Первинні клітини людини

Що таке первинні клітини людини?

Первинні клітини - це найчистіша репрезентація відповідних тканин. Їх виділяють з тканини і обробляють так, щоб вони могли прижитися в культурі з ідеальними умовами. Вони більш точно імітують стан in vivo і демонструють нормальну фізіологію, оскільки вони отримані з тканини, а не модифіковані. Завдяки цьому вони можуть слугувати корисними моделями для досліджень клітинної фармакології, токсикології та фізіології (включаючи вивчення метаболізму, старіння та передачі сигналів). Майте на увазі, що первинні клітини складніше культивувати і підтримувати, ніж безперервну клітинну лінію, оскільки вони мають коротшу тривалість життя і перестають ділитися (або старіють) після певної кількості поділів. Дослідження сигнальних шляхів клітин ускладнюються мінливістю первинних клітин, отриманих від донорів, а також практикою субкультури. Перед початком вивчення сигнальних шляхів дослідники часто проводять скринінг, щоб визначити, чи реагують клітини на загальноприйняті стимули. Щоб уникнути марної трати часу і грошей, первинні клітини можна стимулювати для активації основних сигнальних шляхів ще до скринінгу.

Навіщо використовувати первинні клітини людини?

Імморталізовані клітинні лінії зазвичай використовуються в якості клітинного аналізу. Хоча вчені визнають, що біологічні зміни, спричинені клітинними лініями, можуть бути шкідливими для вивчення їх фізіологічного значення. Використання первинних клітин людини підвищує фізіологічну цінність даних, отриманих за допомогою клітинних культур, і вони все частіше розглядаються як важливі для вивчення біологічних процесів, перебігу захворювань і розробки ліків.

Первинні клітини людини широко використовуються в дослідженнях in vitro міжклітинної та внутрішньоклітинної комунікації, біології розвитку, механізмів, що лежать в основі раку, хвороби Паркінсона та діабету, серед багатьох інших доклінічних та дослідницьких біологічних досліджень. Дослідники вже давно використовують імморталізовані клітинні лінії для вивчення функцій тканин, однак клітинні лінії з очевидними мутаціями і хромосомними аномаліями не можуть бути добрими сурогатами нормальних клітин і розвитку хвороби на ранніх стадіях. Більш точну модель певного типу клітин тканини тепер можна отримати, використовуючи первинні клітини людини, виділені з цієї тканини і підтримувані в первинних поживних середовищах і добавках.

Що таке первинна культура клітин?

Замість того, щоб використовувати імморталізовані клітинні лінії, первинна культура клітин передбачає вирощування клітин безпосередньо з багатоклітинного організму поза організмом. У деяких країнах, наприклад, у Великобританії, існує юридичне визнання того факту, що первинні культури клітин є більш репрезентативними для тканин in vivo, ніж клітинні лінії. Тим не менш, первинні клітини потребують правильного субстрату і поживних речовин для росту, а після певної кількості поділів у них розвивається старечий фенотип, який змушує їх назавжди припинити ділитися. Ці два фактори мотивують створення клітинних ліній. Як природні безсмертні первинні клітини (наприклад, клітини HeLa), так і штучно безсмертні первинні клітини (наприклад, клітини HEK) можна культивувати в культурі клітин нескінченно довго.

Первинні клітини людини за типами тканин

Епітеліальні клітини, фібробласти, кератиноцити, меланоцити, ендотеліальні клітини, м'язові клітини, імунні клітини та стовбурові клітини, такі як мезенхімальні стовбурові клітини, є одними з найбільш часто використовуваних первинних клітин людини в наукових дослідженнях. Почнемо з того, що культури є гетерогенними (представляють собою суміш типів клітин, присутніх у тканині), і їх можна підтримувати живими in vitro лише протягом певного часу. Трансформація - це процес in vitro, який дозволяє маніпулювати первинними клітинами людини для отримання необмеженої кількості субкультур. Трансформація може відбуватися природним шляхом або бути індукована хімічними речовинами чи вірусами. Після генетичної трансформації первинна культура може ділитися необмежену кількість разів на безсмертну вторинну клітинну лінію, якщо їй надано достатньо поживних речовин і простору.

Ендотеліальні клітини

Лікування раку, загоєння ран, дослідження клітинних сигналів, високопродуктивний і висококонцентрований скринінг та токсикологічний скринінг - це лише деякі з областей, які можуть отримати вигоду від використання первинних ендотеліальних клітин в якості дослідницького інструменту.

Кератиноцити

Кератиноцити, отримані з епідермісу шкіри дорослої людини або крайньої плоті новонародженого, відіграють вирішальну роль у вивченні таких шкірних захворювань, як псоріаз і рак.

Епітеліальні клітини

Від досліджень раку до токсикологічних досліджень, первинні епітеліальні клітини виявилися безцінним ресурсом для моделювання природного захисту організму.

Фібробласти

Індукція плюрипотентних стовбурових клітин (iPS) та вивчення загоєння ран - це лише деякі з багатьох застосувань первинних фібробластів.

Імунні клітини

Мононуклеарні клітини периферичної крові, скорочено МСКК, - це мононуклеарні клітини крові з круглим ядром. В основному вони включають лімфоцити і моноцити, які виконують важливі функції в ході імунної відповіді. Мононуклеарні клітини периферичної крові часто використовуються для діагностики інфекцій або для виявлення можливого захисту від вакцинації. Розуміння клітинної імунної відповіді, опосередкованої Т-клітинами, часто має вирішальне значення.

Меланоцити

Меланоцити, спеціалізовані клітини шкіри, які виробляють пігмент меланін, є корисними моделями для дослідження таких тем, як загоєння ран, токсичність, меланома, реакція шкіри на ультрафіолетове (УФ) випромінювання, шкірні захворювання та косметика.

Стовбурові клітини

Стовбурові клітини мають потенціал диференціюватися в широкий спектр типів клітин. Завдяки своїй здатності до диференціювання вони надають нові можливості для моделювання людських тканин і станів здоров'я.

Мезенхімальні стовбурові клітини

Мезенхімальні стовбурові клітини, також відомі як МСК, можуть бути отримані з різних людських джерел, таких як кістковий мозок, жир (жирова тканина), тканина пуповини (желе Уортона) і амніотична рідина (рідина, що оточує плід), і можуть бути розмножені in vitro. Ці дорослі стромальні стовбурові клітини мають здатність розвиватися в найрізноманітніші типи клітин. Деякі з цих типів клітин включають кісткові, хрящові, м'язові, нервові, клітини шкіри та рогівки ока.

Гладком'язові клітини

У порожнистих органах первинні гладком'язові клітини (ГМК) вистилають внутрішню поверхню і забезпечують скоротливість. Окрім раку та інших захворювань, ГМК можна використовувати для моделювання гіпертонічного фіброзу.

Первинні клітини та клітинні лінії

Або шляхом спонтанної мутації, як у трансформованих ракових клітинних лініях, або шляхом навмисної зміни, як при штучному створенні генів раку, безперервні клітинні лінії отримали потенціал до нескінченного розмноження (безсмертя). Як правило, безперервні клітинні лінії більш надійні і зручні у роботі, ніж первинні клітини. Вони можуть необмежено розмножуватися і забезпечують швидкий доступ до необхідних даних. Використання безперервних клітинних ліній має певні обмеження, включаючи той факт, що вони генетично модифіковані/трансформовані, що може змінити фізіологічні особливості і не відповідати стану in vivo, і що це може ще більше змінитися з часом при значному пасажуванні.

Досягнення в культурі первинних клітин

Первинні клітини мають сумнозвісну репутацію складного матеріалу для роботи. Однак цей процес стає простішим, ніж будь-коли раніше, завдяки розвитку культури первинних клітин, доступності комерційних первинних клітин з повністю оптимізованими протоколами і новим методам аналізу, які вимагають менше вхідних даних.

Перехід від двовимірної до тривимірної культури клітин вважається головною віхою в цій галузі. Тканинно-специфічна архітектура, міжклітинні взаємодії та механічні/біохімічні сигнали можуть бути ослаблені в 2D-культурі. Таким чином, існує межа біологічної цінності цих культур.

З іншого боку, 3D-культура клітин дозволяє клітинам розширюватися і взаємодіяти з тривимірним позаклітинним каркасом. Це дозволяє клітинам взаємодіяти один з одним і позаклітинним матриксом, що робить 3D-культури більш фізіологічно релевантними. Точність прогнозування реакцій in vivo зробила цей метод революційним у таких галузях, як відкриття та розробка ліків. Завдяки цьому сучасні технології, такі як органоїди, отримані від пацієнтів, та органи-на-чіпі, забезпечують висококонтекстуальні моделі для скринінгу та розробки ліків.

Генерація первинних клітин є вузьким місцем у первинній культурі. Для його подолання зазвичай потрібен більший об'єм тканини, що може бути складно досягти. Однак покращення аналітичної чутливості відкриває шлях вперед. Наприклад, потреба у культивуванні великої кількості первинних клітин зменшується завдяки використанню одноклітинної технології, яка включає секвенування, вестерн-блоттинг і мас-цитометрію.

Багатообіцяючі перспективи первинної культури клітин

Загальні труднощі первинної культури клітин пом'якшуються завдяки технологічному прогресу. У свою чергу, цей метод швидко витісняє інші як золотий стандарт у вивченні та практиці клітинної та молекулярної біології. Виробництво вакцин, заміна органів, терапія стовбуровими клітинами, дослідження раку та багато іншого можуть отримати значну користь від постійного розвитку культури первинних клітин.

Поради та рекомендації щодо культури первинних клітин

Потреби клітинної експансії

Два найпоширеніші методи культивування первинних клітин - у суспензії або на поверхні (2D). Деякі клітини здатні вільно плавати в кровотоці, ніколи не прилипаючи до поверхні (наприклад, клітини, отримані з периферичної крові). Різні клітинні лінії були сконструйовані для процвітання в суспензійних культурах, де вони можуть досягати щільності, недосяжної в умовах 2D-зростання. Первинні клітини, які потребують закріплення для росту in vitro, називаються адгезивними клітинами і включають клітини, що знаходяться в твердих тканинах. Для покращення властивостей адгезії та передачі інших сигналів, необхідних для росту і диференціації, ці клітини зазвичай культивують у пласких пластикових посудинах без покриття, але іноді використовують мікроносії. Останній варіант може бути покритий позаклітинними матриксними білками (такими як колаген і ламінін). Середовище, що використовується для культивування клітин, складається з базового середовища, до якого додають відповідні фактори росту та цитокіни. Клітинний інкубатор - це спеціальний тип лабораторного інкубатора, який використовується для культивування і підтримки клітин при певній температурі і газовій суміші (зазвичай 37 °C, 5% CO2 для клітин ссавців). Залежно від типу клітин, що культивуються, оптимальні умови можуть дуже відрізнятися. Залежно від типу клітин, що вирощуються, оптимальне живильне середовище буде мати унікальну комбінацію факторів, включаючи, але не обмежуючись, рН, концентрацію глюкози, фактори росту та наявність інших поживних речовин.

Антибіотики в поживному середовищі мають вирішальне значення під час первинного культивування, щоб запобігти зараженню з тканин хазяїна. Деякі схеми антибіотиків включають комбінацію гентаміцину, пеніциліну, стрептоміцину та амфотерицину В. Однак не рекомендується використовувати антибіотики протягом тривалого періоду часу, оскільки деякі реагенти (наприклад, амфотерицин В) можуть бути токсичними для клітин у довготривалій перспективі.

Більшість первинних клітин старіють і припиняють ділитися після певної кількості подвоєнь популяції, тому дуже важливо підтримувати їхню життєздатність після ізоляції. Довготривала життєздатність клітин вимагає досконалої техніки культивування та ідеальних умов культивування (включаючи правильне середовище, правильну температуру, правильну газову суміш, правильний рівень рН, правильну концентрацію факторів росту, наявність поживних речовин і глюкози). Оскільки багато факторів росту, що використовуються для доповнення середовищ, отримують з крові тварин (інгредієнти, отримані з крові, мають потенціал забруднення), рекомендується мінімізувати їх використання або взагалі уникати. Також важливо використовувати асептичну техніку.

Субкультура та підтримка

Коли ізольовані клітини прилипають до поверхні культурального посуду, це знаменує початок фази підтримання. Прикріплення зазвичай відбувається через 24 години після початку культивування. Клітини слід субкультивувати, коли вони досягли певного відсотка злиття і активно реплікуються. Оскільки постконфлюентні клітини можуть піддаватися диференціації і демонструвати повільнішу проліферацію після пасажу, найкраще субкультивувати первинні культури клітин до того, як вони досягнуть 100% злиття.

Субкультивування у свіжому середовищі підтримує експоненціальний ріст анкоридж-залежних клітин. Субкультивування моношарів порушує між- і внутрішньоклітинні взаємодії між клітинами та поверхнею. Низькі концентрації протеолітичних ферментів, таких як трипсин/ЕДТА, використовуються для екстракції прилиплих первинних клітин з моношарів або тканин. Після відокремлення і розведення в одноклітинному розчині клітини підраховують і переносять у свіжі культуральне середовище для повторного прикріплення і розмноження.

Кріоконсервування та відновлення

Кріоконсервування зберігає живі клітини шляхом заморожування їх при низьких температурах. Кріоконсервування та розморожування первинних клітин людини запобігає загибелі та пошкодженню клітин під час зберігання та використання. Первинні клітини людини кріозахищені за допомогою ДМСО або гліцерину (при правильній температурі і з контрольованою швидкістю заморожування). Процес заморожування повинен бути поступовим, при -1 °C щохвилини, щоб запобігти утворенню кристалів льоду. Для тривалого зберігання потрібен рідкий азот (-196 °C) або температура нижче -130 °C.

Для розморожування заморожених клітин достатньо занурити їх у водяну баню з температурою 37 °C приблизно на 1-2 хвилини. Первинні клітини людини не слід центрифугувати після розморожування з морозильної камери (оскільки вони надзвичайно чутливі до пошкоджень під час відновлення після кріоконсервування). Це підходить для перещеплення клітин відразу після розморожування і сприяє прикріпленню в культурі протягом перших 24 годин після перещеплення. 1 Після того, як кріоконсервовані первинні клітини прикріпляться, відпрацьоване середовище необхідно видалити (оскільки ДМСО є шкідливим для первинних клітин і може спричинити падіння життєздатності після відтавання).