Первинні клітини людини

Що таке первинні клітини людини?

Первинні клітини є найчистішим проявом відповідних тканин. Їх виділяють із тканини та обробляють таким чином, щоб вони могли прижитися в культуральних умовах з ідеальними параметрами. Вони точніше імітують стан in vivo та демонструють нормальну фізіологію, оскільки походять безпосередньо з тканини, а не є модифікованими. Завдяки цьому вони можуть слугувати корисними моделями для досліджень у галузі клітинної фармакології, токсикології та фізіології (включно з дослідженнями метаболізму, старіння та передачі сигналів). Слід пам’ятати, що культивування та підтримка первинних клітин є складнішими, ніж у випадку безперервних клітинних ліній, оскільки вони мають коротший термін життя і припиняють ділитися (або старіють) після певної кількості клітинних поділів. Дослідження сигнальних шляхів ускладнюються властивою первинним клітинам мінливістю, зумовленою їхнім походженням від донорів та процесами субкультури. Перед початком досліджень сигнальних шляхів науковці часто проводять скринінг, щоб визначити, чи реагують клітини на загальновживані стимули. Щоб уникнути марнування часу та коштів, первинні клітини можна стимулювати для активації основних сигнальних шляхів ще до проведення скринінгу.

Чому використовують первинні клітини людини?

Імморталізовані клітинні лінії зазвичай використовуються як матеріал для клітинних аналізів. Хоча вчені визнають, що біологічні зміни, зумовлені використанням клітинних ліній, можуть негативно впливати на вивчення їхнього фізіологічного значення. Використання первинних клітин людини підвищує фізіологічну цінність даних, отриманих за допомогою клітинних культур, і їх дедалі частіше вважають важливими для вивчення біологічних процесів, перебігу захворювань та розробки лікарських засобів.

Первинні клітини людини широко використовуються в дослідженнях in vitro міжклітинної та внутрішньоклітинної комунікації, біології розвитку, а також механізмів, що лежать в основі раку, хвороби Паркінсона та діабету, серед багатьох інших доклінічних та дослідницьких напрямків біологічних досліджень. Довгий час дослідники використовували імморталізовані клітинні лінії для вивчення функцій тканин; однак клітинні лінії з очевидними мутаціями та хромосомними аномаліями можуть не бути адекватними замінниками нормальних клітин та розвитку захворювання на його ранніх стадіях. Наразі можна створити більш точну модель конкретного типу клітин тканини, використовуючи первинні клітини людини, виділені з цієї тканини та культивовані в середовищах та добавках для первинних клітинних культур.

Що таке первинна клітинна культура?

На відміну від використання безсмертних клітинних ліній, первинна клітинна культура передбачає вирощування клітин безпосередньо з багатоклітинного організму поза межами тіла. У деяких країнах, таких як Велика Британія, юридично визнано, що первинні клітинні культури є більш репрезентативними для тканин in vivo, ніж клітинні лінії. Проте первинні клітини потребують відповідного субстрату та поживних речовин для росту, і після певної кількості поділів у них розвивається фенотип старіння, що призводить до остаточного припинення поділу. Ці два фактори зумовлюють створення клітинних ліній. Як природно імунізовані первинні клітини (наприклад, клітини HeLa), так і штучно імунізовані первинні клітини (наприклад, клітини HEK) можуть культивуватися в клітинній культурі необмежений час.

Первинні клітини людини за типами тканин

Епітеліальні клітини, фібробласти, кератиноцити, меланоцити, ендотеліальні клітини, м’язові клітини, імунні клітини та стовбурові клітини, такі як мезенхімальні стовбурові клітини, належать до найпоширеніших первинних клітин людини, що використовуються в наукових дослідженнях. Спочатку культури є гетерогенними (представляють суміш типів клітин, присутніх у тканині) і можуть підтримуватися живими in vitro лише протягом певного часу. Трансформація — це процес in vitro, який дозволяє маніпулювати первинними клітинами людини для отримання необмеженої кількості субкультур. Трансформація може відбуватися природним шляхом або бути індукована хімічними речовинами чи вірусами. Після генетичної трансформації первинна культура може безкінечно ділитися, утворюючи безсмертну вторинну клітинну лінію, за умови наявності достатньої кількості поживних речовин та простору.

Ендотеліальні клітини

Лікування раку, загоєння ран, дослідження клітинної сигналізації, високопродуктивний та високоінформативний скринінг, а також токсикологічний скринінг — це лише деякі з областей, які можуть отримати користь від використання первинних ендотеліальних клітин як дослідницького інструменту.

Кератиноцити

Кератиноцити, отримані з епідермісу шкіри дорослої людини або з передньої шкірки новонародженого, відіграють вирішальну роль у вивченні шкірних захворювань, таких як псоріаз та рак.

Епітеліальні клітини

Від досліджень раку до токсикологічних досліджень первинні епітеліальні клітини виявилися безцінним ресурсом для моделювання природних захисних механізмів організму.

Фібробласти

Індуковані плюрипотентні стовбурові клітини (iPS) та дослідження процесу загоєння ран — це лише деякі з численних застосувань первинних фібробластів.

Імунні клітини

Мононуклеарні клітини периферичної крові, скорочено PBMC, — це мононуклеарні клітини крові з круглим ядром. До них належать переважно лімфоцити та моноцити, які виконують важливі функції під час імунної відповіді. Мононуклеарні клітини периферичної крові часто використовують для діагностики інфекцій або для визначення можливого імунного захисту після вакцинації. Розуміння клітинної імунної реакції, опосередкованої Т-клітинами, часто має вирішальне значення.

Меланоцити

Меланоцити — спеціалізовані клітини шкіри, що виробляють пігмент меланін, — є корисними моделями для досліджень у таких сферах, як загоєння ран, токсичність, меланома, реакція шкіри на ультрафіолетове (УФ) випромінювання, шкірні захворювання та косметика.

Стовбурові клітини

Стовбурові клітини мають потенціал до диференціації у широкий спектр типів клітин. Завдяки своїй здатності до диференціації вони відкривають нові можливості для моделювання людських тканин та станів здоров’я.

Мезенхімальні стовбурові клітини

Мезенхімальні стовбурові клітини, також відомі як МСК, можна отримати з різних джерел людського походження, таких як кістковий мозок, жирова тканина, тканина пуповини (желе Уортона) та амніотична рідина (рідина, що оточує плід), і їх можна культивувати in vitro. Ці дорослі стромальні стовбурові клітини мають здатність розвиватися у широкий спектр типів клітин. До таких типів клітин належать, зокрема, кісткові клітини, хрящові клітини, м’язові клітини, нервові клітини, клітини шкіри та клітини рогівки.

Клітини гладких м’язів

У порожнистих органах первинні клітини гладких м’язів (SMC) вистилають внутрішню поверхню та забезпечують скоротливість. Окрім дослідження раку та інших захворювань, клітини гладких м’язів можуть використовуватися для моделювання гіпертонічного фіброзу.

Первинні клітини та клітинні лінії

Завдяки спонтанним мутаціям, як у трансформованих ракових клітинних лініях, або шляхом навмисних змін, як у разі штучного створення онкогенів, безперервні клітинні лінії набули здатності до нескінченного розмноження (імунізувалися). Як правило, безперервні клітинні лінії є більш надійними та зручними у роботі, ніж первинні клітини. Вони можуть розмножуватися нескінченно і забезпечують швидкий доступ до необхідних даних. Використання безперервних клітинних ліній має певні обмеження, зокрема те, що вони генетично модифіковані/трансформовані, що може змінити їхні фізіологічні особливості та не відповідати умовам in vivo, а також те, що з часом це може ще більше змінюватися внаслідок значної кількості пасажувань.

Досягнення в галузі культивування первинних клітин

Первинні клітини мають сумну репутацію через складність роботи з ними. Однак цей процес стає простішим, ніж будь-коли раніше, завдяки розвитку культивування первинних клітин, доступності комерційних первинних клітин із повністю оптимізованими протоколами та новим методам аналізу, що вимагають менших зусиль.

Перехід від двовимірної до тривимірної клітинної культури вважається важливою віхою в цій галузі. У двовимірній культурі можуть бути ослаблені тканинно-специфічна архітектура, міжклітинні взаємодії та механічні/біохімічні сигнальні шляхи. Отже, біологічна цінність таких культур має свої обмеження.

З іншого боку, тривимірна клітинна культура дає клітинам можливість розмножуватися та взаємодіяти з тривимірним позаклітинним каркасом. Це дозволяє клітинам взаємодіяти між собою та з позаклітинним матриксом, що робить тривимірні культури більш фізіологічно релевантними. Точність цього методу в прогнозуванні реакцій in vivo зробила його революційним у таких галузях, як відкриття та розробка лікарських засобів. Завдяки цьому найсучасніші технології, такі як органоїди, отримані від пацієнтів, та «органи на чіпі», забезпечують висококонтекстуальні моделі для скринінгу та розробки лікарських засобів.

Отримання первинних клітин є вузьким місцем у первинному культивуванні. Зазвичай для подолання цієї проблеми потрібен більший об’єм тканини, що може бути складно досягти. Однак покращення аналітичної чутливості відкриває шлях уперед. Наприклад, необхідність культивування великих кількостей первинних клітин зменшується завдяки використанню технології роботи з окремими клітинами, що включає секвенування, вестерн-блотинг та масову цитометрію.

Багатообіцяючі перспективи культивування первинних клітин

Загальні труднощі культивування первинних клітин пом’якшуються завдяки технологічним досягненням. У свою чергу, цей метод швидко витісняє інші, стаючи «золотим стандартом» у дослідженнях та практиці клітинної та молекулярної біології. Виробництво вакцин, заміщення органів, терапія стовбуровими клітинами, дослідження раку та багато іншого отримають значну користь від постійних досягнень у галузі культивування первинних клітин.

Поради та рекомендації щодо культивування первинних клітин

Потреби у розмноженні клітин

Два найпоширеніші методи культивування первинних клітин — у суспензії або на поверхні (2D). Деякі клітини здатні вільно плавати в кровотоці, ніколи не прикріплюючись до поверхні (наприклад, клітини, отримані з периферичної крові). Були створені різні клітинні лінії, здатні успішно розвиватися в суспензійних культурах, де вони можуть досягати щільності, недосяжної в умовах 2D-росту. Первинні клітини, яким для росту in vitro потрібне прикріплення до поверхні, називаються адгезивними клітинами; до них належать клітини, що містяться у твердих тканинах. Для поліпшення адгезійних властивостей та забезпечення інших сигналів, необхідних для росту й диференціації, ці клітини зазвичай культивують у плоских пластикових посудинах без покриття, але іноді — на мікроносіях. Останні можуть бути покриті білками позаклітинного матриксу (такими як колаген і ламінін). Середовище, що використовується в клітинній культурі, складається з базового середовища, доповненого відповідними факторами росту та цитокінами. Клітинний інкубатор — це спеціальний тип лабораторного інкубатора, що використовується для культивування та утримання клітин при певній температурі та у певній газовій суміші (зазвичай 37 °C, 5 % CO₂ для клітин ссавців). Залежно від типу клітин, що культивуються, оптимальні умови можуть значно відрізнятися. Залежно від типів клітин, що вирощуються, оптимальне середовище для росту матиме унікальну комбінацію факторів, включаючи, серед іншого, рН, концентрацію глюкози, фактори росту та наявність інших поживних речовин.

Антибіотики в живильному середовищі відіграють вирішальну роль під час створення первинної культури для запобігання забрудненню з боку тканин-господаря. Деякі схеми антибіотикотерапії передбачають комбінацію гентаміцину, пеніциліну, стрептоміцину та амфотерицину B. Однак не рекомендується застосовувати антибіотики протягом тривалого часу, оскільки деякі речовини (наприклад, амфотерицин B) у довгостроковій перспективі можуть бути токсичними для клітин.

Більшість первинних клітин проходять стадію старіння та припиняють поділ після певної кількості подвоєнь популяції, тому надзвичайно важливо підтримувати їх життєздатність після ізоляції. Для забезпечення довготривалої життєздатності клітин необхідні професійні методи культивування клітин та ідеальні умови культивування (включаючи відповідне середовище, правильну температуру, правильну газову суміш, правильний рН, правильну концентрацію факторів росту, наявність поживних речовин та глюкози). Оскільки багато факторів росту, що використовуються для збагачення середовищ, отримують із крові тварин (інгредієнти, отримані з крові, можуть бути джерелом забруднення), рекомендується мінімізувати їхнє використання або взагалі уникнути цього. Також важливо дотримуватися асептичної техніки.

Субкультура та підтримка

Коли ізольовані клітини прикріплюються до поверхні культуральної чашки, це означає початок фази підтримання культури. Прикріплення зазвичай відбувається через 24 години після початку культивування. Клітини слід пересівати, коли вони досягнуть певного відсотка конфлюентності та активно розмножуються. Оскільки клітини після досягнення конфлюентності можуть диференціюватися та демонструвати повільнішу проліферацію після пасажування, найкраще пересівати первинні клітинні культури до того, як вони досягнуть 100 % конфлюентності.

Субкультурування у свіжому середовищі підтримує експоненціальний ріст клітин, що залежать від прикріплення. Субкультурування моношарів порушує міжклітинні та внутрішньоклітинні взаємодії на поверхні клітин. Для вилучення адгезивних первинних клітин із моношарів або тканин використовують низькі концентрації протеолітичних ферментів, таких як трипсин/ЕДТА. Після дисоціації та розведення до розчину, що містить окремі клітини, клітини підраховують і переносять у свіжі культуральні посудини для повторного прикріплення та розмноження.

Кріоконсервація та відновлення

Кріоконсервація дозволяє зберегти живі клітини шляхом їх заморожування при низьких температурах. Кріоконсервація та розморожування первинних клітин людини запобігають загибелі та пошкодженню клітин під час зберігання та використання. Первинні клітини людини кріозахищають за допомогою ДМСО або гліцерину (при відповідній температурі та з контрольованою швидкістю заморожування). Процес заморожування повинен бути поступовим — зі зниженням температури на 1 °C щохвилини — для запобігання утворенню кристалів льоду. Для довготривалого зберігання необхідний рідкий азот (-196 °C) або температура нижче -130 °C.

Для розморожування кріоконсервованих клітин достатньо занурити заморожені клітини у водяну баню з температурою 37 °C на 1–2 хвилини. Первинні клітини людини не слід центрифугувати після виймання з морозильної камери (оскільки вони надзвичайно чутливі до пошкоджень під час відновлення після кріоконсервації). Це підходить для висівання клітин одразу після розморожування та сприяє прикріпленню в культурах протягом перших 24 годин після висівання. 1 Після того, як кріоконсервовані первинні клітини прикріпилися, відпрацьоване середовище необхідно видалити (оскільки DMSO є шкідливим для первинних клітин і може спричинити зниження життєздатності після розморожування).