Iet uz galveno lapu
Iepirkumu grozs 0,00 €*
Rādīt visas kategorijas HEK šūnu bāzes augstas caurlaidspējas GPCR skrīninga platformas Atpakaļ

Uz HEK šūnām balstītas augstas veiktspējas GPCR skrīninga platformas

Ar G olbaltumvielām saistītie receptori (GPCR) ir lielākā membrānas olbaltumvielu grupa cilvēka genomā un veido aptuveni 34 % no visiem zāļu mērķiem. Uzņēmumā Cytion mēs apzināmies, ka, lai izstrādātu efektīvas, uz GPCR vērstas terapijas, ir nepieciešamas spēcīgas uz šūnām balstītas skrīninga platformas, kas spēj precīzi izmērīt receptoru aktivāciju tūkstošiem līdz miljoniem savienojumu. HEK293 šūnas ir kļuvušas par vēlamo saimniekorganismu GPCR ekspresijai un funkcionālajam skrīningam, piedāvājot unikālu efektīvu receptoru ekspresiju, zemu endogēno receptoru fonu un savietojamību ar dažādiem testu formātiem.

Galvenie secinājumi

  • HEK293 šūnas nodrošina ideālu fonu heterologu GPCR ekspresijai ar minimālu endogēno receptoru iejaukšanos
  • Vairāki testēšanas formāti - kalcija plūsma, cAMP, β-arrestīna rekrutēšana - ļauj veikt visaptverošu ceļu izpēti
  • Automatizēta šķidrumu apstrāde un plašu lasītāji ļauj veikt skrīninga caurlaidību, kas pārsniedz 100 000 savienojumu dienā
  • Stabilas šūnu līniju izstrādes stratēģijas līdzsvaro caurlaidspējas prasības ar analīžu konsekvenci
  • Neobjektīva agonisma noteikšana prasa multipleksētus nolasījumus dažādās signālu kaskādēs
Uz HEK293 bāzēta GPCR augstas caurlaidības skrīninga platforma GPCR signalizācijas ceļi GPCR Gαs ↑cAMP Gαq ↑Ca²⁺ β-arr Rekrutēt Testēšanas tehnoloģijas Kalcija plūsma Fluo-4/Fura-2 FLIPR/plākšņu nolasītājs cAMP testi HTRF/AlphaScreen GloSensor β-arrestīns PathHunter BRET/NanoBiT Gēns-reportieris CRE-Luc NFAT-Luc HTS darba plūsma Šūnu izsēšana 384/1536 iedobes Savienojums Pievienošana Detekcija Nolasīšana Analīze Trāpījumu atlase HEK293 priekšrocības GPCR skrīningam Zems fons Minimāls endogēnu GPCR ekspresija Tīrs signāls/troksnis Augsta ekspresija Efektīva transfekcija Spēcīgi CMV promotori 10⁵-10⁶ receptoru/šūnu Pilnīga signalizācija Visi G proteīnu apakštipi Adaptoru proteīnu klātbūtne Dabiskais ceļu savienojums Saderīgs ar testu Izturīgs mikrodaļiņās Pielāgošanās suspensijai Automatizēta apstrāde Skrīninga caurlaidspējas rādītāji Formāts Akastes/plāksnīte Savienojumi/dienā 96 iedobju 96 5,000-10,000 384 iedobes 384 20,000-50,000 1536-veida urbums 1536 100,000-500,000 3456 - urbums 3456 500,000-1,000,000+ Stabilas šūnu līnijas izveide 1. Vektoru dizains ar selekcijas marķieri 2. HEK293 vecāku šūnu transfekcija 3. Antibiotiku selekcija (2-4 nedēļas) 4. Vienas šūnas klonēšana (FACS/limitējošais atšķaidījums) 5. Klonu skrīnings ekspresijas/funkcijas noteikšanai 6. Šūnu bankas un stabilitātes testēšana Termiņš: 3-6 mēneši © Cytion - GPCR zāļu atklāšanas iespējas

Kāpēc HEK293 šūnas ir lieliski piemērotas GPCR skrīningam

HEK293 šūnas ir kļuvušas par de facto standartu GPCR funkcionālo testu veikšanai vairāku raksturīgu priekšrocību dēļ. Pirmkārt, to relatīvi zemā endogēnā GPCR ekspresija samazina fona signalizāciju, kas varētu apgrūtināt heteroloģisko receptoru pētījumus. Atšķirībā no dažām no vēža iegūtām šūnu līnijām, kas funkcionāli nozīmīgos līmeņos ekspresē daudzus GPCR, HEK293 šūnas nodrošina tīru audeklu receptoru ekspresijai.

Otrkārt, HEK293 šūnas ekspresē visas galvenās G olbaltumvielu apakšklases (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) pietiekamā līmenī, lai nodrošinātu dažādu receptoru savienošanu. Šis pilnais signalizācijas repertuārs ļauj pētīt dabisko receptoru un olbaltumvielu mijiedarbību, neprasot specifisku G olbaltumvielu apakšvienību līdz-ekspresiju.

Treškārt, HEK293 šūnas efektīvi transfekē, izmantojot vairākas reaģentu klases, sasniedzot transfekcijas ātrumu, kas pārsniedz 90 %. Šī efektivitāte nozīmē augstu receptoru ekspresijas līmeni - parasti 10 līdz 10⁵ līdz 10⁶ receptoru vienā šūnā, nodrošinot stabilus signāla logus pat receptoriem ar nelielu savienošanas efektivitāti.

Mūsu HEK293T šūnas (300189 ) nodrošina īpaši augstu transfekcijas efektivitāti GPCR pārejošai ekspresijai, tāpēc tās ir ideāli piemērotas sākotnējai receptoru raksturošanai un testu izstrādei pirms stabilas šūnu līnijas izveides.

Testa formāta izvēle GPCR skrīningam

Kalcija plūsmas testi: Gαq saistītie receptori aktivizē fosfolipāzi C, izraisot kalcija izdalīšanos no intracelulārajiem krājumiem. Kalcijsensitīvas fluorescējošas krāsvielas, piemēram, Fluo-4, Fura-2 vai ģenētiski kodēti kalcija indikatori, ļauj mērīt šo reakciju reālajā laikā. Tādi fluorescences nolasītāji, kā FLIPR, var vienlaicīgi izmērīt kalcija pārejas visā 384 vai 1536 iedobju plāksnītē, sasniedzot caurlaides spēju, kas pārsniedz 100 000 datu punktu dienā.

cAMP testi: Gαs saistītie receptori stimulē adenilciklāzi, palielinot intracelulāro cAMP, savukārt Gαi saistītie receptori kavē cAMP veidošanos. Vairākas testēšanas tehnoloģijas nosaka cAMP izmaiņas, tostarp konkurējošās imūnanalīzes (HTRF, AlphaScreen), uz biosensoriem balstītas pieejas (GloSensor) un reportieru gēnu testi (CRE-luciferāze). Katram no tiem ir atšķirīgas jutīguma, kinētikas un veiktspējas priekšrocības.

β-arrestīna vervēšana: GPCR aktivācija izraisa β-arrestīna piesaisti receptoram, un šo procesu var izmērīt, izmantojot proteīnu komplementācijas testus. Tādas tehnoloģijas kā PathHunter (fermentu fragmentu papildināšana) un NanoBiT (luciferāzes sadalīšana) nodrošina jutīgus, no ceļiem neatkarīgus nolasījumus, kas piemērojami visām receptoru klasēm neatkarīgi no G proteīnu savienojuma preferences.

Ziņotāju gēnu testi: Transkripcijas reportieru sistēmas mēra pakārtotos signalizācijas notikumus, piedāvājot pastiprinājumu, kas palielina jutību. CRE-luciferāzes reportieri nosaka cAMP ceļa aktivāciju, NFAT-luciferāze reaģē uz kalcija signālu, bet SRE-luciferāze uzrauga vairākus ceļus. Lai gan tie ir lēnāki nekā tiešie otrā ziņotāja mērījumi, reportieru testi nodrošina lielisku signāla un fona attiecību.

Stabilu šūnu līniju izstrādes stratēģijas

Veicot augstas veiktspējas skrīninga kampaņas, parasti ir nepieciešamas stabilas šūnu līnijas, kas mērķgrupu GPCR ekspresē nemainīgos līmeņos miljardos analīzes iedobju. Stabilas līnijas izveide sākas ar vektora izstrādi, kurā ietverts gan receptoru, gan selektīvs marķieris, kas ļauj bagātināt stabili transficētas šūnas.

Mūsu HEK293 šūnas (300192 ) kalpo kā standarta vecāku līnija stabilu šūnu līniju veidošanai. Pēc transfekcijas un atlases ar antibiotikām (parasti 2-4 nedēļas) izdzīvojušās šūnas tiek klonētas, izmantojot ierobežojošu atšķaidījumu vai ar fluorescenci aktivizētu šūnu šķirošanu (FACS). Pēc tam atsevišķus klonus paplašina un raksturo receptoru ekspresijas līmeni, funkcionālās atbildes reakcijas lielumu un testēšanas stabilitāti.

Kritiski kvalitātes raksturlielumi šūnu līniju skrīningam ietver ekspresijas stabilitāti ilgākā laika posmā, konsekventu farmakoloģiju salīdzinājumā ar references standartiem un stabilu darbību miniatūrās plates formātos. Kvalificētu šūnu bankas jāizveido skrīninga kampaņas sākumā, lai nodrošinātu konsekventu darbību visā skrīninga laikā.

Lai paātrinātu laika grafiku, mūsu HEK293 EBNA šūnas (300264 ) nodrošina stabilu ekspresiju no epizomāliem vektoriem, potenciāli saīsinot izstrādes termiņus, vienlaikus saglabājot ekspresijas konsekvenci.

Miniaturizācijas un automatizācijas apsvērumi

Lai maksimāli palielinātu skrīninga caurlaidspēju, nepieciešama miniaturizācija līdz 384 iedobju, 1536 iedobju vai pat 3456 iedobju formātiem. HEK293 šūnas labi pielāgojas liela blīvuma uzsējumam samazinātos tilpumos, lai gan katrai formāta maiņai var būt nepieciešama šūnu blīvuma, uzsējuma nosacījumu un inkubācijas laika optimizācija.

HEK293 šūnas, kas pielāgotas suspensijai, piedāvā priekšrocības automatizētai skrīninga darba plūsmai. Mūsu HEK293 suspensijai adaptētās (300686 ) šūnas var izlietot tieši no kultūras traukiem uz testa plates bez tripsinizācijas, samazinot apstrādes posmus un uzlabojot konsekvenci. Šī savietojamība ar automatizētiem šķidrumu apstrādes iekārtām ļauj veikt patiesas skrīninga kampaņas.

Testa plates stabilitātes prasības atšķiras atkarībā no formāta. Kalcija plūsmas testiem parasti ir jāveic mērījumi dažu stundu laikā pēc krāsvielas iepildīšanas, bet cAMP un β-arrestīna testus pirms nolasīšanas var atļaut inkubēt visu nakti. Izprotot šos ierobežojumus, var uzlabot skrīninga loģistiku un iekārtu plānošanu.

Datu analīze un trāpījumu identificēšana

GPCR skrīninga kampaņas rada milzīgus datu masīvus, kam nepieciešami spēcīgi analīzes cauruļvadi. Statistiskie parametri, tostarp Z'-faktors, signāla un fona attiecība un variāciju koeficients, novērtē analīzes kvalitāti katrā plāksnē atsevišķi. Plāksnes, kas neatbilst kvalitātes robežvērtībām, ir jāatkārto, nevis jāanalizē.

Atbilstības noteikšanas kritēriji līdzsvaro jutīgumu ar viltus pozitīvo rezultātu skaitu. Aktivitātes robežvērtības 50 % aktivācijas vai inhibīcijas attiecībā pret standartvielu ir saprātīgi sākumpunkti, lai gan optimālās robežvērtības ir atkarīgas no bibliotēkas sastāva un programmas mērķiem. Primāro trāpījumu koncentrācijas un atbildes reakcijas apstiprināšana novērš artefaktus un sakārto savienojumus turpmākai kontrolei.

Mūsdienu GPCR zāļu atklāšanā aizvien vairāk tiek uzsvērts neobjektīvs agonisms - savienojumi, kas prioritāri aktivizē dažus signalizācijas ceļus, nevis citus. Lai atklātu neobjektīvus savienojumus, ir jāveic paralēli testi, kuros mēra vairākus ceļus (piemēram, G proteīna aktivizāciju pret β-arrestīna rekrutēšanu), rūpīgi pievēršot uzmanību testu jutībai un kinētikai, lai izvairītos no tehniskiem novirzieniem.

Ieteicamie produkti GPCR skrīningam:

Šajā tīmekļa vietnē tiek izmantotas sīkdatnes, lai nodrošinātu vislabāko pieredzi mūsu tīmekļa vietnē... Vairāk informācijas.
- Imprint

Esam konstatējuši, ka atrodaties citā valstī vai izmantojat citu pārlūkprogrammas valodu, kas nav pašlaik izvēlētā. Vai vēlaties pieņemt ieteiktos iestatījumus?

Aizvērt