Bioprinting s bunkovými líniami: Od 2D k 3D tlačeným tkanivovým konštruktom

Trojrozmerný bioprinting predstavuje revolučnú technológiu, ktorá umožňuje presné priestorové ukladanie živých buniek, biomateriálov a bioaktívnych molekúl na výrobu tkanivových konštrukcií s definovanou architektúrou, ktorá kopíruje prirodzenú organizáciu tkaniva. V spoločnosti Cytion si uvedomujeme, že zavedené bunkové línie ponúkajú v porovnaní s primárnymi bunkami významné výhody pre aplikácie bioprintingu vrátane neobmedzenej kapacity expanzie, dobre charakterizovaného správania, konzistentnej kvality a menších etických obmedzení. Prechod od tradičnej dvojrozmernej jednovrstvovej kultúry k trojrozmerným biotlačeným konštruktom využívajúcim bunky a bunkové línie si vyžaduje dôkladné zváženie zloženia bioinku, metodiky tlače, reakcií buniek na mechanické namáhanie počas depozície a protokolov dozrievania po tlači. Tento pokročilý výrobný prístup umožňuje výrobu komplexných modelov tkanív na skríning liekov, modelovanie chorôb a základný biologický výskum s bezprecedentnou kontrolou bunkového zloženia, priestorovej organizácie a mikroarchitektonických vlastností.

Formulácia a reologické vlastnosti bioinku

Zloženie bioinkov predstavuje najkritickejší faktor určujúci úspech bioprintingu, ktorý si vyžaduje starostlivú rovnováhu medzi vlastnosťami tlače, kompatibilitou s bunkami a štrukturálnou integritou po tlači. Ideálne biofarbivá sa vyznačujú šmykovým riedením, pričom viskozita sa počas vytláčania znižuje pri aplikovanom šmykovom namáhaní a potom sa rýchlo obnovuje po uložení, aby sa zachovala vernosť vytlačenej štruktúry. Viskozita sa zvyčajne pohybuje od 30 do 6 × 10⁷ mPa-s v závislosti od metodiky tlače, pričom systémy založené na vytláčaní vyžadujú vyššiu viskozitu (≥ 1 000 mPa-s) na zachovanie tvaru v porovnaní s atramentovými prístupmi, ktoré vyžadujú nízku viskozitu (3 - 12 mPa-s) na tvorbu kvapiek. Koncentrácia buniek v bioinkoch sa zvyčajne pohybuje od 1×10⁶ do 2×10⁷ buniek na mililiter, čím sa vyvažuje dostatočná hustota buniek na tvorbu tkaniva s potenciálnym upchávaním tlačových dýz a nadmernou viskozitou materiálu. Medzi bežné základné materiály bioink patria alginát, želatína, želatínometakrylát (GelMA), kyselina hyalurónová a agaróza, často kombinované vo viaczložkových prípravkoch na optimalizáciu mechanických vlastností, kinetiky degradácie a biologickej aktivity. V prípade buniek a bunkových línií Cytion je empirická optimalizácia zloženia bioink nevyhnutná na prispôsobenie sa požiadavkám na adhéziu špecifickým pre daný typ buniek a citlivosti na mechanické namáhanie počas tlače.

Bioprintové systémy založené na vytláčaní

Bioprinting založený na vytláčaní predstavuje najrozšírenejšiu technológiu vďaka relatívne nízkym nákladom na zariadenie, kompatibilite s bioinkami s vysokou viskozitou a vysokou hustotou buniek a škálovateľnosti na výrobu konštrukcií v centimetrovej veľkosti. Tieto systémy dávkujú kontinuálne vlákna materiálu s bunkami cez valcové dýzy s priemerom od 100 do 500 mikrometrov, pričom depozícia sa riadi pneumatickým tlakom, mechanickým posunom poháňaným skrutkou alebo ovládaním na základe piestu. Hlavným problémom je šmykové napätie, ktorému sú vystavené bunky počas vytláčania dýzou, pričom jeho veľkosť závisí od priemeru dýzy, použitého tlaku a viskozity bioinku podľa princípov mechaniky tekutín. Bunky zažívajú maximálne šmykové napätie na stene dýzy, ktoré môže spôsobiť poškodenie membrány, zníženú životaschopnosť a zmenené profily expresie génov, ak je nadmerné. Optimalizácia si vyžaduje vyváženie priemeru dýzy a vytláčacieho tlaku na dosiahnutie požadovaného rozlíšenia pri zachovaní životaschopnosti buniek zvyčajne nad 80 %. Možnosti viacmateriálového bioprintingu umožňujú súčasné alebo postupné nanášanie rôznych typov buniek a materiálov, čo uľahčuje výrobu heterogénnych tkanivových konštrukcií s priestorovo definovaným zložením. Koaxiálne konfigurácie trysiek umožňujú priamu tlač dutých tubulárnych štruktúr užitočných na vaskularizáciu, pričom materiál jadra sa následne odstráni, aby sa vytvorili patentné lúmeny vystlané endotelovými bunkami.

Bioprint na báze atramentu a kvapiek

Technológie atramentovej bioprintovej tlače prispôsobené komerčným systémom tlače dokumentov umožňujú presné nanášanie kvapôčok obsahujúcich bunky v objeme pikolitrov a ponúkajú priestorové modelovanie s vysokým rozlíšením a rýchlu tlač vhodnú pre vysoko výkonné aplikácie. Tepelné atramentové systémy vytvárajú bubliny pary prostredníctvom odporových ohrievacích prvkov, čím sa vytvárajú tlakové impulzy, ktoré vystreľujú kvapôčky z tlačovej hlavy, zatiaľ čo piezoelektrické systémy využívajú deformáciu piezoelektrických kryštálov vyvolanú napätím na generovanie akustických vĺn, ktoré poháňajú kvapôčky. Obavy o životaschopnosť buniek spočiatku obmedzovali prijatie tepelných atramentových prístupov kvôli prechodnému zvýšeniu teploty, ale optimalizované systémy vykazujú minimálne tepelné poškodenie pri teplotách udržiavaných pod kritickými prahmi a trvaní expozície obmedzenom na mikrosekundy. Piezoelektrické systémy sa vyhýbajú tepelnému namáhaniu, ale vyžadujú starostlivé ladenie akustických parametrov, aby sa vyvážila spoľahlivosť tvorby kvapiek a mechanické namáhanie buniek. Viskozita biologického atramentu pre atramentové systémy musí zostať pod približne 12 mPa-s, aby sa umožnila tvorba kvapiek, čo obmedzuje možnosti materiálu v porovnaní s prístupmi založenými na vytláčaní a zvyčajne si vyžaduje zosieťovanie po nanesení, aby sa dosiahla štrukturálna stabilita. Vďaka vysokej presnosti a priepustnosti je atramentový bioprint obzvlášť vhodný pre aplikácie, ktoré si vyžadujú definované priestorové vzory viacerých typov buniek, ako sú napríklad modely spoločnej kultivácie alebo generovanie gradientov na skríning liečiv pomocou HeLa buniek a iných zavedených bunkových línií.

Laserom asistovaný bioprint a modelovanie s vysokým rozlíšením

Laserom asistovaný bioprinting (LAB), označovaný aj ako laserom indukovaný dopredný prenos, dosahuje najvyššie priestorové rozlíšenie spomedzi technológií bioprintingu a umožňuje nanášanie jednotlivých buniek alebo malých skupín buniek s mikrometrovou presnosťou. Systém LAB pozostáva z pulzného laserového zdroja, darcovského sklíčka pokrytého materiálom pohlcujúcim energiu a bioinkom obsahujúcim bunky a prijímacieho substrátu umiestneného v tesnej blízkosti pod darcovským sklíčkom. Sústredené laserové impulzy odparujú vrstvu pohlcujúcu energiu a vytvárajú vysokotlakové bubliny, ktoré poháňajú kvapky obsahujúce bunky z darcovského sklíčka na prijímací substrát s presnou priestorovou kontrolou. Pri optimalizovaných parametroch možno dosiahnuť rozlíšenie 10 - 50 mikrometrov a životaschopnosť buniek presahujúcu 95 %, čo výrazne prekonáva iné spôsoby bioprintingu. Bezdýzová povaha systému LAB eliminuje strihové napätie spojené s vytláčaním a zabraňuje problémom so zanášaním, ktoré trápia systémy založené na dýzach pri tlači suspenzií buniek s vysokou viskozitou alebo vysokou hustotou. Systémy LAB si však vyžadujú sofistikované optické vybavenie a starostlivú optimalizáciu parametrov lasera vrátane vlnovej dĺžky, trvania impulzu, hustoty energie a veľkosti ohniska, aby sa vyvážila spoľahlivosť tlače a životaschopnosť buniek. Schopnosť tlačiť bunky s rozlíšením jednej bunky robí systém LAB obzvlášť cenným pre aplikácie vyžadujúce presnú priestorovú organizáciu, ako sú napríklad ko-kultúry neurónov a glie alebo skúmanie signalizácie medzi bunkami na definovaných vzdialenostiach.

Stereolitografia a digitálne spracovanie svetla

Stereolitografia (SLA) a digitálne spracovanie svetla (DLP) využívajú fotopolymerizáciu vrstvy po vrstve fotosieťovateľných hydrogélov s bunkami na rýchlu výrobu komplexných trojrozmerných geometrií s rozlíšením 25 - 100 mikrometrov. Na rozdiel od metód založených na nanášaní, ktoré vytvárajú štruktúry postupným umiestňovaním materiálu, prístupy založené na svetle zosieťujú celé vrstvy súčasne, čím výrazne skracujú čas výroby zložitých geometrií. Systémy DLP premietajú svetelné vzory zodpovedajúce prierezom celých vrstiev pomocou digitálnych mikrozrkadlových polí, zatiaľ čo systémy SLA skenujú sústredené laserové lúče na sledovanie vzorov vrstiev, pričom DLP vo všeobecnosti ponúka vyššie rýchlosti tlače. Fotosieťovateľné bioinokátory obsahujú fotoiniciátory, ktoré pri vystavení svetlu generujú reaktívne formy, čím spúšťajú polymerizáciu alebo sieťovanie hydrogélových prekurzorov, ako je metakrylát želatíny, polyetylénglykoldiakrilát alebo metakrylát kyseliny hyalurónovej. Životaschopnosť buniek závisí v rozhodujúcej miere od koncentrácie fotoiniciátora, intenzity svetla a dĺžky expozície, pretože reaktívne formy kyslíka vznikajúce počas fotoiniciácie môžu poškodiť bunkové zložky. Optimalizované systémy dosahujú 75 - 95 % životaschopnosť po tlači vďaka použitiu fotoiniciátorov kompatibilných s bunkami vo viditeľnom svetle (fenyl-2,4,6-trimetylbenzoylfosfinát lítny), nízkym koncentráciám fotoiniciátorov (0,05 - 0,5 %) a minimalizácii vystavenia svetlu. Schopnosť rýchlo vytvárať komplexné cievne siete a zložité architektúry tkanív robí SLA/DLP obzvlášť sľubnou pre aplikácie orgánov na čipe a tkanivové inžinierstvo, hoci si vyžaduje kompatibilné fotosieťovateľné materiály a starostlivé riadenie kinetiky fotopolymerizácie.

Optimalizácia dozrievania a kultivácie po tlači

Bioprintované konštrukcie bezprostredne po výrobe zvyčajne vykazujú obmedzené interakcie medzi bunkami, minimálne ukladanie extracelulárnej matrice a mechanické vlastnosti, ktorým dominuje materiál bioinku, a nie vlastnosti biologického tkaniva. Kultivácia po vytlačení je nevyhnutná na umožnenie šírenia buniek z ich pôvodne sférickej morfológie, vytvorenie bunkových spojov, vylučovanie a organizáciu endogénnej extracelulárnej matrice a rozvoj tkanivovo špecifických funkcií. Požiadavky na trvanie kultivácie sa pohybujú od dní po týždne v závislosti od typu buniek, zložitosti konštrukcie a zamýšľaného použitia, pričom metabolicky aktívne bunky zvyčajne vyžadujú častejšiu výmenu médií, aby sa zabránilo vyčerpaniu živín a hromadeniu metabolitov. Dopĺňanie médií bunkových kultúr tkanivovo špecifickými rastovými faktormi, hormónmi a inými bioaktívnymi molekulami môže urýchliť dozrievanie a zlepšiť funkčné vlastnosti, hoci špecifické požiadavky závisia od typu buniek a požadovaného fenotypu. Mechanická stimulácia prostredníctvom perfúzneho toku, cyklického naťahovania alebo kompresie podporuje dozrievanie tkanív a funkčný vývoj mechanosenzitívnych typov buniek, pričom napodobňuje fyziologické podmienky zaťaženia. V prípade bioinkov obsahujúcich biodegradovateľné zložky odráža časový vývoj mechanických vlastností degradáciu matrice aj akumuláciu matrice vylučovanej bunkami, čo si vyžaduje starostlivú rovnováhu medzi kinetikou degradácie a rýchlosťou ukladania matrice. Monitorovanie dozrievania prostredníctvom morfologického hodnotenia, analýzy expresie génov a funkčných testov umožňuje optimalizáciu kultivačných podmienok a určenie vhodných časových bodov na experimentálne skúmanie bioprintovaných modelov tkanív.

Aplikácie pri skríningu liečiv a modelovaní chorôb

Bioprintované tkanivové konštrukty využívajúce zavedené bunkové línie z katalógu spoločnosti Cytion ponúkajú výkonné platformy na skríning farmaceutických zlúčenín a modelovanie chorôb s lepšou fyziologickou relevantnosťou v porovnaní s tradičnými dvojrozmernými kultúrami. Schopnosť presne kontrolovať bunkové zloženie, priestorovú organizáciu a mikroarchitektonické vlastnosti umožňuje systematické skúmanie vzťahov medzi štruktúrou a funkciou a vytváranie reprodukovateľných tkanivových modelov vhodných pre vysoko výkonné skríningové pracovné postupy. Bioprintové modely rakoviny s nádorovými bunkovými líniami, stromálnymi fibroblastami a endotelovými bunkami v definovanom priestorovom usporiadaní lepšie rekapitulujú charakteristiky nádorového mikroprostredia vrátane hypoxických gradientov, heterogénneho prieniku liečiv a interakcií medzi stromálnym a nádorovým tkanivom, ktoré ovplyvňujú terapeutickú odpoveď. Modely pečeňového tkaniva zahŕňajúce bunkové línie hepatocytov v definovaných architektúrach vykazujú zvýšenú expresiu cytochrómu P450 a metabolickú funkciu v porovnaní s bežnými kultúrami, čo zlepšuje presnosť predpovede pri skríningu hepatotoxicity. Bioprintové modely nervového tkaniva s presnou organizáciou neurónov a glie umožňujú skúmať mechanizmy neurodegeneratívnych ochorení a skríning neuroprotektívnych zlúčenín. Výhody reprodukovateľnosti bioprintingu v porovnaní s manuálne vytvorenými trojrozmernými kultúrami uľahčujú štandardizáciu, ktorá je nevyhnutná pre regulačné prijatie a integráciu do farmaceutických vývojových procesov, hoci validácia s výsledkami in vivo je naďalej nevyhnutná na vytvorenie dôvery v prediktívnu schopnosť.