Bioprinting ar šūnu līnijām: No 2D līdz 3D drukātām audu konstrukcijām

Trīsdimensiju bioprintings ir revolucionāra tehnoloģija, kas ļauj precīzi telpiski uzklāt dzīvas šūnas, biomateriālus un bioaktīvas molekulas, lai izgatavotu audu konstrukcijas ar noteiktu arhitektūru, kas atdarina dabisko audu organizāciju. Uzņēmumā Cytion mēs apzināmies, ka izveidotas šūnu līnijas piedāvā būtiskas priekšrocības bioprintēšanas lietojumiem salīdzinājumā ar primārajām šūnām, tostarp neierobežotu paplašināšanas spēju, labi raksturotu uzvedību, nemainīgu kvalitāti un mazākus ētiskos ierobežojumus. Pārejai no tradicionālās divdimensiju monoslāņa kultūras uz trīsdimensiju bioprintotām konstrukcijām, izmantojot šūnas un šūnu līnijas, ir rūpīgi jāapsver bioloģiskās krāsas formulējums, drukāšanas metodoloģija, šūnu reakcija uz mehānisko stresu deponēšanas laikā un nogatavināšanas protokoli pēc drukāšanas. Šī modernā ražošanas pieeja ļauj izgatavot sarežģītus audu modeļus zāļu skrīningam, slimību modelēšanai un fundamentāliem bioloģiskiem pētījumiem ar vēl nebijušu šūnu sastāva, telpiskās organizācijas un mikroarhitektūras īpašību kontroli.

Biointrikulācijas formulējums un reoloģiskās īpašības

Bioinku sastāvs ir vissvarīgākais faktors, kas nosaka biospiešanas panākumus, un tam nepieciešams rūpīgs līdzsvars starp drukas īpašībām, šūnu saderību un strukturālo integritāti pēc drukāšanas. Ideālām biosintētiskajām sveķiem piemīt bīdes retināšanas īpašības, kad izspiešanas laikā viskozitāte samazinās pie piemērotas bīdes spriedzes, bet pēc nogulsnēšanas strauji atjaunojas, lai saglabātu drukātās struktūras uzticamību. Viskozitāte parasti svārstās no 30 līdz 6 × 10⁷ mPa-s atkarībā no drukāšanas metodikas, turklāt uz ekstrūziju balstītām sistēmām formas saglabāšanai nepieciešama lielāka viskozitāte (≥ 1000 mPa-s), salīdzinot ar tintes strūklas metodēm, kurām nepieciešama zema viskozitāte (3-12 mPa-s), lai veidotos pilieni. Šūnu koncentrācija bioinkos parasti svārstās no 1 × 10⁶ līdz 2 × 10⁷ šūnu mililitrā, līdzsvarojot pietiekamu šūnu blīvumu audu veidošanai un iespējamu drukas sprauslu aizsērēšanu un pārmērīgu materiāla viskozitāti. Parastie bioloģiskās krāsas bāzes materiāli ir algināts, želatīns, želatīna metakrilāts (GelMA), hialuronskābe un agaroze, kas bieži tiek kombinēti daudzkomponentu sastāvos, lai optimizētu mehāniskās īpašības, noārdīšanās kinētiku un bioloģisko aktivitāti. Sitisona šūnām un šūnu līnijām ir būtiski empīriski optimizēt biokrāsvielas sastāvu, lai pielāgotos šūnu tipam specifiskām adhēzijas prasībām un jutībai pret mehānisko stresu drukāšanas laikā.

Bioprintēšanas sistēmas uz ekstrūzijas bāzes

Bioprintinga uz ekstrūzijas bāzes ir visplašāk izplatītā tehnoloģija, jo iekārtas izmaksas ir salīdzinoši zemas, tā ir saderīga ar augstas viskozitātes bioinksiem un augstu šūnu blīvumu, kā arī ir mērogojama, lai izgatavotu centimetra mēroga konstrukcijas. Šajās sistēmās caur cilindriskām sprauslām, kuru diametrs ir no 100 līdz 500 mikrometriem, tiek izkliedēti nepārtraukti ar šūnām pildīta materiāla pavedieni, un izkliedēšana tiek kontrolēta ar pneimatisko spiedienu, mehānisku skrūves virzienu vai virzuļa piedziņu. Galvenā problēma ir šļirces spriegums, ko šūnas izspiešanas laikā izjūt sprauslā, un tā lielums ir atkarīgs no sprauslas diametra, pielietotā spiediena un bioloģiskās krāsas viskozitātes saskaņā ar šķidruma mehānikas principiem. Šļirces sprieguma maksimums šļirces spriegumu šūnas izjūt pie sprauslas sieniņas, kas var izraisīt membrānas bojājumus, samazināt dzīvotspēju un mainīt gēnu ekspresijas profilus, ja tas ir pārmērīgs. Optimizācijai nepieciešams sabalansēt sprauslas diametru un ekstrūzijas spiedienu, lai sasniegtu vēlamo izšķirtspēju, vienlaikus saglabājot šūnu dzīvotspēju parasti virs 80 %. Vairāku materiālu bioprintēšanas iespējas ļauj vienlaicīgi vai secīgi nogulsnēt dažādus šūnu tipus un materiālus, atvieglojot heterogēnu audu konstrukciju ar telpiski noteiktu sastāvu izgatavošanu. Koaksiālās sprauslu konfigurācijas ļauj tieši drukāt dobas cauruļveida struktūras, kas ir noderīgas vaskularizācijai, un pēc tam noņemt serdes materiālu, lai izveidotu ar endotēlija šūnām izklātus patentu lūmenus.

Tintes strūklas un pilienveida bioprintēšana

Tintes strūklas bioprintinga tehnoloģijas, kas pielāgotas no komerciālajām dokumentu drukāšanas sistēmām, ļauj precīzi nogulsnēt pikolitru tilpuma pilienus, kas satur šūnas, piedāvājot augstas izšķirtspējas telpisko modelēšanu un lielu drukāšanas ātrumu, kas piemērots augstas veiktspējas lietojumiem. Termiskās tintes strūklas sistēmas rada tvaika burbuļus, izmantojot rezistīvos sildelementus, radot spiediena impulsus, kas izmet pilienus no drukas galviņas, savukārt pjezoelektriskās sistēmas izmanto sprieguma izraisītu pjezoelektrisko kristālu deformāciju, lai radītu akustiskos viļņus, kas virza pilienus. Bažas par šūnu dzīvotspēju sākotnēji ierobežoja termisku tintes strūklu metožu ieviešanu īslaicīgas temperatūras paaugstināšanās dēļ, taču optimizētās sistēmas demonstrē minimālus termiskus bojājumus, ja temperatūra tiek uzturēta zem kritiskajām robežvērtībām un iedarbības ilgums ir ierobežots līdz mikrosekundēm. Pjezoelektriskās sistēmas ļauj izvairīties no termiskās spriedzes, bet prasa rūpīgu akustisko parametru noregulēšanu, lai līdzsvarotu pilienu veidošanās uzticamību un šūnu mehānisko spriedzi. Lai varētu veidot pilienus, tintes strūklas sistēmās biokrāsvielas viskozitāte nedrīkst pārsniegt aptuveni 12 mPa-s, kas ierobežo materiālu izvēles iespējas salīdzinājumā ar ekstrūzijas metodēm un parasti prasa pēc nogulsnēšanas veikt šķērssaiti, lai panāktu struktūras stabilitāti. Tintes strūklas bioprintēšanas lielā precizitāte un caurlaidspēja padara to īpaši piemērotu lietojumiem, kuros nepieciešami noteiktu telpisku modeļu veidošana vairākiem šūnu tipiem, piemēram, kopkultūru modeļiem vai gradientu veidošanai zāļu skrīningam, izmantojot HeLa šūnas un citas noteiktas šūnu līnijas.

Lāzera atbalstīta bioprintēšana un augstas izšķirtspējas modelēšana

Ar lāzera palīdzību veiktā bioprintēšana (LAB), ko dēvē arī par lāzera inducētu tiešo pārnesi, nodrošina visaugstāko telpisko izšķirtspēju starp bioprintēšanas tehnoloģijām, ļaujot nogulsnēt atsevišķas šūnas vai nelielas šūnu grupas ar mikrometra mēroga precizitāti. LAB sistēma sastāv no impulsa lāzera avota, donora priekšmetstikliņa, kas pārklāts ar enerģiju absorbējošu materiālu un šūnu saturošu bioloģisko krāsu, un uztvērēja substrāta, kas novietots tuvu zem donora priekšmetstikliņa. Fokusēti lāzera impulsi iztvaicē enerģiju absorbējošo slāni, radot augsta spiediena burbulīšus, kas ar precīzu telpisko kontroli virza šūnas saturošus pilienus no donora priekšmetstikliņa uz uztvērēja substrāta. Izmantojot optimizētus parametrus, var panākt 10-50 mikrometru izšķirtspēju un šūnu dzīvotspēju, kas pārsniedz 95 %, ievērojami pārspējot citus bioprintēšanas veidus. LAB bezsprauslas raksturs novērš bīdes spriegumu, kas saistīts ar ekstrūziju, un novērš aizsērēšanas problēmas, kas traucē uz sprauslām balstītām sistēmām, drukājot augstas viskozitātes vai liela blīvuma šūnu suspensijas. Tomēr LAB sistēmām nepieciešams sarežģīts optiskais aprīkojums un rūpīga lāzera parametru, tostarp viļņa garuma, impulsa ilguma, enerģijas blīvuma un fokusa punkta lieluma, optimizācija, lai sabalansētu drukāšanas uzticamību un šūnu dzīvotspēju. Iespēja drukāt šūnas ar vienas šūnas izšķirtspēju padara LAB īpaši vērtīgu lietojumiem, kam nepieciešama precīza telpiska organizācija, piemēram, neironu un glijas kopkultūru vai šūnu un šūnu signālu izpētei noteiktā attālumā.

Stereolitogrāfija un digitālā gaismas apstrāde

Stereolitogrāfijas (SLA) un digitālās gaismas apstrādes (DLP) bioprintā izmanto šūnu fotokrossa-sasaistāmu hidrogēlu fotopolimerizāciju pa slāņiem, lai ātri izgatavotu sarežģītas trīsdimensiju ģeometrijas ar 25-100 mikrometru izšķirtspēju. Atšķirībā no uz uzklāšanu balstītām metodēm, kas veido struktūras, secīgi izvietojot materiālus, uz gaismu balstītās metodes vienlaicīgi šķērssaista veselus slāņus, ievērojami samazinot sarežģītu ģeometriju izgatavošanas laiku. DLP sistēmas projicē gaismas modeļus, kas atbilst veseliem slāņu šķērsgriezumiem, izmantojot digitālo mikrospoguļu masīvus, savukārt SLA sistēmas skenē fokusētus lāzera starus, lai izsekotu slāņu modeļus, un DLP parasti nodrošina lielāku drukas ātrumu. Fotosasasaistāmie bioinhinkli satur fotoiniciatorus, kas, iedarbojoties gaismai, rada reaktīvas vielas, izraisot hidrogēla prekursoru, piemēram, želatīna metakrilāta, polietilēnglikola diacrilāta vai hialuronskābes metakrilāta, polimerizāciju vai šķērssaišu veidošanos. Šūnu dzīvotspēja ir būtiski atkarīga no fotoiniciatora koncentrācijas, gaismas intensitātes un iedarbības ilguma, jo fotoiniciācijas laikā radušās reaktīvās skābekļa formas var bojāt šūnu komponentus. Optimizētās sistēmas nodrošina 75-95 % dzīvotspēju pēc drukāšanas, izmantojot ar šūnām saderīgus redzamās gaismas fotoiniciatorus (litija fenil-2,4,6-trimetil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinātu), zemas fotoiniciatoru koncentrācijas (0,05-0,5 %) un minimālu gaismas iedarbību. Spēja ātri izgatavot sarežģītus asinsvadu tīklus un sarežģītas audu arhitektūras padara SLA/DLP īpaši daudzsološu orgānu uz mikroshēmas lietojumiem un audu inženierijai, lai gan ir nepieciešami saderīgi fotokrossa-sasaistāmi materiāli un rūpīga fotopolimerizācijas kinētikas pārvaldība.

Nogatavināšana pēc drukāšanas un kultūru optimizācija

Bioprintotām konstrukcijām uzreiz pēc izgatavošanas parasti ir ierobežota šūnu un šūnu mijiedarbība, minimāla ekstracelulārā matriksa izgulsnēšanās un mehāniskās īpašības, kurās dominē biokrāsvielas materiāls, nevis bioloģisko audu īpašības. Pēc drukāšanas nogatavināšanas kultūra ir būtiska, lai nodrošinātu šūnu izplešanos no sākotnēji sfēriskās morfoloģijas, šūnu-šūnu savienojumu veidošanos, endogēnā ekstracelulārā matriksa sekrēciju un organizāciju, kā arī audu specifisko funkciju attīstību. Prasības attiecībā uz kultūru ilgumu svārstās no dažām dienām līdz nedēļām atkarībā no šūnu tipa, konstrukcijas sarežģītības un paredzētā pielietojuma, turklāt metaboliski aktīvām šūnām parasti nepieciešama biežāka barotnes apmaiņa, lai novērstu barības vielu izsīkšanu un metabolītu uzkrāšanos. Šūnu kultūru barotnes papildināšana ar audu specifiskiem augšanas faktoriem, hormoniem un citām bioaktīvām molekulām var paātrināt nobriešanu un uzlabot funkcionālās īpašības, lai gan konkrētas prasības ir atkarīgas no šūnu tipa un vēlamā fenotipa. Mehāniskā stimulācija, izmantojot perfūzijas plūsmu, ciklisku izstiepšanu vai saspiešanu, veicina audu nobriešanu un funkcionālo attīstību mehāniski jutīgiem šūnu tipiem, imitējot fizioloģiskās slodzes apstākļus. Bioloģiski noārdāmus komponentus saturošu bioinku gadījumā mehānisko īpašību attīstība laikā atspoguļo gan matricas noārdīšanos, gan šūnu izdalītā matriksa uzkrāšanos, tāpēc ir nepieciešams rūpīgs līdzsvars starp noārdīšanās kinētiku un matriksa nogulsnēšanās ātrumu. Nobriešanas uzraudzība, izmantojot morfoloģisko novērtējumu, gēnu ekspresijas analīzi un funkcionālos testus, ļauj optimizēt kultivēšanas apstākļus un noteikt piemērotus laika punktus eksperimentālai bioprintētu audu modeļu izpētei.

Pielietojums zāļu skrīningā un slimību modelēšanā

Bioprintēti audu konstruktīvi, kuros izmantotas noteiktas šūnu līnijas no Cytion kataloga, piedāvā spēcīgas platformas farmaceitisko savienojumu skrīningam un slimību modelēšanai ar uzlabotu fizioloģisko atbilstību salīdzinājumā ar tradicionālajām divdimensiju kultūrām. Spēja precīzi kontrolēt šūnu sastāvu, telpisko organizāciju un mikroarhitektūras iezīmes ļauj sistemātiski pētīt struktūras un funkcijas attiecības un radīt reproducējamus audu modeļus, kas piemēroti augstas veiktspējas skrīninga darba plūsmām. Ar audzēja šūnu līnijām, stromas fibroblastiem un endotēlija šūnām noteiktā telpiskajā izkārtojumā veidoti vēža modeļi labāk ataino audzēja mikrovides īpašības, tostarp hipoksiskos gradientus, neviendabīgu zāļu iekļūšanu un stromas un audzēja mijiedarbību, kas ietekmē terapeitisko atbildes reakciju. Aknu audu modeļiem, kuros ir hepatocītu šūnu līnijas definētās arhitektūrās, salīdzinājumā ar parastajām kultūrām ir vērojama lielāka citohroma P450 ekspresija un metabolisma funkcija, tādējādi uzlabojot prognozēšanas precizitāti hepatotoksicitātes skrīningam. Bioprintēti nervu audu modeļi ar precīzu neironu un glijas organizāciju ļauj pētīt neirodeģeneratīvo slimību mehānismus un veikt neiroprotektīvo savienojumu skrīningu. Bioprintinga reproducējamības priekšrocības salīdzinājumā ar manuāli radītām trīsdimensiju kultūrām atvieglo standartizāciju, kas ir būtiska regulatīvai pieņemšanai un integrācijai farmācijas izstrādes līnijās, lai gan, lai pārliecinātos par prognozēšanas spējām, joprojām ir svarīgi veikt validāciju, salīdzinot ar in vivo rezultātiem.