovných postupoch s bioreaktormi
Pri bežnej práci naneste približne 10 ml Accutase na 75 cm2 kultivačnej plochy a inkubujte 5–10 minút pri izbovej teplote. Optimálny čas inkubácie by sa mal stanoviť pre každú bunkovú líniu a nemal by presiahnuť jednu hodinu. Pred pridaním opláchnite bunkovú vrstvu roztokom soli bez Ca2+/Mg2+, napríklad DPBS bez vápnika a horčíka, aby ste odstránili zvyšky séra a dvojmocné katióny.
Manipulácia a skladovanie
Neotvorenú fľašu skladujte zmrazenú pri teplote -15 °C alebo nižšej. Rozmrazujte buď pri izbovej teplote, alebo cez noc pri teplote +2 °C až +8 °C. Accutase nerozmrazujte vo vodnom kúpeli pri teplote 37 °C, pretože zvýšené teploty znižujú aktivitu enzýmu. Po rozmrazení sa roztok môže skladovať až 2 mesiace pri teplote +2 °C až +8 °C; neskladujte pri izbovej teplote. Pred použitím nereagent nezahrievajte na 37 °C – pridajte ho priamo do prepláchnutých buniek pri izbovej teplote. Pre dlhodobú skladovateľnosť sa odporúča rozdelenie na jednorazové dávky, aby sa zabránilo opakovaným cyklom rozmrazovania. Vždy pracujte v aseptických podmienkach.
Kvalita
Vyrobené podľa prísnych noriem kvality. Každá šarža Accutase je sterilizovaná filtráciou a testovaná na sterilitu, pH, vzhľad a disociačnú aktivitu, aby sa zabezpečil konzistentný a reprodukovateľný výkon v rámci jednotlivých šarží.
Špecifikácie produktu
Špecifikácia
Podrobnosti
Typ produktuReagent na uvoľňovanie/disociáciu buniek
FormátSterilne filtrovaná kvapalina, pripravená na použitie
Objem100 ml
Pracovná koncentrácia1x (pripravené na použitie)
Enzymatická aktivitaKombinovaná proteolytická a kolagenolytická
Pôvod enzýmuNesavčí a nebakteriálny
Pufrový systémDulbeccoho PBS s EDTA
Indikátor pHFenolová červená
Rozsah pH6,8 – 7,8
VzhľadČíry, bledočervený až oranžový roztok
Skladovacia teplota-15 °C alebo nižšia
Stabilita po rozmrazeníAž 2 mesiace pri teplote +2 °C až +8 °C
Odporúčaný objem použitia~10 ml na 75 cm2 kultivačnej plochy
Typická doba inkubácie5 – 10 minút pri izbovej teplote
Prepravné podmienkyZmrazené v suchom ľade
Určené použitieIba na výskumné účely a ďalšiu výrobu
Zloženie (zloženie na liter)
Zložka
Koncentrácia (mg/l)
Anorganické soli
Chlorid sodný (NaCl)8000,00
Hydrogénfosforečnan disodný (Na2HPO4)1150,00
Chlorid draselný (KCl)200,00
Dihydrogénfosforečnan draselný (KH2PO4)200,00
Ostatné zložky
EDTA · 4Na (tetrasodný EDTA)220,00
Fenolová červená3,00
Vlastná zmes enzýmov (proteolytická a kolagenolytická aktivita)1x
Accutase je registrovaná ochranná známka spoločnosti Innovative Cell Technologies, Inc.
Fyziologický roztok s fosfátovým pufrom (PBS) je široko používaný tlmivý roztok v biologickom a chemickom výskume. Zohráva kľúčovú úlohu pri udržiavaní rovnováhy pH a osmolarity počas rôznych experimentálnych postupov vrátane spracovania tkanív a bunkových kultúr. Náš roztok PBS je starostlivo pripravený z vysoko čistých zložiek, aby sa zabezpečila stabilita a spoľahlivosť pri každom experimente. Osmolarita a koncentrácie iónov nášho roztoku PBS presne kopírujú koncentrácie v ľudskom tele, takže je izotonický a netoxický pre väčšinu buniek.
Zloženie nášho roztoku PBS
Náš roztok PBS je zmesou fosfátových pufrov a fyziologických roztokov ultračistej kvality s upraveným pH. V 1X pracovnej koncentrácii obsahuje:
8000 mg/l chloridu sodného (NaCl)
200 mg/L chlorid draselný (KCl)
1150 mg/L fosforečnan sodný dvojzložkový bezvodý (Na2HPO4)
200 mg/L Fosforečnan draselný jednozložkový bezvodý (KH2PO4)
Toto zloženie zabezpečuje optimálne pH a iónovú rovnováhu, vhodné pre širokú škálu biologických aplikácií.
Aplikácie nášho roztoku PBS
Náš roztok PBS je ideálny na rôzne aplikácie v biologickom výskume. Vďaka svojim izotonickým a netoxickým vlastnostiam je vhodný na riedenie látok a oplachovanie bunkových nádob. Roztoky PBS obsahujúce EDTA sú účinné na uvoľnenie prichytených a zhlukovaných buniek. Do PBS by sa však nemali pridávať dvojmocné kovy, ako napríklad zinok, pretože môžu spôsobiť zrážanie. V takýchto prípadoch sa odporúčajú Goodove pufre. Okrem toho je náš roztok PBS prijateľnou alternatívou vírusového transportného média na transport a skladovanie RNA vírusov vrátane SARS-CoV-2.
Kontrola kvality
Sterilne filtrované
Skladovanie a trvanlivosť
Skladujte pri teplote +2 °C až +25 °C, chránené pred svetlom.
Po otvorení skladujte pri teplote 2 °C až 25 °C a spotrebujte do 24 mesiacov.
Podmienky prepravy
Okolitá teplota
Údržba
Uchovávajte v chlade pri teplote +2°C až +8°C v tme. Vyhnite sa zmrazovaniu a častému zohrievaniu na +37 °C, pretože sa tým znižuje kvalita výrobku.
Neohrievajte médium na teplotu vyššiu ako 37 °C ani nepoužívajte nekontrolované zdroje tepla, napríklad mikrovlnné zariadenia.
Ak sa má použiť len časť média, odoberte požadované množstvo a pred použitím ho zohrejte na izbovú teplotu.
Zloženie
Kategória
Zložky
Koncentrácia (mg/l)
Soli
Chlorid draselný
200
Fosforečnan draselný monobázický bezvodý
200
Chlorid sodný
8000
Fosforečnan sodný dvojzložkový bezvodý
1150
Metóda analýzy
CLS ponúka krátkodobé aj dlhodobé testovanie na detekciu mykoplazmy. V prvom prípade sa vzorky testujú ihneď po príchode, zatiaľ čo v druhom prípade sa začne kultivácia buniek a bunky sa testujú po 14 dňoch kultivácie bez antibiotík. Testovanie mykoplaziem sa vykonáva pomocou dvojbodového detekčného systému so súpravou PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) a súpravou Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Vzorky
Na rýchly test poskytnite minimálne 50 µl bunkovej suspenzie obsahujúcej 50 000 buniek. Bunkovú suspenziu možno dodať pri teplote okolia.
Pre prémiový test poskytnite minimálne 1 milión buniek vo vhodnom zmrazovacom médiu, aby sa zabezpečila robustná a zdravá kultúra na kultiváciu a následné testovanie buniek. Vzorky zasielajte na suchom ľade.
Vyplňte formulár na testovanie vzoriek mykoplazmy a priložte ho k zásielke vzoriek.
Kolorimetrický reportérový test
Tento test je kolorimetrický test na báze buniek. V prítomnosti mykoplazmy indukuje reportérová bunková línia signalizačnú kaskádu, ktorá spustí zmenu farby média z červenej na modrú. Test sa vykonáva v 96-jamkových viacjadrových platničkách. Signály sa detekujú v mikrotitračnom spektrofotometri pri vlnovej dĺžke 620
- 655 nm. Detegujú sa všetky druhy mykoplaziem a acholeplaziem, ale aj iné kontaminanty v bunkovej kultúre, ako sú baktérie.
Izotermická amplifikácia
Izotermická amplifikácia je rýchly a spoľahlivý test založený na izotermickej amplifikácii DNA špecifickej pre mykoplazmu v kombinácii s detekciou v reálnom čase pomocou farbiva interkalujúceho DNA. Test je schopný detegovať šesť najbežnejších druhov, ktoré predstavujú > 95 % kontaminácií: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis a A.laidlawii. Vďaka sekvenčnej homológii sa zistia aj iné druhy mykoplaziem (M.pneumoniae, M.gallisepticum a M.synoviae). Na určenie, či je vzorka mykoplazma pozitívna alebo negatívna, sa skúma teplota topenia (Tm).
Záver: Kľúčová úloha kultúr cicavčích buniek v modernom výskume
Bunkové kultúry cicavcov spôsobili revolúciu v biologickom a lekárskom výskume a poskytli vedcom výkonné nástroje na štúdium komplexných bunkových procesov, mechanizmov chorôb a potenciálnych terapeutických zásahov. Od izolácie primárnych buniek až po vývoj imortalizovaných bunkových línií sa táto technika stala nepostrádateľnou súčasťou moderného vedeckého súboru nástrojov
Cesta bunkových kultúr cicavcov sa začína starostlivými technikami izolácie, pokračuje cez starostlivé udržiavanie buniek v špecializovaných médiách a vrcholí širokou škálou aplikácií v rôznych oblastiach štúdia. Či už ide o výskum rakoviny, objavovanie liečiv alebo základnú bunkovú biológiu, schopnosť pestovať a manipulovať s bunkami cicavcov in vitro otvorila nevídané možnosti vedeckého bádania
Kľúčom k úspechu kultivácie buniek cicavcov sú starostlivo kontrolované podmienky, v ktorých sa bunky udržiavajú. Od zloženia rastových médií až po presné parametre prostredia v inkubátoroch - každý aspekt je optimalizovaný tak, aby čo najlepšie napodobňoval prirodzené podmienky buniek. Táto pozornosť venovaná detailom zabezpečuje spoľahlivosť a reprodukovateľnosť experimentov, ktoré sú základom správnej vedeckej praxe
Vývoj imortalizovaných bunkových línií, ako sú napríklad široko používané bunky HeLa, ďalej rozšíril možnosti bunkových kultúr. Tieto bunkové línie poskytujú konzistentné, ľahko dostupné bunkové modely, ktoré urýchlili výskum v mnohých disciplínach
Pri pohľade do budúcnosti sa bunkové kultúry cicavcov naďalej vyvíjajú. Pokroky v technikách 3D kultivácie, vývoji organoidov a používaní chemicky definovaných médií posúvajú hranice možností bunkových kultúr. Tento vývoj sľubuje, že modely in vitro sa ešte viac priblížia komplexnosti systémov in vivo, čo môže spôsobiť revolúciu v objavovaní liekov, personalizovanej medicíne a našom chápaní ľudskej biológie
Na záver možno konštatovať, že bunkové kultúry cicavcov zostávajú dynamickou a nevyhnutnou technikou vo výskume v oblasti vied o živej prírode. Jej ďalšie zdokonaľovanie a uplatňovanie bude nepochybne zohrávať kľúčovú úlohu pri riešení niektorých z najnaliehavejších otázok v biológii a medicíne a bude hnacou silou vedeckého pokroku v nasledujúcich rokoch