Zīdītāju šūnu kultūras: Pamati un tehnikas
Zīdītāju šūnu kultūras ir bioloģisko pētījumu stūrakmens, kas ļauj zinātniekiem pētīt šūnas kontrolētā vidē ārpus dzīviem organismiem. Šis process ietver šūnu izolēšanu no audiem, to uzturēšanu rūpīgi kontrolētos apstākļos un pavairošanu dažādiem eksperimentāliem mērķiem. Zīdītāju šūnu kultūras ir ļoti svarīgas, lai izprastu šūnu procesus, slimību mehānismus un izstrādātu jaunas terapijas, tostarp tādas, kurās izmanto nemirstīgās šūnu līnijas
Galvenie secinājumi:
- Šūnas var izolēt no audiem, izmantojot fermentatīvās šķelšanas vai eksplanta kultūras metodes
- Primāro šūnu mūžs ir ierobežots, bet nemortalizētas šūnu līnijas var vairoties neierobežoti ilgi
- Kultūras apstākļi, tostarp barotnes sastāvs, ir izšķiroši šūnu izdzīvošanai un proliferācijai
- Šūnas var audzēt suspensijas vai adherentās kultūrās atkarībā no to veida un pētniecības vajadzībām
- Parastās barotnes ir MEM, DMEM un RPMI 1640, katra no tām pielāgota konkrētiem šūnu tipiem
- Tipiski augšanas apstākļi ir 37 °C temperatūra, 5 % CO2 un 95 % relatīvais mitrums
- Lai izvairītos no iespējamās piesārņojuma problēmas, aizvien biežāk izmanto seruma alternatīvas, piemēram, cilvēka trombocītu lizātu (hPL)
Šūnu izolēšanas metodes
Šūnu kultūras izveides process sākas ar šūnu izolēšanu no audiem. Ir vairākas metodes, kā to izdarīt, un katra no tām ir piemērota dažādiem audu tipiem un pētniecības mērķiem. Asins paraugiem šūnu izolēšana ir salīdzinoši vienkārša, un, ņemot vērā to augšanas spējas, galvenā uzmanība tiek pievērsta balto asinsķermenīšu audzēšanai. Cietajiem audiem nepieciešamas sarežģītākas izolācijas metodes. Viena no izplatītākajām metodēm ietver fermentatīvo šķelšanu, kurā izmanto tādus fermentus kā kolagenāzi, tripsīnu vai pronāzi, lai sasmalcinātu ekstracelulāro matricu, atbrīvojot atsevišķas šūnas suspensijā. Kā alternatīvu pētnieki var izmantot eksplanta kultūras metodi, kad nelielus audu gabaliņus ievieto tieši barotnē, ļaujot šūnām migrēt un vairoties. Šo metožu izvēle bieži vien ir atkarīga no konkrētā audu tipa, vēlamās šūnu populācijas un paredzētā eksperimentālā lietojuma. Svarīgi atzīmēt, ka šūnas, kas izolētas tieši no organisma, tiek dēvētas par primārajām šūnām, un tām, izņemot dažus izņēmumus, piemēram, audzēju iegūtas šūnas, kultūrā parasti ir ierobežots kalpošanas laiks, pirms tās sāk novecot
Būtiski produkti zīdītāju šūnu kultūrām
| Produkta nosaukums | Produkta numurs | Kategorija | Pielietojums |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/l glikozes, w: 4 mM L-glutamīna, w: 1,5 g/l NaHCO3, w: 1,0 mM nātrija piruvāta | 820300a | Kultūru barotnes | Vispārēja lietojuma barotne dažādiem zīdītāju šūnu tipiem |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/l glikozes, w: 1,6 mM L-glutamīna, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM nātrija piruvāta, w: 1,2 g/l NaHCO3 | 820400a | Kultūru barotnes | Piemērotas dažādām zīdītāju šūnām, īpaši epitēlija šūnām |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabils glutamīns, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kultūru barotnes | Parasti izmanto limfoīdām šūnām un hibrīdšūnu līnijām |
| Accutase | 830100 | Šūnu disociācija | Maiga šūnu atdalīšanas šķīdums adhēzīvām šūnām |
| Sasaldēšanas barotne CM-1 | 800150 | Kriokonservēšana | Zīdītāju šūnu sasaldēšanai un ilgtermiņa uzglabāšanai |
| Saldēšanas barotne CM-ACF, bez seruma | 800650 | Kriokonservēšana | Dzīvnieku izcelsmes barotne šūnu sasaldēšanai, kas nesatur sastāvdaļas |
| PBS | 860015 | Buferšķīdums | Šūnu mazgāšanai un pH līdzsvara uzturēšanai |
| Endotēlija šūnu augšanas barotne | 820731 | Specializētā barotne | Optimizēta endotēlija šūnu kultivēšanai |
| Mikoplazmu testēšana | 900159 | Kvalitātes kontrole | Svarīgi mikoplazmas piesārņojuma noteikšanai kultūrās |
| Šūnu līnijas autentiskuma noteikšana - Cilvēks | 900154 | Kvalitātes kontrole | Pārbauda cilvēka šūnu līniju identitāti |
Šajā tabulā ir atlasīti būtiskākie produkti zīdītāju šūnu kultūrām. Lai iepazītos ar visu mūsu šūnu kultūru produktu klāstu, tostarp specializētajām barotnēm un reaģentiem, lūdzu, apmeklējiet mūsu barotņu un reaģentu kategorijas lapu.
Accutase ir gatavs lietošanai, sterili filtrēts šūnu atdalīšanas šķīdums, kas izstrādāts kā maiga alternatīva tripsīnam/EDTA, lai atdalītu piekļāvušās zīdītāju šūnas no standarta audu kultūras plastmasas traukiem un ar adhezīvu pārklātām virsmām. Tas apvieno proteolītisko un kolagenolītisko enzīmu aktivitāti sabalansētā sāls šķīdumā, lai nodrošinātu efektīvu, bet kontrolētu atdalīšanu, saglabājot šūnu virsmas proteīnus un veicinot augstu dzīvotspēju pēc pārneses un ātru atkārtotu piekļāvēšanos.
Accutase sastāvs ir balstīts uz Dulbecco fosfāta buferšķīdumu (DPBS) ar EDTA un fenolsarkano kā vizuālu pH indikatoru. Fermenti ir ne-zīdītāju un ne-baktēriju izcelsmes, padarot Accutase īpaši piemērotu cilmes šūnu pētniecībai, vakcīnu ražošanas procesiem un jebkurai lietošanai, kurā ir jāminimizē dzīvnieku vai mikrobiālas izcelsmes piesārņotāji. Šķīdums automātiski inhibējas 37 °C temperatūrā, tādēļ pēc atdalīšanas nav nepieciešams neitralizējošs reaģents vai serumu saturošs barotne – šūnas var pārnest tieši svaigā barotnē.
Galvenās īpašības
Lietošanai gatavs 1x sterili filtrēts šķidrums – nav nepieciešama atšķaidīšana vai atjaunošana
Kombinēta proteolītiskā un kolagenolītiskā enzīmu aktivitāte maigai disociācijai
Katra partija standartizēta atbilstoši noteiktam disociācijas aktivitātes līmenim, lai nodrošinātu partiju savstarpēju atbilstību
Enzīmu izcelsme nav saistīta ar zīdītājiem vai baktērijām
Automātiska inhibīcija 37 °C temperatūrā – nav nepieciešams neitralizējošs šķīdums
Formulēts Dulbecco PBS ar EDTA
Fenolsarkans iekļauts kā vizuāls pH indikators
pH 6,8–7,8
Tipiski pielietojumi
Accutase maigi disociē plašu klāstu adhezīvu un jutīgu šūnu tipu, tostarp cilvēka embrionālās cilmes šūnas (hESCs), cilvēka indukcijas pluripotentās cilmes šūnas (iPSCs), neironu cilmes šūnas, primāros neironus un rutīniski kultivētas adhezīvās šūnu līnijas, piemēram, HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 un A549. Tipiski lietošanas gadījumi ietver:
Rutīniska adhezīvo zīdītāju šūnu subkultivēšana un pasāžēšana
Maiga hESCs, iPSCs un citu jutīgu līniju atsevišķu šūnu atdalīšana
Paraugu sagatavošana plūsmas citometrijai un FACS analīzei
Šūnu virsmas marķieru analīze, kur svarīga ir epitopa integritāte
Šūnu migrācijas, proliferācijas un apoptozes analīzes
Miera stāvokļa testi, izmantojot seruma izsīkšanu un onkogēnu transfekcijas pētījumus
Audzēja šūnu un neirālo krastu šūnu migrācijas testi
Ražošanas apjoma palielināšana bioreaktoru darba plūsmās
Ikdienas darbā uzklājiet aptuveni 10 ml Accutase uz 75 cm2 kultūras virsmas un inkubējiet 5–10 minūtes istabas temperatūrā. Optimālais inkubācijas laiks jānosaka katrai šūnu līnijai atsevišķi, un tas nedrīkst pārsniegt vienu stundu. Pirms pievienošanas noskalojiet šūnu slāni ar Ca2+/Mg2+-nesaturošu sāls šķīdumu, piemēram, DPBS bez kalcija un magnija, lai noņemtu seruma atliekas un divvērtīgos katjonus.
Rīkošanās un uzglabāšana
Neatvērtu pudeli uzglabājiet sasaldētu -15 °C vai zemākā temperatūrā. Atkausējiet istabas temperatūrā vai nakti +2 °C līdz +8 °C temperatūrā. Neatkausējiet Accutase 37 °C ūdens vannā, jo paaugstināta temperatūra samazina fermentu aktivitāti. Pēc atkausēšanas šķīdumu var uzglabāt līdz 2 mēnešiem +2 °C līdz +8 °C temperatūrā; neuzglabājiet istabas temperatūrā. Pirms lietošanas reaģentu neiesildiet līdz 37 °C – pievienojiet to tieši izskalotām šūnām istabas temperatūrā. Lai nodrošinātu ilgu glabāšanas laiku, ieteicams izmantot vienreizējās lietošanas alikvotas, lai izvairītos no atkārtotiem atkausēšanas cikliem. Vienmēr strādājiet aseptiskos apstākļos.
Kvalitāte
Ražots saskaņā ar stingriem kvalitātes standartiem. Katra Accutase partija tiek sterilizēta ar filtrēšanu un pārbaudīta attiecībā uz sterilitāti, pH, izskatu un disociācijas aktivitāti, lai nodrošinātu vienmērīgu, reproducējamu darbību no partijas uz partiju.
Produkta specifikācijas
Specifikācija
Sīkāka informācija
Produkta veidsŠūnu atdalīšanas / disociācijas reaģents
FormātsSterili filtrēts šķidrums, gatavs lietošanai
Tilpums100 ml
Darba koncentrācija1x (gatavs lietošanai)
Enzīmu aktivitāteKombinēta proteolītiska un kolagenolītiska
Fermentu izcelsmeNe no zīdītājiem un ne no baktērijām
Buferu sistēmaDulbecco PBS ar EDTA
pH indikatorsFenolsarkans
pH diapazons6,8 – 7,8
IzskatsDzidrs, gaiši sarkans līdz oranžs šķīdums
Uzglabāšanas temperatūra-15 °C vai zemāka
Stabilitāte pēc atkausēšanasLīdz 2 mēnešiem temperatūrā no +2 °C līdz +8 °C
Ieteicamais lietošanas daudzums~10 ml uz 75 cm2 kultūras virsmas
Tipisks inkubācijas laiks5–10 minūtes istabas temperatūrā
Piegādes nosacījumiSasaldēts uz sausā ledus
Paredzētais lietojumsTikai pētniecības vajadzībām un turpmākai ražošanai
Sastāvs (sastāvs uz litru)
Sastāvdaļa
Koncentrācija (mg/l)
Neorganiskie sāļi
Nātrija hlorīds (NaCl)8000,00
Dinātrija hidrogēnfosfāts (Na2HPO4)1150,00
Kālija hlorīds (KCl)200,00
Kālija dihidrogēnfosfāts (KH2PO4)200,00
Citas sastāvdaļas
EDTA · 4Na (tetranātrija EDTA)220,00
Fenolsarkans3,00
Patentēts fermentu maisījums (proteolītiska un kolagenolītiska aktivitāte)1x
Accutase ir Innovative Cell Technologies, Inc. reģistrēta preču zīme.
Fosfātu buferšķīdums (PBS) ir plaši izmantots buferšķīdums bioloģiskajos un ķīmiskajos pētījumos. Tam ir izšķiroša nozīme pH līdzsvara un osmolaritātes uzturēšanā dažādu eksperimentālu procedūru laikā, tostarp audu apstrādes un šūnu kultivēšanas laikā. Mūsu PBS šķīdums ir rūpīgi izstrādāts no augstas tīrības pakāpes sastāvdaļām, lai nodrošinātu stabilitāti un uzticamību katrā eksperimentā. Mūsu PBS šķīduma osmolaritāte un jonu koncentrācija precīzi atbilst cilvēka ķermeņa osmolaritātei un jonu koncentrācijai, tāpēc tas ir izotonisks un nav toksisks vairumam šūnu.
Mūsu PBS šķīduma sastāvs
Mūsu PBS šķīdums ir īpaši tīru fosfātu buferšķīdumu un fizioloģisko šķīdumu maisījums ar pielāgotu pH. 1X darba koncentrācijā tas satur:
8000 mg/l nātrija hlorīda (NaCl)
200 mg/l kālija hlorīda (KCl)
1150 mg/L nātrija fosfāts divbāziskais bezūdens (Na2HPO4)
200 mg/L Kālija fosfāts vienbāziskais bezūdens (KH2PO4)
Šis sastāvs nodrošina optimālu pH un jonu līdzsvaru, kas piemērots plašam bioloģisko lietojumu klāstam.
Mūsu PBS šķīduma lietojumi
Mūsu PBS šķīdums ir ideāli piemērots dažādiem lietojumiem bioloģiskajos pētījumos. Tā izotoniskās un netoksiskās īpašības padara to piemērotu vielu atšķaidīšanai un šūnu konteineru skalošanai. EDTA saturoši PBS šķīdumi ir efektīvi, lai atdalītu pielipušās un saplūdušās šūnas. Tomēr PBS nedrīkst pievienot divvērtīgos metālus, piemēram, cinku, jo tas var izraisīt nogulsnēšanos. Šādos gadījumos ieteicams izmantot Good's buferus. Turklāt mūsu PBS šķīdums ir pieņemama alternatīva vīrusu transportēšanas barotnei RNS vīrusu, tostarp SARS-CoV-2, transportēšanai un uzglabāšanai.
Kvalitātes kontrole
Sterili filtrēts
Uzglabāšana un glabāšanas laiks
Uzglabāt no gaismas pasargātā +2 °C līdz +25 °C temperatūrā.
Pēc atvēršanas uzglabāt 2°C līdz 25°C temperatūrā un izmantot 24 mēnešu laikā.
Pārvadāšanas nosacījumi
Apkārtējā temperatūra
Uzturēšana
Uzglabāt ledusskapī no +2°C līdz +8°C temperatūrā, tumsā. Izvairīties no sasaldēšanas un biežas sasilšanas līdz +37°C, jo tas samazina produkta kvalitāti.
Nesildiet barotni augstāk par 37°C un neizmantojiet nekontrolētus siltuma avotus, piemēram, mikroviļņu krāsnis.
Ja jāizmanto tikai daļa barotnes, pirms lietošanas izņemiet nepieciešamo daudzumu un uzsildiet to līdz istabas temperatūrai.
Sastāvs
Kategorija
Sastāvdaļas
Koncentrācija (mg/l)
Sāls
Kālija hlorīds
200
Kālija fosfāts monobāziskais bezūdens
200
Nātrija hlorīds
8000
Nātrija fosfāts divbāziskais bezūdens
1150
Analīzes metode
CLS piedāvā gan īstermiņa, gan ilgtermiņa testus mikoplazmas noteikšanai. Pirmajā gadījumā paraugus testē uzreiz pēc saņemšanas, bet otrajā gadījumā šūnu kultūru sāk audzēt un šūnas testē pēc 14 dienām, kad tās kultivē bez antibiotikām. Mikoplazmas testēšanu veic, izmantojot divpunktu noteikšanas sistēmu ar PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) un Certus QC
- mycoADVANCED noteikšanas komplektu (Certus).
Paraugi
Ātrajam testam jānodrošina vismaz 50 µl šūnu suspensijas, kas satur 50 000 šūnu. Šūnu suspensiju var nosūtīt apkārtējās vides temperatūrā.
Premium testam, lūdzu, sagādājiet vismaz 1 miljonu šūnu piemērotā sasaldēšanas barotnē, lai nodrošinātu stabilu un veselīgu kultūru šūnu kultivēšanai un turpmākai testēšanai. Lūdzu, paraugus sūtiet uz sausā ledus.
Lūdzu, aizpildiet Mikoplazmas testēšanas parauga veidlapu un pievienojiet to parauga sūtījumam.
Kolorimetriskais reportieru tests
Šis tests ir šūnu kolorimetriskais tests. Mikoplazmas klātbūtnē reportieru šūnu līnija inducē signālu kaskādi, kas izraisa vides krāsas maiņu no sarkanas uz zilu. Testu veic 96 iedobju daudzplakanās plāksnītēs. Signālus nosaka mikroplatīšu spektrofotometrā pie 620-655 nm. Tiek konstatētas visas mikoplazmas un aholeplazmas sugas, kā arī citi šūnu kultūru piesārņotāji, piemēram, baktērijas.
Izotermiskā amplifikācija
Izotermiskā amplifikācija ir ātrs un uzticams tests, kura pamatā ir mikoplazmai specifiskas DNS izotermiska amplifikācija apvienojumā ar reāllaika noteikšanu, izmantojot DNS interkalējošu krāsvielu. Ar šo testu var noteikt sešas visbiežāk sastopamās sugas, kas veido > 95 % inficēšanās gadījumu: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis un A.laidlawii. Sakarā ar sekvenču homoloģiju tiks atklātas arī citas mikoplazmu sugas (M.pneumoniae, M.gallisepticum un M.synoviae). Lai noteiktu, vai paraugs ir mikoplazma pozitīvs vai negatīvs, tiek pētīta kušanas temperatūra (Tm).
Secinājums: Zīdītāju šūnu kultūru izšķirošā loma mūsdienu pētniecībā
Zīdītāju šūnu kultūras ir revolucionizējušas bioloģiskos un medicīniskos pētījumus, sniedzot zinātniekiem spēcīgus instrumentus sarežģītu šūnu procesu, slimību mehānismu un potenciālu terapeitisku iejaukšanos izpētei. Sākot ar primāro šūnu izolēšanu un beidzot ar nemortalizētu šūnu līniju izstrādi, šis paņēmiens ir kļuvis par neatņemamu mūsdienu zinātnes instrumentu komplekta sastāvdaļu
Zīdītāju šūnu kultūru ceļojums sākas ar rūpīgām izolēšanas metodēm, turpinās ar rūpīgu šūnu uzturēšanu specializētās barotnēs un beidzas ar plašu lietojumu klāstu dažādās pētījumu jomās. Neatkarīgi no tā, vai tie ir vēža pētījumi, zāļu atklāšana vai šūnu bioloģijas pamati, spēja audzēt un manipulēt ar zīdītāju šūnām in vitro ir pavērusi vēl nebijušus zinātniskās izpētes ceļus
Zīdītāju šūnu kultūru panākumu atslēga ir rūpīgi kontrolētie apstākļi, kādos šūnas tiek uzturētas. Sākot no augšanas barotņu sastāva un beidzot ar precīziem vides parametriem inkubatoros, visi aspekti tiek optimizēti, lai pēc iespējas precīzāk atdarinātu šūnu dabiskos apstākļus. Šī uzmanība detaļām nodrošina eksperimentu uzticamību un atkārtojamību, kas ir labas zinātniskās prakses stūrakmens
Imortalizēto šūnu līniju, piemēram, plaši izmantoto HeLa šūnu, izstrāde ir vēl vairāk paplašinājusi šūnu kultūras iespējas. Šīs šūnu līnijas nodrošina konsekventus, viegli pieejamus šūnu modeļus, kas ir paātrinājuši pētniecību daudzās disciplīnās
Raugoties nākotnē, zīdītāju šūnu kultūras turpina attīstīties. Panākumi 3D kultūru metodēs, organoīdu izstrādē un ķīmiski noteiktu barotņu izmantošanā paplašina šūnu kultūru iespēju robežas. Šie sasniegumi sola vēl vairāk tuvināt in vitro modeļus in vivo sistēmu sarežģītībai, potenciāli revolucionizējot zāļu atklāšanu, personalizēto medicīnu un mūsu izpratni par cilvēka bioloģiju
Nobeigumā jāsecina, ka zīdītāju šūnu kultūras joprojām ir dinamiska un būtiska metode dzīvības zinātņu pētniecībā. Tās turpmāka pilnveidošana un izmantošana neapšaubāmi spēlēs izšķirošu lomu, risinot dažus no aktuālākajiem jautājumiem bioloģijā un medicīnā, veicinot zinātnes progresu vēl daudzus gadus uz priekšu