Cirkulējošo audzēja šūnu (CTC) kultūra: Izaicinājumi un jaunie risinājumi

Cirkulējošās audzēja šūnas ir reta vēža šūnu populācija, kas ir atdalījušās no primārajiem audzējiem vai metastātiskām vietām un nonākušas asinsritē, kalpojot gan par metastāžu starpniekiem, gan potenciāliem reāllaika audzēja informācijas avotiem. Uzņēmumā Cytion mēs apzināmies, ka veiksmīga CTC kultivēšana varētu radīt apvērsumu personalizētajā vēža medicīnā, ļaujot veikt funkcionālu zāļu testēšanu, genomu raksturošanu un mehānistiskus pētījumus, izmantojot pacienta audzēja šūnas, kas iegūtas, veicot minimāli invazīvu asins noņemšanu. Tomēr CTC kultivēšana ir saistīta ar ārkārtīgām tehniskām problēmām: šīs šūnas ir ārkārtīgi retas (bieži vien mazāk nekā 10 šūnu mililitrā asins starp miljardiem normālu asins šūnu), ļoti neviendabīgas, trauslas un pakļautas zudumiem izolācijas un kultivēšanas laikā. Neraugoties uz šiem šķēršļiem, nesenie tehnoloģiskie sasniegumi padara CTC kultūru audzēšanu aizvien iespējamāku, paverot jaunas iespējas precīzās onkoloģijas attīstībā.

CTC bioloģija un klīniskā nozīme

CTC nonāk asinsritē gan no primārajiem audzējiem, gan metastātiskiem bojājumiem, un to klātbūtne ir saistīta ar slimības progresēšanu un prognozi daudzos vēža veidos. Šīs šūnas saskaras ar naidīgu vidi - asiņu plūsmas stresu, imūnsistēmas uzraudzību, matriksa piesaistes trūkumu, un lielākā daļa no tām ātri iet bojā. Retajām CTC, kas izdzīvo, piemīt īpašības, kas nodrošina metastātisku potenciālu: noturība pret anoikozi (atdalīšanas izraisītu šūnu nāvi), spēja izdzīvot suspensijā un spēja ekstravazēt un kolonizēt attālus orgānus. CTC kultivēšana nodrošinātu vēl nebijušu piekļuvi šiem metastāžu prekursoriem, ļaujot veikt funkcionālu raksturojumu, ko nevar atklāt tikai genoma analīze. Tomēr to retums un trauslums padara CTC kultivēšanu par vienu no tehniski vissarežģītākajām procedūrām šūnu bioloģijā.

Izolēšanas tehnoloģijas: Pirmais kritiskais solis

Pirms CTC var kultivēt, tie ir jāatdala no milzīgā normālo asins šūnu pārpalikuma. Fiziskās atdalīšanas metodes izmanto izmēru atšķirības (KTK parasti ir lielākas par asins šūnām), izmantojot filtrēšanas vai mikrofluidiskās ierīces. Imunoafinitātes metodes ļauj uztvert CTC, kas ekspresē epitēlija marķierus, piemēram, EpCAM, izmantojot ar antivielām pārklātas virsmas vai magnētiskās lodītes. Tomēr šīm metodēm ir ierobežojumi: ne visi CTC ir lieli vai ekspresē EpCAM, jo īpaši tie, kuros notiek epitēlija-mezenhimālā pāreja (EMT). Negatīvā deplecija likvidē asins šūnas, atstājot CTC neskartus, tomēr to tīrība joprojām ir problemātiska. Ideālai izolēšanas metodei kultūrā jābūt saudzīgai, lai saglabātu dzīvotspēju, vienlaikus panākot pietiekamu bagātināšanu un tīrību, lai novērstu asins šūnu pārmērīgu augšanu.

Anoikis problēma

Adherējošām šūnām izdzīvošanai parasti ir nepieciešama pieķeršanās āršūnu matricai; kad tās atdalās, tām notiek anoikis, kas ir ieprogrammētas šūnu nāves veids. Lai izdzīvotu, asinsritē esošajām CTC jāpārvar anoikis, bet pat šīs izturīgās šūnas izolācijas un pārejas uz kultūru laikā cieš no ievērojama stresa. Stratēģijas, lai cīnītos pret anoikozi, ietver tūlītēju izkliedēšanu uz matricas pārklājuma virsmām, kultivēšanu trīsdimensiju matricās, kas nodrošina strukturālu atbalstu, papildināšanu ar izdzīvošanas faktoriem, piemēram, insulīnam līdzīgiem augšanas faktoriem vai EGF, vai kopkultūru ar palīgšūnām, kas nodrošina izdzīvošanas signālus. Pirmās 24-48 stundas pēc izolēšanas nosaka, vai CTC pielāgosies kultivēšanas apstākļiem, vai pakļausies atdalīšanas izraisītai nāvei.

Proliferācijas uzsākšana no retām šūnām

Pat tad, ja CTC izdzīvo izolāciju, proliferācijas iniciēšana no ļoti maza šūnu skaita rada īpašas problēmas. Standarta šūnu kultūras bieži paļaujas uz parakrīno signalizāciju starp šūnām, bet, ja ir tikai daži CTC, šie signāli ir nepietiekami. Nepieciešamos faktorus var nodrošināt kondicionēta barotne no izveidotām vēža šūnu līnijām vai normālām šūnām un šūnu līnijām. Augšanas apstādinātu šūnu barojošie slāņi nodrošina parakrīnos signālus, nekonkurējot par resursiem. Mikrošūnu masīvi ierobežo atsevišķus CTC nelielos tilpumos, kuros izdalītie faktori sasniedz efektīvu koncentrāciju. Specializēti barotņu sastāvi, kas optimizēti zema blīvuma kultūrai, ietver paaugstinātas augšanas faktoru koncentrācijas un papildu piedevas, kas atbalsta stresa nomāktās šūnas. Mērķis ir radīt mikrovidi, kas pārvar ierobežojumus, ko rada ārkārtīgi zems blīvums.

Trīsdimensiju kultūras pieejas

trīsdimensiju kultūru sistēmas ir īpaši daudzsološas CTC paplašināšanai. CTC ievietošana matrigelī, kolagēnā vai sintētiskos hidrogēlos nodrošina matricas stiprinājuma punktus, kas novērš anoikozi, vienlaikus nodrošinot trīsdimensiju organizāciju. Arī organoīdu kultūras metodes, kas ir izrādījušās veiksmīgas normāliem audiem un primārajiem audzējiem, var atbalstīt CTC augšanu, atsevišķiem CTC veidojot mazas audzējiem līdzīgas struktūras. Šīs 3D kultūras var labāk saglabāt CTC fenotipus nekā tradicionālie monoslāņi, saglabājot šūnu arhitektūru un signalizācijas kontekstus, kas ir līdzīgāki in vivo audzējiem. Dažas sistēmas apvieno 3D kultūru ar mikrofluidisku perfūziju, lai nodrošinātu barības vielu piegādi un atkritumu aizvadi, radot miniatūru audzēja mikrovidi, kas nodrošina ilgtermiņa CTC kultūru.

Barojošo šūnu sistēmas

Vēl viena stratēģija CTC paplašināšanai ir kopkultūra ar barotājšūnām. Apstarotie vai mitomicīnu apstrādātie fibroblasti, endotēlija šūnas vai pat ar vēzi saistītie fibroblasti nodrošina augšanas faktorus, matriksa proteīnus un metabolisko atbalstu, paši neproliferējot. Tomēr barotņu sistēmas rada sarežģījumus: lai atšķirt CTC no barotnēm, ir nepieciešama rūpīga izsekošana, iespējams, izmantojot fluorescējošu marķēšanu vai atšķirīgu morfoloģiju. Galu galā CTC ir jāatdala no barotājvielām, izmantojot selektīvu barotni, diferencētu tripsinizāciju vai imunomagnētisko šķirošanu. Neraugoties uz šīm problēmām, barotavu sistēmas ir ļāvušas sasniegt tādu CTC kultūras sekmīguma līmeni, kādu būtu grūti sasniegt bez barotavas apstākļos, jo īpaši kritiskajā agrīnās paplašināšanās fāzē.

Heterogenitātes risināšana, izmantojot klonu kultūru

CTC populācijas ir ļoti neviendabīgas, jo tajās ir šūnas ar atšķirīgu metastātisku potenciālu, jutību pret zālēm un proliferācijas spēju. Jauktu CTC populāciju masveida kultivēšana var ļaut dominēt ātri augošiem kloniem, tādējādi zaudējot daudzveidību, kas padara CTC par klīniski informatīviem. Atsevišķu šūnu izolēšana, kam seko klonu paplašināšana, saglabā šo heterogenitāti, ļaujot raksturot atsevišķas CTC subpopulācijas. Mikromanipulācija, ar fluorescenci aktivizēta šūnu šķirošana (FACS) vai mikrofluidiska vienšūnu dozēšana var izolēt atsevišķus CTC atsevišķās iedobēs. Lai gan šī pieeja ir tehniski sarežģīta un prasa pacietību, jo atsevišķas šūnas lēnām veido klonus, tā atklāj patieso daudzveidību pacienta CTC populācijā un identificē subpopulācijas ar atšķirīgām funkcionālām īpašībām.

Barotnes optimizācija CTC augšanai

Universālas CTC kultūras barotnes nav, jo CTC no dažādiem vēža tipiem un pacientiem ir atšķirīgas prasības. Daudzas grupas sāk ar barotnēm, kas optimizētas līdzīgas izcelsmes vēža šūnu līnijām (piemēram, RPMI krūts vēža CTC, DMEM plaušu vēža CTC), pēc tam tās papildina ar papildu augšanas faktoriem, tostarp EGF, FGF, insulīnu un citiem. Dažos protokolos ir pievienoti cilmes šūnu barotnes komponenti, piemēram, B27 vai N2 piedevas, izvirzot hipotēzi, ka CTC ar cilmes šūnām līdzīgām īpašībām var būt nepieciešams līdzīgs atbalsts. Seruma koncentrācija ir vēl viens mainīgs lielums: dažos protokolos izmanto lielu seruma daudzumu (15-20 %), lai maksimāli atbalstītu augšanu, bet citos izmanto noteiktus preparātus bez seruma, lai nodrošinātu labāku kontroli. Var būt nepieciešama empīriska optimizācija katram pacienta paraugam, lai gan tas ir sarežģīti, ņemot vērā ierobežoto izejmateriālu.

Uzraudzība un raksturošana paplašināšanās laikā

Paplašinoties CTC kultūrām, nepārtraukta uzraudzība nodrošina, ka kultivētās šūnas saglabā CTC īpašības un nav pārtapušas par piesārņotājvielām. Identitāti apstiprina imūnkrāsošana ar epitēlija marķieriem (citokeratīni, EpCAM), audzēja tipam atbilstošiem vēža marķieriem (ER/PR krūts gadījumā, PSA prostatas gadījumā) un leikocītu marķieru (CD45) neesamība. Ģenētiskā raksturošana, izmantojot īsu tandēmu atkārtojumu (STR) profilēšanu, kariotipēšanu vai mērķtiecīgu sekvenēšanu, pārbauda, vai kultivētās šūnas atbilst pacienta audzēja genotipam. Funkcionālie testi, ar kuriem novērtē audzēja rezistences īpašības, reakciju uz zālēm vai invazīvās spējas, pierāda, ka kultivētās CTC saglabā bioloģiski būtiskus fenotipus. Šāda nepārtraukta raksturošana ir būtiska, ņemot vērā lielo risku, kas saistīts ar klīnisko lēmumu pieņemšanu, pamatojoties uz CTC kultūrām.

Panākumu rādītāji un prognozējošie faktori

CTC kultūru veiksmīgas kultivēšanas rādītāji joprojām ir zemi - parasti 1-10 % no mēģinājumiem, lai gan tie ievērojami atšķiras atkarībā no vēža veida, slimības stadijas un metodikas. Metastātiskiem pacientiem ar lielu CTC skaitu ir labāki sekmju rādītāji nekā pacientiem, kuriem ir maz CTC. Atsevišķi vēža tipi ir vieglāk kultivējami - krūts, prostatas un plaušu sīkšūnu vēža CTC ir kultivēti biežāk nekā citi. Svarīgi ir arī tehniskie faktori: saudzīgākas izolēšanas metodes, ātra apstrāde, optimizēti kultivēšanas apstākļi un pieredzējuši operatori - visi šie faktori uzlabo rezultātus. Nozarei attīstoties un metodēm standartizējoties, sekmju rādītājiem vajadzētu uzlaboties, taču CTC kultivēšana, visticamāk, joprojām būs sarežģīta, ņemot vērā šo šūnu raksturīgo stresa stāvokli.

No CTC atvasināti eksplantātu modeļi

Alternatīva tradicionālajai in vitro kultūrai ir no CTC atvasinātu eksplantātu (CDX) modeļi, kad CTC tiek injicēti imūnkompromitētām pelēm, lai tās paplašinātu in vivo. Dzīvnieku mikrovide nodrošina augšanas faktorus, matricu un trīsdimensiju arhitektūru, kas var labāk atbalstīt CTC izdzīvošanu nekā mākslīgās kultūras apstākļi. Kad tie ir izveidojušies kā audzēji pelēm, tos var novākt un atkārtoti kultivēt in vitro vai sērijveidā izaudzēt dzīvniekiem. Lai gan šī pieeja ļauj izvairīties no dažām kultivēšanas problēmām, tā rada citas: izmaksas, laiku, prasības attiecībā uz dzīvnieku telpām un potenciālo selekcijas spiedienu no peļu vides, kas var mainīt CTC īpašības. Tomēr CDX modeļi ir izrādījušies vērtīgi gadījumos, kad tiešā kultivēšana neizdodas, jo tie nodrošina paplašināmu materiālu turpmākajiem lietojumiem.

Pielietojums precīzajā onkoloģijā

CTC kultūru galīgais mērķis ir nodrošināt precīzās medicīnas lietojumus. Funkcionālā zāļu testēšana ar pacienta kultivētajiem CTC varētu palīdzēt izvēlēties ārstēšanu, identificējot efektīvas terapijas un izvairoties no bezjēdzīgas toksiskas ārstēšanas. Tā kā CTC atspoguļo audzēja bioloģiju reālajā laikā, tie var labāk atspoguļot pašreizējo jutību pret zālēm nekā pirms vairākiem gadiem arhivēti primāro audzēju paraugi. Kultivētu CTCs mehānistiskie pētījumi var atklāt rezistences mehānismus, metastātiskās īpašības un jaunus terapeitiskos mērķus. No CTC kultūrām iegūto CTC bioloģiskās bankas veido pacientiem atbilstošu vēža modeļu krātuves pētniecībai. Tomēr, lai īstenotu šos lietojumus, ir jāpārvar pašreizējie tehniskie ierobežojumi un jāapstiprina, ka kultivētie CTC precīzi atspoguļo pacienta slimību.

Mikrofluidiskās platformas CTC kultūrām

Mikrofluidiskās ierīces piedāvā unikālas priekšrocības CTC kultivēšanai, jo nodrošina precīzu mikrovides kontroli mērogos, kas atbilst atsevišķām šūnām vai maziem klasteriem. Šajās platformās var izveidot barības vielu gradientus, nodrošināt precīzu faktoru koncentrāciju, uzturēt lamināru plūsmu nepārtrauktai barības vielu apmaiņai un iebūvēt biosensorus reāllaika uzraudzībai. Dažas ierīces apvieno uztveršanu un kultivēšanu vienā sistēmā, līdz minimumam samazinot šūnu zudumus pārvietošanas laikā. Ar attēlveidošanu saderīgas ierīces ļauj nepārtraukti novērot CTC uzvedību, proliferāciju un morfoloģiju. Lai gan mikrofluidiskās pieejas ir daudzsološas, tām ir nepieciešams specializēts aprīkojums un speciālās zināšanas, kas ierobežo to plašu izplatību. Kad šīs tehnoloģijas pilnveidosies un kļūs pieejamākas, tās var kļūt par standarta instrumentiem CTC kultivēšanai.

Kvalitātes kontrole un piesārņojuma novēršana

Ņemot vērā to, ka CTC ir ārkārtīgi reti sastopami, piesārņojums ar asins šūnām vai cita veida šūnām var viegli ietekmēt kultūru kvalitāti. Būtiska ir stingra sterila tehnika, kā arī agrīna piesārņojuma atklāšana. Regulāra mikroskopiskā pārbaude ļauj identificēt morfoloģiski atšķirīgus piesārņotājus. Ar plūsmas citometriju vai imūnkrāsošanu, nosakot līnijzīmētājus (CD45 - leikocītiem, CD31 - endotēlija šūnām), atklāj neepitēlijķermenīšu šūnas. Ja piesārņojums tiek pamanīts agrīni, selektīvs barotnes vai imunomagnētiskā deplecija var glābt kultūru. Profilakse ir labāka nekā ārstēšana: asins šūnu imunoloģiskā noārdīšana pirms kultūras, selektīvas barotnes preparāti un klonu attīrīšana, izolējot vienu šūnu, samazina piesārņojuma risku. Šie stingrie kvalitātes pasākumi ir sarežģītāki, bet nepieciešami, ņemot vērā CTC paraugu vērtīgumu.

Standartizētu šūnu līniju nozīme

Lai gan CTC kultūrā galvenā uzmanība tiek pievērsta pacientu paraugiem, standartizētām šūnām un Cytion šūnu līnijām ir svarīga palīgfunkcija. Izveidotās vēža līnijas kalpo kā pozitīvas kontroles izolācijas tehnoloģijām, ļaujot validēt un optimizēt metodes pirms to piemērošanas vērtīgiem pacientu paraugiem. Tās nodrošina kondicionētu barotni CTC kultūras atbalstam. Sajaucot tās ar asins paraugiem, tiek veidoti mākslīgi ar CTC apauguši paraugi metožu izstrādei un apmācībai. Daži pētnieki izmanto izveidotās līnijas kā aizstājējmodeļus, lai pārbaudītu kultivēšanas apstākļus vai barotņu formulējumus, kas varētu būt labvēlīgi faktiskajiem CTC. Lai gan šie standartizētie rīki neaizstāj pacientu iegūtos CTC, tie paātrina metožu izstrādi un nodrošina kvalitātes kontroli visā darba gaitā.

Jaunās tehnoloģijas un nākotnes virzieni

Vairākas jaunas pieejas var uzlabot CTC kultūru sekmīgu kultivēšanu. Organ-on-chip sistēmas, kas ietver vairākus šūnu tipus, pilnīgāk modelē audzēja mikrovidi. Bioreaktori, kas nodrošina kontrolētu perfūziju, ļauj ilgstoši kultivēt nelielu šūnu skaitu. Uzlabotie biomateriāli ar regulējamām mehāniskām un bioķīmiskām īpašībām optimizē fiziskās kultūras vidi. Mašīnmācīšanās agrīno kultūras parametru analīze var paredzēt veiksmīgu paplašināšanos, ļaujot resursus koncentrēt uz daudzsološiem paraugiem. Vienas šūnas multi-omikas raksturojums pirms kultūras varētu ļaut atlasīt CTC, kas, visticamāk, augs. Uz CRISPR balstīta inženierija varētu uzlabot CTC izdzīvošanu, neapdraudot to klīnisko nozīmīgumu. Šīm tehnoloģijām saplūstot, CTC kultūru audzēšanai vajadzētu kļūt rutīnas praksei, beidzot īstenojot solījumus precīzai vēža medicīnai.