CRISPR skrīnings šūnu līnijās: Funkcionālā analīze genoma mērogā

CRISPR-Cas9 tehnoloģija ir revolucionizējusi funkcionālo genomiku, ļaujot kultivētās šūnās sistemātiski pētīt gēnu funkcijas visos genomos. Uzņēmumā Cytion mēs apzināmies, ka mūsu šūnas un šūnu līnijas kalpo kā spēcīgas platformas CRISPR skrīninga lietojumiem, kas identificē gēnus, kuri kontrolē dažādus šūnu procesus, sākot no proliferācijas līdz rezistencei pret zālēm. CRISPR kopējie skrīni ievieš šūnu populācijās bibliotēkas, kas satur tūkstošiem līdz simtiem tūkstošu vadošo RNS (sgRNS), veidojot masveida kolekcijas, kurās katra šūna saņem atšķirīgu ģenētisku traucējumu. Piemērojot selektīvu spiedienu un sekojot, kuras sgRNA kļūst bagātākas vai mazākas, pētnieki sistemātiski identificē izdzīvošanai būtiskus gēnus, gēnus, kas rada rezistenci pret terapiju, vai gēnus, kas regulē jebkuru atlasāmu fenotipu. Šī objektīvā funkcionālās genomikas pieeja ir paātrinājusi atklājumus vēža bioloģijā, imunoloģijā, infekcijas slimībās un šūnu bioloģijas pamatos, pārvēršot kultivētas šūnas par sistemātisku bioloģisko atklājumu dzinējspēku.

CRISPR bibliotēkas projektēšana un piegāde

Genoma mēroga CRISPR bibliotēkas satur sgRNA sekvences, kas mērķētas uz visiem genoma proteīnkodējošajiem gēniem, parasti ar 4-10 vadītājiem uz gēnu, lai nodrošinātu stabilu pārklājumu un ņemtu vērā mainīgo vadītāju efektivitāti. Cilvēka genoma mēroga bibliotēkas satur 70 000-100 000 sgRNA sekvenču, savukārt mērķtiecīgas bibliotēkas, kas vērstas uz tādām apakšgrupām kā kināzes, epigenētiskie regulatori vai metabolisma enzīmi, nodrošina plašāku pārklājumu ar mazāku kopējo konstrukciju skaitu. Bibliotēkas kvalitāte būtiski ietekmē skrīninga panākumus - vadlīnijām ir efektīvi jāinducē iznīdēšana, vienlaikus izvairoties no blakussaskares efektiem, kas apgrūtina interpretāciju.

Ļentivīrusu piegāde joprojām ir standarts sgRNA bibliotēku ieviešanai šūnu populācijās. Apvienotie lenirovīrusu kopumi, kas satur pilnu sgRNA bibliotēku, inficē šūnas ar zemu inficēšanās daudzuma koeficientu (MOI), parasti 0,3-0,5, nodrošinot, ka lielākā daļa inficēto šūnu saņem tikai vienu sgRNA konstrukciju. Šī prasība par vienu perturbāciju uz vienu šūnu novērš traucējumus, ko rada šūnas ar vairākkārtēju nokautu. Pēc transdukcijas ar antibiotiku selekciju tiek iznīcinātas neinficētās šūnas, iegūstot populācijas, kurās katrai šūnai ir noteikta ģenētiska perturbācija. Cytion šūnu līnijām transdukcijas efektivitāte atšķiras atkarībā no šūnu tipa - suspensijas šūnas bieži vien transducējas efektīvi, bet dažām adherentām līnijām nepieciešama vīrusa koncentrācijas, polibrēna un spinokulācijas optimizācija.

Bibliotēkas pārstāvniecība - šūnu skaits, kurās ir katra sgRNA, - kritiski ietekmē ekrāna kvalitāti. Lai novērstu stohastisku vadlīniju zudumu, ko izraisa nejaušas paraugu ņemšanas efekti, visā eksperimenta laikā ir jāuztur 500-1000 šūnu uz vienu sgRNA. 100 000 sgRNA bibliotēkai tas prasa 50-100 miljonu šūnu sākumkopulāciju un proporcionāla skaita saglabāšanu atlases un pasāžas laikā. Nepietiekama pārstāvība rada troksni, kas aizsedz patiesos trāpījumus un rada viltus pozitīvus rezultātus nejaušas izkrišanas dēļ.

Negatīvās atlases skrīni: Būtisku gēnu identificēšana

Negatīvās atlases skrīni identificē gēnus, kas nepieciešami šūnu izdzīvošanai vai proliferācijai standarta kultūras apstākļos. Šūnas transducē ar sgRNA bibliotēkām, atlasa integrācijai, pēc tam 2-4 nedēļas nepārtraukti pasē, saglabājot bibliotēkas pārstāvību. sgRNA, kas vērstas uz būtiskiem gēniem, izsīkst, jo šūnas, kurās ir šie nokauti, nespēj vairoties vai iet bojā. Salīdzinot sgRNA daudzumu pēdējā laika posmā salīdzinājumā ar sākotnējo populāciju (T0), atklājas, kuri gēni ir nepieciešami, lai eksperimenta apstākļos nodrošinātu piemērotību.

Būtisko gēnu ekrāni rada šūnu līnijām specifiskas atkarības kartes, kas atklāj neaizsargātības vietas, kuras var izmantot terapeitiskai iejaukšanai. Vēža šūnu līnijas bieži vien ir atkarīgas no onkogēniem vai ceļu komponentiem, kas nav nepieciešami normālām šūnām, kas ir potenciāli terapeitiskie mērķi. Piemēram, HeLa šūnām ir raksturīga atkarība no gēniem, kas veicina ātru proliferāciju un genoma nestabilitātes pārvaldību. Projektā Cancer Dependency Map (Vēža atkarību karte) ir veikti genoma CRISPR skrīningi simtiem vēža šūnu līniju, kataloģizējot ģenētiskās atkarības un sasaistot tās ar genoma pazīmēm, lai prognozētu pacientiem raksturīgās ievainojamības.

Kontekstuāli specifiski esenciālitātes ekrāni salīdzina gēnu atkarības dažādos apstākļos vai šūnu līnijās. Veicot paralēlus skrīningus normālās un transformētās šūnās vai šūnās ar atšķirīgu ģenētisko fonu, tiek identificētas sintētiskas letālas mijiedarbības, kurās gēnu zudums ir letāls tikai konkrētos kontekstos. Šīs kontekstam specifiskās atkarības nodrošina terapeitisko logu - genu, kas ir būtiski vēža gadījumā, bet nav nepieciešami normālos audos, mērķēšana samazina toksicitāti. Salīdzinošā CRISPR skrīninga metode, kas raksturo šūnu atkarību ģenētisko arhitektūru Cytion šūnu līnijām, kas pārstāv dažādas audu izcelsmes un transformācijas stāvokļus, ļauj noteikt šūnu atkarību ģenētisko arhitektūru.

Pozitīvās atlases skrīnings: Rezistences un izdzīvošanas mehānismi

Pozitīvās atlases skrīningos piemēro selektīvu spiedienu, kas iznīcina lielāko daļu šūnu, bagātinot sgRNA, kas nodrošina izdzīvošanu vai rezistenci. Zāļu rezistences skrīningos ar bibliotēkas inficētās šūnas apstrādā ar terapijām, kuru koncentrācija nogalina nemodificētas šūnas. Izdzīvojušās šūnas tiek bagātinātas ar sgRNA, kas izjauc zāļu mērķus, aktivizē rezistences ceļus vai bloķē proapoptozes signālus. Šo gēnu identificēšana atklāj zāļu darbības mehānismus un potenciālos rezistences mehānismus, kas varētu parādīties klīniskajā praksē.

Toksīnu rezistences ekrāni identificē gēnus, kas nepieciešami toksīnu uzņemšanai, aktivācijai vai citotoksicitātei. Piemēram, skrīningā ar difterijas toksīnu tiek atlasītas sgRNA, kas vērstas pret toksīna receptoru un membrānas transportēšanas komponentiem, kuri nepieciešami toksīna iekļūšanai. Veicot patogēnu uzņēmības skrīningus, šūnas tiek pakļautas vīrusu vai baktēriju toksīnu iedarbībai, identificējot saimnieka faktorus, kas ir būtiski infekcijai. Šajos ekrānos ir kartēts patogēnu izmantotais šūnu mehānisms, atklājot potenciālos terapeitiskos mērķus, lai bloķētu infekciju.

Izaugsmes faktoru neatkarības ekrāni kultivē šūnas ar samazinātu seruma daudzumu vai specifisku augšanas faktoru atcelšanu, identificējot gēnus, kas, ja tie tiek izjaukti, nodrošina no augšanas faktoriem neatkarīgu proliferāciju. Šie trāpījumi bieži vien ir audzēju supresori vai negatīvi augšanas signalizācijas ceļu regulatori. Izpratne par ceļiem, kas nodrošina neatkarību no augšanas faktoriem, izgaismo vēža progresēšanas mehānismus un identificē potenciālos mērķus kombinētām terapijām, kas novērš rezistences rašanos.

Uz FACS balstīti CRISPR skrīningi

Ar fluorescenci aktivizēta šūnu šķirošana ļauj meklēt gēnus, kas regulē jebkuru fluorescences mērāmu fenotipu. Šūnas, kas ekspresē fluorescējošu reportieri, kontrolējot interesējošo ceļu, tiek transducētas ar sgRNA bibliotēkām un pēc tam šķirotas, pamatojoties uz reportiera ekspresiju. Šūnas ar augstu vai zemu reportiera ekspresiju savāc atsevišķi, un sgRNA daudzumu populācijās salīdzina. Ar bagātināto sgRNA identificē pozitīvos regulatorus (kas ir bagātināti populācijā ar zemu ekspresiju, ja tie ir izstumti) un negatīvos regulatorus (kas ir bagātināti populācijā ar augstu ekspresiju, ja tie ir izjaukti).

Virsmas marķieru ekrāni šķiro šūnas, pamatojoties uz šūnu virsmas olbaltumvielu antivielu krāsojumu. Šādi skrīni identificē antigēnu prezentācijas, imūnsistēmas kontrolpunktu ligandu vai adhēzijas molekulu regulatorus. Imūnterapijas izstrādē uz FACS balstītie ekrāni ir identificējuši gēnus, kas kontrolē PD-L1 ekspresiju, atklājot mērķtiecīgus ceļus, kas varētu uzlabot imūnterapijas atbildes reakciju. Iespēja šķirot, pamatojoties uz endogēnu proteīnu ekspresiju, nevis uz inženierijas reportieriem, paplašina skrīninga darbības jomu, iekļaujot jebkuru proteīnu ar piemērotām antivielām.

Daudzparametru FACS ļauj veikt sarežģītu fenotipisko diskrimināciju. Vienlaikus mērot vairākus marķierus, var identificēt gēnus, kas īpaši ietekmē noteiktas šūnu populācijas vai stāvokļus. Piemēram, šķirošana pēc izmēra un granulometriskuma apvienojumā ar dzīvotspējas krāsvielām ļauj atšķirt apoptotiskas šūnas no veselām, tādējādi meklējot apoptozes regulatorus. Galvenais ierobežojums joprojām ir caurlaides spēja - uz FACS balstītiem ekrāniem nepieciešams lielāks šūnu skaits nekā vienkāršām izdzīvošanas atlasēm, un ir praktiski ierobežojumi attiecībā uz to, cik daudz šūnu var šķirot, kas var ierobežot bibliotēkas lielumu vai pārstāvību.

Uz attēliem balstīti CRISPR skrīningi

Automatizēta mikroskopija apvienojumā ar attēlu analīzi ļauj veikt morfoloģisko fenotipu skrīningus, kas nav pieejami ar FACS. Šūnas, kas inficētas ar sakārtotām sgRNA bibliotēkām (viens vai daži vadītāji iedobē), tiek fiksētas un attēlotas, iegūstot simtiem morfoloģisko pazīmju no katras šūnas. Mašīnmācīšanās klasificē fenotipus, identificējot vadus, kas rada raksturīgas morfoloģiskas izmaiņas. Atšķirībā no kopējiem skrīningiem, matricas formātos tiek saglabāts traucējumu telpiskais nošķīrums, kas ļauj veikt uz mikroskopiju balstītus nolasījumus.

Organellu morfoloģijas ekrāni identificē gēnus, kas regulē mitohondriālos tīklus, Golgi struktūru, kodola morfoloģiju vai citoskeleta organizāciju. Šie ekrāni ir atklājuši kvalitātes kontroles mehānismus, kas uztur organellu funkcijas, un identificējuši gēnus, kas koordinē organellu dinamiku ar šūnu cikla progresēšanu. Uz attēliem balstītajā skrīningā var identificēt citos rādītājos nemanāmus fenotipus, kas nav saskatāmi citos rādītājos, izmantojot Cytion šūnu līnijas ar labi raksturotu morfoloģiju.

Dzīvās šūnas attēlveidošanas skrīningos var izsekot tādus dinamiskus procesus kā šūnu dalīšanās, migrācija vai kalcija signalizācija laika gaitā. Ar izkliedētu izkropļoto šūnu attēlveidošana laikā atklāj gēnus, kas kontrolē dalīšanās laiku, mitotiskās vārpstas orientāciju vai migrācijas ātrumu un virzienu. Attēlveidošanas datu bagātība ir saistīta ar caurlaides spēju - ar masīviem ekrāniem pārbauda mazāk traucējumu nekā ar kopējiem ekrāniem, lai gan mērķtiecīgas bibliotēkas, kas vērstas uz konkrētām gēnu ģimenēm, līdzsvaro pārklājumu ar praktiskiem ierobežojumiem.

Analīze un trāpījumu apstiprināšana

Pēc atlases un paraugu savākšanas tiek ekstrahēta genomiskā DNS un sgRNA reģions tiek amplificēts ar PCR, izmantojot praimerus, tostarp sekvenēšanas adapterus. Dziļā sekvenēšana kvantitatīvi nosaka katras sgRNA daudzumu, ģenerējot nolasījumu skaitu, salīdzinot eksperimentālos un kontroles paraugus. Tādi skaitļošanas rīki kā MAGeCK, BAGEL vai JACKS statistiski novērtē bagātināšanu vai noplicināšanu, ņemot vērā daudzkārtēju hipotēžu pārbaudi tūkstošiem gēnu.

Augstas ticamības trāpījumi uzrāda konsekventu ietekmi uz vairākiem neatkarīgiem sgRNA, kas mērķētas uz vienu un to pašu gēnu. Gēni, kuros tikai viens vai divi vadītāji uzrāda ietekmi, visticamāk, ir artefakti, kas nav saistīti ar mērķi, nevis īsti trāpījumi. Statistiskās metodes apkopo pierādījumus par visiem gēnu vadītājiem, tādējādi palielinot patieso pozitīvo rezultātu atklāšanas spēju un vienlaikus samazinot atsevišķu vadītāju netarķētu mērķu viltus atklājumus. Kontroles vadlīnijas, kas vērstas uz zināmiem būtiskiem gēniem vai kontrolgēniem, kuri nav mērķgēni, apstiprina ekrāna veiktspēju un kalibrē statistiskos sliekšņus.

Validācijas eksperimenti apstiprina ekrāna trāpījumus, izmantojot neatkarīgas sgRNA vai ortogonālas izslēgšanas metodes. Atsevišķas sgRNA tiek klonētas un pārbaudītas skrīninga šūnu līnijā un, ideālā gadījumā, papildu šūnu līnijās, lai novērtētu reproducējamību un vispārināmību. Glābšanas eksperimenti, atkārtoti ekspresējot mērķa gēnu no cDNA, kurā nav sgRNA mērķa sekvences, apstiprina mērķa iedarbību. Terapeitisko mērķu validācijai, pārbaudot trāpījumus dažādās ģenētiskās izcelsmes Cytion šūnu līnijās, tiek identificētas plaši piemērojamas un kontekstam specifiskas atkarības.

Varianti un uzlabotas skrīninga pieejas

CRISPRi un CRISPRa skrīningos izmanto katalītiski mirušo Cas9, kas savienots ar transkripcijas represoriem vai aktivatoriem, tādējādi nodrošinot atgriezenisku gēnu izslēgšanu vai aktivāciju, nevis pastāvīgu izslēgšanu. Šīs pieejas ļauj izvairīties no traucējumiem, ko rada pilnīga gēna zudums, modelē gēnu ekspresijas izmaiņas, nevis nulles mutācijas, un ļauj pārbaudīt olbaltumvielas nekodējošus regulējošos elementus. Attiecībā uz būtiskiem gēniem, kuru izslēgšana izraisa letalitāti, CRISPRi daļēja izslēgšana var atklāt no devas atkarīgus fenotipus un terapeitiskos logus.

Bāzu redaktoru ekrāni ievieš precīzas punktu mutācijas, nevis iestarpinājumus/izdalījumus, ļaujot sistemātiski mutagenēt olbaltumvielu domēnus vai regulējošos elementus. Primārās rediģēšanas ekrāni sola vēl lielāku precizitāti, ieviešot vai labojot specifiskas mutācijas. Šie nākamās paaudzes ekrāni ļaus sistemātiski šķetināt olbaltumvielu struktūras un funkcijas sakarības un veikt ar slimībām saistītu variantu pētījumus.

Kombinatoriskie ekrāni, izmantojot dubultās sgRNA bibliotēkas, sistemātiski pārbauda gēnu pārus, identificējot ģenētiskās mijiedarbības, tostarp sintētisko letalitāti, supresiju un epistāzi. Lai gan tas ir tehniski sarežģīti, jo bibliotēku sarežģītība palielinās faktoriāli, kombinatoriskie ekrāni kartē ģenētiskos tīklus un identificē kombinētas terapeitiskās stratēģijas. Mērķtiecīgi kombinatoriālie ekrāni, kas vērsti uz ārstējamu gēnu pāriem, atklāj kombinētas terapijas, kas varētu novērst rezistenci vai uzlabot efektivitāti salīdzinājumā ar viena preparāta terapiju.

Pielietojumi zāļu atklāšanā un izstrādē

CRISPR ekrāni paātrina mērķa identificēšanu, sistemātiski pārbaudot, kuru gēnu darbības traucējumi rada vēlamos terapeitiskos fenotipus. Vēža atkarības ekrāni identificē gēnus, kas ir īpaši svarīgi vēža šūnās un ir potenciāli terapeitiskie mērķi. Skrīningi ar pacientu iegūtām šūnām vai izogēno šūnu līniju paneļiem stratificē mērķus pēc ģenētiskā konteksta, ļaujot izmantot precīzijas medicīnas pieejas, pielāgojot terapiju pacienta biomarķieriem.

Savienojumu ar nezināmiem mērķiem iedarbības mehānisma pētījumos izmanto CRISPR ekrānus, lai identificētu gēnus, kas nosaka rezistenci vai jutību. Ja konkrēta gēna darbības pārtraukšana izraisa rezistenci pret savienojumu, šis gēns, iespējams, kodē zāļu darbībai būtisku mērķa vai ceļa komponentu. Ar šo pieeju ir noskaidroti gan jau zināmu, gan jaunu terapeitisko līdzekļu mehānismi, paātrinot klīnisko izstrādi un nosakot biomarķierus pacientu atlasei.

Rezistences mehānismu prognozēšanas skrīninga laikā CRISPR skrīninga laikā šūnas tiek apstrādātas ar subletālām zāļu devām, identificējot gēnus, kas, izjaukti, rada rezistenci. Šie gēni ir potenciālie mehānismi, ar kuru palīdzību audzēji var izvairīties no terapijas, ļaujot izstrādāt kombinētas stratēģijas, kas bloķē rezistences ceļus. Citona šūnu līnijām, kas modelē dažādus vēža veidus, rezistences skrīnings palīdz izstrādāt klīnisko izmēģinājumu plānu un pacientu uzraudzības stratēģijas.

Izaicinājumi un labākā prakse

Neskatoties uz uzlabotajiem sgRNA izstrādes algoritmiem, joprojām pastāv bažas par blakussaskares efektiem. Dažas vadlīnijas šķeļ neplānotas genoma vietas, kuru sekvence ir līdzīga mērķim, potenciāli izraisot fenotipus, kas nav saistīti ar paredzēto gēnu izjaukšanu. Šo problēmu mazina vairāku neatkarīgu vadlīniju izmantošana katram gēnam un statistiskā apkopošana starp vadlīnijām. Labāko trāpījumu apstiprināšana ar ortogonālām metodēm apstiprina ietekmi uz mērķi.

Nepilnīga vai novēlota kinetika var ietekmēt ekrāna rezultātus. Dažas sgRNA sagriež neefektīvi, radot daļēju, nevis pilnīgu nokautēšanu. Proteīnu stabilitāte nozīmē, ka, lai iznīdētu DNS/RNS līmenī, nepieciešams laiks, lai esošais proteīns sadalītos, pirms parādās fenotipi. Skrīningi pēc atlases jāveic pietiekami ilgi, lai proteīns pilnībā izzustu, parasti 7-14 dienas atkarībā no mērķa proteīna pussabrukšanas laika un šūnu dubultošanās laika.

Ekrāna kvalitātes kontrole ietver bibliotēkas pārstāvības uzraudzību, Cas9 aktivitātes apstiprināšanu un kontrolvadītāju paredzamās uzvedības apstiprināšanu. Sākotnējo populāciju sekvencēšana apstiprina bibliotēkas sarežģītību un pārstāvību. Vadlīnijām, kas vērstas uz zināmiem būtiskiem gēniem, negatīvās atlases skrīningos vajadzētu uzrādīt spēcīgu izsmelšanu, bet kontrolgrupām, kas nav vērstas uz gēniem, nevajadzētu būtiski mainīties. Novirzes no paredzamās kontroles uzvedības norāda uz tehniskām problēmām, kas pirms eksperimenta rezultātu interpretēšanas jānovērš.

Turpmākie virzieni un paplašināti lietojumi

Perturb-seq apvieno CRISPR skrīningu ar vienas šūnas RNS sekvenēšanu, vienlaicīgi profilējot transkriptomu reakcijas uz tūkstošiem ģenētisko traucējumu. Šī pieeja parāda, kā gēnu traucējumi izplatās molekulārajos tīklos, atklājot regulatīvās attiecības un ceļu arhitektūru. Cytion šūnu līnijām Perturb-seq datu kopas nodrošina visaptverošu funkcionālo raksturojumu, papildinot tradicionālās skrīninga pieejas.

In vivo CRISPR skrīnings paplašina apvienoto skrīningu uz dzīvnieku modeļiem, identificējot gēnus, kas kontrolē audzēja augšanu, metastāzes vai imūnterapijas atbildes reakciju fizioloģiski būtiskos kontekstos. Ar bibliotēku inficētās šūnas tiek implantētas pelēm, un audzēji tiek ievākti sgRNA kvantitatīvai noteikšanai. Augošos audzējos bagātināti gēni ir in vivo piemērotības noteicošie faktori, kas, iespējams, netika pamanīti šūnu kultūru ekrānos. Šīs pieejas veido saikni starp šūnu līniju pētījumiem un klīnisko pielietojumu.

Cytion un šūnu kultūru kopienai CRISPR skrīnings ir pārveidojis šūnu līnijas no pasīviem eksperimentāliem modeļiem par aktīviem atklājumu dzinējspēkiem. Sistemātiskā funkcionālā izmeklēšana, ko nodrošina genoma skrīnings, turpina atklāt fundamentālas bioloģijas un terapeitiskās iespējas, nostiprinot kultivētās šūnas kā neaizstājamu instrumentu mūsdienu bioloģiskajos pētījumos un zāļu izstrādē.