2. protokols: Saldētu šūnu līniju atdzīvināšana optimālai dzīvotspējai un augšanai
Lai saglabātu šūnu dzīvotspēju un sekmīgi veiktu eksperimentus, ir ļoti svarīgi pareizi atkausēt un reanimēt sasaldētas šūnu līnijas. Šajā visaptverošajā rokasgrāmatā ir izklāstītas būtiskākās darbības un apsvērumi, kas jāievēro, atdzīvinot kriokonservētas šūnas no Cytion šūnu līniju kolekcijas.
| Galvenie secinājumi | |
|---|---|
| ⏱️ Laiks | Būtiska ir ātra atkausēšana - pabeigt 1-2 minūšu laikā |
| ?️ Temperatūra | Atkausēšanas procesa laikā uzturēt 37 °C temperatūru |
| ⚠️ Kritiskie soļi | Minimizēt DMSO iedarbību virs 4°C |
| ✔️ Veiksmes faktori | Iepriekš uzsildīta barotne, pareiza atšķaidīšanas attiecība, sterila tehnika |
Nepieciešamais aprīkojums un materiāli
| Aprīkojums | Materiāli |
|---|---|
|
- Ūdens vanna (37°C) - Mikrobioloģiskais drošības skapis - Inkubators - Fāzes kontrasta mikroskops - Centrifūga - Hemocitometrs |
- Augšanas barotnes - 70% izopropanols - Iepriekš marķētas kolbas - Sterilas pipetes - Individuālie aizsardzības līdzekļi (sterili cimdi, laboratorijas mētelis, aizsarglīdzeklis) - PBS |
Drošības apsvērumi
Šūnu līniju reanimācijai ir rūpīgi jāievēro bioloģiskās drošības protokoli. Strādājot ar sasaldētām šūnu līnijām, jāapzinās, ka šķidrā slāpeklī uzglabātās ampulas, sasilstot, var eksplodēt slāpekļa iesprostojuma dēļ. Vienmēr rīkojieties ar sasaldētām ampulām, izmantojot atbilstošus individuālās aizsardzības līdzekļus, un atkausējiet tās sertificētā bioloģiskās drošības skapī.
Soli pa solim protokols
Rūpīgi izpildiet šos soļus, lai nodrošinātu optimālu šūnu reģenerāciju un dzīvotspēju.
1. Sagatavošana pirms atkausēšanas
- Pārbaudiet šūnu līnijas datu lapu, lai uzzinātu īpašās prasības
- Iepriekš uzsildiet piemērotu barotni līdz 37°C
- Kolbas marķējiet ar šūnu līnijas nosaukumu, pasāžas numuru un datumu
- Sagatavot sterilu bioloģiskās drošības kabinetu
2. Droša ampulu izņemšana
- Pārvietojiet sasaldētu ampulu no uzglabāšanas vietas ar šķidro slāpekli atbilstošā konteinerā
- Valkājiet aizsargsegu un izolētus cimdus
- Ampuli turiet ar spirtā samitrinātu salveti
- Atbrīvojiet vāciņu par ceturtdaļu apgrieziena (atbrīvojas iesprostotais N2), pēc tam atkal pievilciet vāciņu
3. Atkausēšanas process
- Ātri atkausē 37 °C ūdens peldē (1-2 minūtes)
- Saglabāt nelielu ledus kristālu klātbūtni
- Uzglabā vāciņu virs ūdens līmeņa
- Dezinficējiet ampulas ārpusi ar 70% spirtu
4. Šūnu pārvietošana
- Pārnest saturu uz sterilu mēģeni
- Lēnām pievienot 5 ml iepriekš uzsildītas barotnes
- Pēc izvēles: Pārbaudīt dzīvotspēju, izmantojot trypāna zilā izslēgšanu
- Pārnesiet uz baļļu ar kultūru ieteicamajā blīvumā
5. Aprūpe pēc atkausēšanas
Adhēzijas šūnām:
- Pielāgojiet barotnes tilpumu atkarībā no kolbas lieluma
- Pirmā barotnes nomaiņa likvidē krioprotektanta atlikumus
- Pēc 4-6 stundām pārbaudīt piestiprināšanos
Suspensijas šūnām:
- Centrifugēt pie 150 x g 5 minūtes
- Resuspendēt svaigā barotnē
- Uzturēt ieteicamo šūnu blīvumu
Problēmu novēršanas rokasgrāmata
| Jautājums | Risinājums |
|---|---|
| Zema dzīvotspēja | - Pārbaudiet atkausēšanas ātrumu - Pārbaudiet barotnes temperatūru - Nodrošināt pareizu kriokonservēšanas barotni |
| Slikta piestiprināšanās | - Apstipriniet virsmas pārklājuma prasības - Pārbaudiet izsējas blīvumu - Pārbaudiet barotnes papildinājumus |
| Piesārņojums | - Pārbaudiet, vai nav mikoplazmas - Pārbaudiet sterilo tehniku - Pārbaudīt barotnes/papildinājumus |
Kvalitātes kontroles soļi
- Šūnu pārbaude pēc 24 stundām
- Pārbaudiet, vai morfoloģija atbilst gaidītajām īpašībām
- Dokumentējiet reģenerācijas līmeni un dzīvotspēju
- Ja nepieciešams, veiciet autentifikācijas testus
Dokumentācijas prasības
| Reģistrēt | Informācija, kas jāiekļauj |
|---|---|
| Informācija par šūnu līniju | - Avots un kataloga numurs - Pārejas numurs - Atkausēšanas datums |
| Procesa dati | - Dzīvotspējas novērtējums - Barotnes sastāvs - Augšanas apstākļi |
| Kvalitātes pārbaudes | - Morfoloģijas novērojumi - Piesārņojuma stāvoklis - Augšanas ātrums |
Uzglabāšana un atsauces
Veiciet detalizētu reanimācijas procesa uzskaiti savā laboratorijas dienasgrāmatā. Iekļaujiet izmantoto barotņu un piedevu partijas numurus. Lai turpinātu optimālu šūnu augšanu, skatiet īpašās šūnu kultūru vadlīnijas.
Secinājums
Veiksmīga šūnu līniju reanimācija ir atkarīga no rūpīgas sagatavošanās, ātras izpildes un pareizas tehnikas. Šī protokola ievērošana nodrošina optimālu šūnu dzīvotspēju un eksperimenta atkārtojamību. Par īpašām šūnu līniju prasībām vienmēr skatiet analīzes sertifikātu.
Kritiski atgādinājumi
- Minimizēt DMSO iedarbības laiku
- Strādāt ātri, bet saglabāt sterilitāti
- Dokumentējiet visus soļus
- Pirmajās 24 stundās uzraugiet šūnu reģenerāciju