HEK293 metabolisma inženierija, lai uzlabotu proteīnu glikozilēšanu

Glikozilēšana ir viena no vissvarīgākajām posttranslācijas modifikācijām, kas ietekmē terapeitisko proteīnu efektivitāti, stabilitāti un imunogenitāti. Uzņēmumā Cytion mēs saprotam, ka, lai iegūtu rekombinantus proteīnus ar optimāliem glikānu profiliem, ir nepieciešama sarežģīta izpratne par šūnu metabolismu un glikozilēšanas mehānismu. HEK293 šūnas ir unikāli izdevīga platforma glikoproteīnu ražošanai, jo to cilvēciskā izcelsme nodrošina dabiski līdzīgus glikozilēšanas modeļus, kas precīzi atspoguļo endogēnos cilvēka proteīnus - būtiska priekšrocība salīdzinājumā ar necilvēciskām ekspresijas sistēmām.

Galvenie secinājumi

• HEK293 šūnas ražo cilvēkam atbilstošas glikānu struktūras, kas ir labākas nekā CHO šūnas noteiktām terapeitiskām vielām
• Nukleotīdu cukuru prekursoru pievienošana tieši uzlabo glikozilēšanas vietu aizņemtību
• Kultūras apstākļi, tostarp temperatūra, pH un izšķīdušais skābeklis, būtiski ietekmē glikānu profilus
• Gēnu inženierijas pieejas ļauj pielāgot glikānu struktūras specifiskiem terapeitiskiem lietojumiem
• Analītiskās raksturošanas stratēģijas ir būtiskas glikoproteīnu kvalitātes novērtēšanai

HEK293 šūnu priekšrocība attiecībā uz glikozilēšanu

Cilvēka embrionālo nieru 293 šūnām piemīt atšķirīgas glikozilēšanas spējas, kas tās atšķir no citām zīdītāju ekspresijas sistēmām. Atšķirībā no Ķīnas kāmja olnīcu (CHO) šūnām, kas ražo tikai α2,3 saistītās siālskābes, HEK293 šūnas ekspresē gan α2,3, gan α2,6sialiltransferāzes, radot glikānu struktūras, kas vairāk līdzinās dabiskajiem cilvēka glikoproteīniem.

Šai atšķirībai ir būtiska terapeitiska nozīme. Daudzi cilvēka seruma glikoproteīni, tostarp imūnglobulīni un koagulācijas faktori, satur ievērojamu daļu α2,6 saistītās siālskābes. Tāpēc HEK293 šūnās ražotajiem terapeitiskajiem proteīniem var būt labāki farmakokinētiskie profili un mazāka imunogenitāte salīdzinājumā ar CHO iegūtajiem analogiem.

Mūsu HEK293 šūnas (300192 ) ir lielisks sākumpunkts glikoproteīnu ražošanai, jo tām piemīt stabilas augšanas īpašības, vienlaikus saglabājot dabisko glikozilēšanas mehānismu. Lietojumiem, kam nepieciešama paaugstināta transfekcijas efektivitāte, mūsu HEK293T šūnas (300189 ) ļauj veikt ātrus ekspresijas pētījumus.

Nukleotīdu cukuru metabolisms un prekursoru inženierija

Glikozilēšanas efektivitāte ir būtiski atkarīga no nukleotīdu cukuru donoru pieejamības endoplazmas retikulā un Golgi aparātā. Šīs aktivētās cukura molekulas, tostarp UDP-glikoze, UDP-galaktoze, UDP-N-acetilglikozamīns, GDP-mannoze, GDP-fukuoze un CMP-siālskābe, kalpo kā substrāti glikoziltransferāzēm, kas konstruē glikānu ķēdes.

Metabolisma inženierijas pieejas var palielināt nukleotīdu cukuru krājumus, izmantojot vairākus mehānismus. Kultūras barotnes tieša papildināšana ar monosaharīdiem, piemēram, galaktozi, mannozi vai N-acetilmanozamīnu (ManNAc), nodrošina glābšanas ceļa substrātus, kurus šūnas var pārvērst atbilstošos nukleotīdu cukros. Ir pierādīts, ka 10-40 mM ManNAc piedevas ievērojami palielina sialilizācijas līmeni dažādās šūnu līnijās.

Ģenētiskās pieejas piedāvā pastāvīgākus risinājumus. Nukleotīdu cukuru biosintēzes ceļu galveno enzīmu, tostarp CMP-sialīnskābes sintetāzes, UDP-glikozes pirofosforilāzes vai GDP-manozes pirofosforilāzes, pārmērīga ekspresija var ilgtspējīgi palielināt prekursoru kopumu, neprasot barotnes papildināšanu.

Kultūras apstākļu optimizācija glikānu kvalitātei

Vides parametri būtiski ietekmē glikozilēšanas rezultātus, un to ietekme uz glikānu profiliem bieži vien ir līdzvērtīga ģenētisko modifikāciju ietekmei. Ir konsekventi pierādīts, ka temperatūras pazemināšana no 37 °C līdz 32-34 °C ražošanas fāzē veicina sialilēšanos, iespējams, pateicoties pagarinātam olbaltumvielu uzturēšanās laikam Golgi un samazinātai sialidāzes aktivitātei.

Kultūras pH ietekmē gan glikoziltransferāzes aktivitāti, gan glikānu stabilitāti. PH uzturēšana no 6,8 līdz 7,2 parasti veicina optimālu glikozilināšanu, lai gan konkrētais optimālais līmenis var atšķirties atkarībā no mērķa proteīna un vēlamā glikāna profila. pH vērtības, kas ir zemākas par 6,5, var veicināt siālskābes šķelšanos, samazinot terminālo sialilēšanos.

Izšķīdušā skābekļa līmenis ietekmē šūnu metabolismu un līdz ar to arī glikozilināšanu. Hipoksiski apstākļi (zem 20 % gaisa piesātinājuma) var pasliktināt šūnu augšanu un produktivitāti, savukārt mērens skābekļa līmenis (30-50 % gaisa piesātinājuma) parasti veicina spēcīgu glikozilināšanu. Hiperoksiskos apstākļos var rasties reaktīvās skābekļa formas, kas bojā glikoproteīnus vai traucē glikozilēšanas mehānismu darbību.

Mūsu DMEM:Ham's F12 (1:1) barotne (820400a) nodrošina lielisku bāzes sastāvu glikoproteīnu ražošanai, piedāvājot sabalansētu barības vielu sastāvu, kas atbalsta gan šūnu augšanu, gan pēctranslācijas apstrādi.

Gēnu inženierija pielāgotai glikozilēšanai

Mūsdienu gēnu inženierijas rīki ļauj precīzi modificēt HEK293 glikozilēšanas spējas, lai iegūtu proteīnus ar pielāgotu glikānu struktūru. CRISPR/Cas9 tehnoloģija ir revolucionizējusi šo jomu, ļaujot efektīvi izslēgt specifiskas glikoziltransferāzes vai ieviest jaunas fermentu aktivitātes.

Afukozīlētās antivielas ir nozīmīgs glikoinženierijas pielietojums. FUT8 gēna, kas kodē α1,6-fukoziltransferāzi, izslēgšana novērš N-glikānu fukozilēšanas kodolu. Afukozīlētām antivielām ir ievērojami uzlabota no antivielām atkarīgā šūnu citotoksicitāte (ADCC), kas ir vēlama īpašība onkoloģisko terapiju jomā.

Un otrādi, glikoziltransferāžu pārmērīga ekspresija var pastiprināt specifiskas modifikācijas. Ieviešot β1,4-N-acetilglikozamiltransferāzi III (GnT-III), rodas antivielas ar divkāršu N-acetilglikozamīnu, kas ir vēl viena modifikācija, kas saistīta ar pastiprinātu efektora funkciju. Galaktoziltransferāžu un sialiltransferāžu pārmērīga ekspresija palielina terminālā glikāna pārklājumu, potenciāli uzlabojot seruma pusperiodu.

Glikoproteīnu ražošanai plašā mērogā, izmantojot suspensijas kultūras, mūsu HEK293 suspensijai pielāgotās šūnas (300686) var tikt tālāk pārveidotas, lai iekļautu vēlamās glikozilēšanas modifikācijas.

Analītiskās stratēģijas glikozilēšanas novērtēšanai

Visaptverošai glikānu raksturošanai nepieciešamas vairākas savstarpēji papildinošas analītiskās pieejas. Atbrīvota glikānu analīze, izmantojot hidrofilās mijiedarbības šķidrumu hromatogrāfiju (HILIC) ar fluorescences detektoru, nodrošina detalizētu glikānu profilēšanu ar lielisku jutību. Masas spektrometrija papildina strukturālo apstiprinājumu un ļauj identificēt negaidītas modifikācijas.

Glikozilēšanas analīze atkarībā no vietas risina glikoproteīniem raksturīgo heterogenitāti. Glikopeptīdu kartēšana, izmantojot LC-MS/MS, atklāj gan atsevišķu glikozilēšanas vietu aizņemtību, gan katrā vietā esošās glikānu struktūras. Šī informācija ir ļoti svarīga, lai izprastu struktūras un funkcijas sakarības un nodrošinātu dažādu partiju atbilstību.

Ātrās skrīninga metodes palīdz attīstīt procesus un kvalitātes kontroli. Uz lektīniem balstīti testi, kapilārā elektroforēze un glikāniem specifiskas antivielas ļauj veikt augstas veiktspējas galveno glikānu īpašību novērtēšanu, neprasot plašu paraugu sagatavošanu.

Ieteicamie produkti glikoproteīnu ražošanai:

• HEK293 šūnas (300192) - dabiskie cilvēka glikozilēšanas modeļi
• HEK293T šūnas (300189) - augsta transfekcijas efektivitāte ātrai izpētei
• HEK293 suspensijai pielāgotas HEK293 (300686 ) - mērogojama ražošanas platforma
• DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a ) - optimizēts glikoproteīnu ražošanai