Fluorescējošo šūnu kriokonservēšana

Fluorescējošo šūnu saglabāšanai rūpīgi jāapsver gan kriokonservēšanas process, gan fluorescējošo proteīnu stabilitātes saglabāšana. Uzņēmumā Cytion mēs esam izstrādājuši optimizētus protokolus, lai nodrošinātu, ka jūsu fluorescējoši marķētās šūnas pēc atkausēšanas saglabā gan dzīvotspēju, gan fluorescences intensitāti.

Fluorescējošo proteīnu stabilitāte kriokonservēšanas laikā

Fluorescējošie proteīni, jo īpaši GFP un tā varianti, uzrāda ievērojamu stabilitāti pareizas kriokonservēšanas procedūras laikā. Mūsu Cytion pētījumi, jo īpaši ar tādām šūnu līnijām kā HK EGFP-alfa-tubulīna/H2B-mCherry Cells un HK EGFP-H2B Cells, liecina, ka fluorescējošās olbaltumvielas saglabā savu strukturālo integritāti, ja tās sasaldē optimālos apstākļos. Veiksmīgas saglabāšanas atslēga ir atbilstošu krioprotektoru izmantošana un standartizētu protokolu ievērošana. Mēs iesakām izmantot sasaldēšanas barotni CM-1, kas ir īpaši izstrādāta, lai aizsargātu šūnu struktūras un saglabātu proteīnu stabilitāti sasaldēšanas procesā. Ja tiek izmantotas pareizas kriokonservēšanas metodes, fluorescējošo proteīnu ekspresija pēc atkausēšanas parasti saglabājas virs 90 % no pirms sasaldēšanas līmeņa.

Saldēšanas barotnes sastāva nozīme fluorescences saglabāšanā

Saldēšanas barotnes sastāvam ir izšķiroša nozīme gan šūnu dzīvotspējas, gan fluorescences intensitātes saglabāšanā. Uzņēmumā Cytion mēs esam izstrādājuši specializētas kriokonservēšanas barotnes, kas risina unikālas fluorescējošo šūnu saglabāšanas problēmas. Mūsu sasaldēšanas barotne CM-ACF, kas nesatur serumu, ir īpaši optimizēta fluorescējošo proteīnu aizsardzībai sasaldēšanas procesa laikā. Jutīgām fluorescējošām šūnu līnijām, piemēram, HK EGFP-Cap-D2 šūnām, mēs iesakām izmantot mūsu sasaldēšanas barotni CM-1 - 100 ml, kas satur optimizētu krioprotektoru koncentrāciju, kas novērš ledus kristālu veidošanos, vienlaikus saglabājot fluoroforu stabilitāti. Barotnes līdzsvarotā osmolaritāte un aizsargvielas nodrošina, ka fluorescējošie proteīni saglabā savu dabisko konformāciju visā sasaldēšanas un atkausēšanas procesā, kā rezultātā fluorescences signāli pēc atkausēšanas ir nemainīgi.

Saldēšana ar kontrolētu ātrumu: Būtiska fluorescences saglabāšanai

Lai kriokonservēšanas laikā saglabātu fluorescējošo olbaltumvielu integritāti, ļoti svarīga ir kontrolēta sasaldēšana. Cytion pētījumi ar fluorescējošām šūnu līnijām, piemēram, NRK-EGFP-H2B šūnām un U2OS-CRISPR-NUP96-SNAP klona Nr. 33 šūnām, liecina, ka fluorescences intensitātes saglabāšanai optimāls ir dzesēšanas ātrums -1 °C minūtē. Šī kontrolētā pieeja apvienojumā ar mūsu saldēšanas barotni CM-ACF - bez seruma - 100 ml samazina kaitīgu ledus kristālu veidošanos, kas var ietekmēt olbaltumvielu struktūru. Lai panāktu vienmērīgu dzesēšanas ātrumu, iesakām izmantot izopropanola sasaldēšanas trauku vai programmējamu saldētavu. Šī metode ir īpaši efektīva, lai saglabātu sarežģītas fluorescējošo proteīnu konfigurācijas, piemēram, tādas, kādas ir mūsu HK EGFP-LaminA/H2B-mCherry šūnās.

Īpaši apsvērumi attiecībā uz GFP un RFP ekspresijas šūnu apstrādi

Dažādiem fluorescējošiem proteīniem optimālai saglabāšanai nepieciešama īpaša apstrāde. Mūsu Cytion pieredze ar tādām šūnām kā HK EGFP-LaminB1/H2B-mCherry šūnas liecina, ka GFP varianti kriokonservēšanas laikā parasti ir stabilāki nekā RFP varianti. GFP ekspresijas šūnām mēs iesakām izmantot mūsu saldēšanas barotni CM-ACF - bez seruma - 100 ml, kas nodrošina labāku fluoroforu struktūras aizsardzību. RFP ekspresijas šūnām, piemēram, mūsu HK-CRISPR-Pom121-mCherry #32 šūnām, ir lietderīgi pievienot antioksidantus saldēšanas vidē, lai novērstu fluoroforu degradāciju. Galvenās apstrādes atšķirības ir šādas:

• GFP ekspresijas šūnas: Standarta dzesēšanas ātrums (-1°C/min) ar barotni bez seruma
• RFP ekspresijas šūnas: Nedaudz ātrāka dzesēšana (-1,5 °C/min) ar antioksidantu papildinātu barotni
• Abi veidi: Minimāla gaismas iedarbība apstrādes laikā
• Aizsardzība pret pH svārstībām sasaldēšanas procesā

Atjaunošanās periodi pēc atkausēšanas un fluorescences novērtējums

Pēc kriokonservēšanas fluorescējošām šūnām ir nepieciešami īpaši atjaunošanās periodi, lai atgūtu optimālu fluorescences intensitāti. Mūsu pētījumi ar HEK293 šūnām, kas ekspresē fluorescējošus proteīnus, liecina, ka izšķiroša nozīme ir 24-48 stundu atjaunošanās periodam. Šajā laikā šūnas jāuztur pilnvērtīgā barotnē, kas papildināta ar standarta antibiotikām. Esam novērojuši, ka fluorescences intensitāte parasti sasniedz maksimumu aptuveni 72 stundas pēc atkausēšanas, īpaši tādās šūnu līnijās kā HEK293T šūnas, kas ekspresē GFP variantus.

Fluorescējošo šūnu saglabāšanas stratēģijas optimizēšana

Fluorescējošo šūnu saglabāšanas panākumu pamatā ir visaptveroša pieeja kriokonservēšanai. Cytion iesaka izmantot mūsu sasaldēšanas barotni CM-1 kombinācijā ar kontrolētas sasaldēšanas ātruma protokoliem. Regulāra fluorescences saglabāšanas pārbaude, izmantojot plūsmas citometriju vai fluorescences mikroskopiju, nodrošina konsekventus rezultātus. Specializētiem lietojumiem mūsu tehniskā atbalsta komanda var nodrošināt pielāgotus protokolus, kas pielāgoti jūsu specifiskajām fluorescējošo šūnu līnijām. Atcerieties, ka gan šūnu dzīvotspējas, gan fluorescences intensitātes saglabāšanai būtiska ir pareiza apstrāde visa procesa laikā - no sagatavošanas pirms sasaldēšanas līdz atjaunošanai pēc atkausēšanas. Uzticieties Cytion kompetencei un produktiem, lai palīdzētu jums sasniegt optimālus rezultātus fluorescējošo šūnu saglabāšanas vajadzībām.