Preverjanje CRISPR v celičnih linijah: Funkcionalna analiza celotnega genoma

Tehnologija CRISPR-Cas9 je povzročila revolucijo v funkcionalni genomiki, saj omogoča sistematično raziskovanje delovanja genov v celotnih genomih v gojenih celicah. V družbi Cytion se zavedamo, da naše celice in celične linije služijo kot zmogljive platforme za aplikacije CRISPR za presejanje, ki identificirajo gene, ki nadzorujejo različne celične procese, od proliferacije do odpornosti na zdravila. Pri zbirnih pregledih CRISPR se v celične populacije vnesejo knjižnice, ki vsebujejo od tisoč do sto tisoč vodilnih RNK (sgRNA), s čimer se ustvarijo obsežne zbirke, v katerih je vsaka celica deležna različnih genetskih motenj. Z izvajanjem selektivnih pritiskov in spremljanjem, katere sgRNA se obogatijo ali izčrpajo, raziskovalci sistematično identificirajo gene, ki so bistveni za preživetje, gene, ki povzročajo odpornost na zdravila, ali gene, ki uravnavajo kateri koli izbirni fenotip. Ta nepristranski funkcionalni genomski pristop je pospešil odkritja v biologiji raka, imunologiji, nalezljivih boleznih in osnovni celični biologiji ter spremenil gojene celice v motorje za sistematična biološka odkritja.

Oblikovanje in zagotavljanje knjižnice CRISPR

Knjižnice CRISPR v genomskem obsegu vsebujejo zaporedja sgRNA, ki so usmerjena na vse gene v genomu, ki kodirajo beljakovine, običajno s 4-10 vodili na gen, da se zagotovi robustna pokritost in upošteva spremenljiva učinkovitost vodil. Knjižnice za celoten človeški genom vsebujejo 70.000-100.000 zaporedij sgRNA, medtem ko usmerjene knjižnice, usmerjene v podskupine, kot so kinaze, epigenetski regulatorji ali presnovni encimi, omogočajo globlje pokritje z manjšim številom konstruktov. Kakovost knjižnice odločilno vpliva na uspešnost pregleda - vodila morajo učinkovito povzročiti izločitev, hkrati pa se izogniti neciljnim učinkom, ki bi zmotili razlago.

Lentivirusni prenos ostaja standard za vnos knjižnic sgRNA v celične populacije. Združeni lentivirus, ki vsebuje celotno knjižnico sgRNA, okuži celice pri nizki multipliciteti okužbe (MOI), običajno 0,3-0,5, kar zagotavlja, da večina okuženih celic prejme le en konstrukt sgRNA. Ta zahteva po eni motnji na celico preprečuje motnje zaradi celic z več izločitvami. Po transdukciji z antibiotično selekcijo odstranimo neokužene celice, s čimer dobimo populacije, v katerih vsaka celica nosi določeno genetsko motnjo. Pri celičnih linijah Cytion se učinkovitost transdukcije razlikuje glede na vrsto celice - celice v suspenziji se pogosto učinkovito transducirajo, medtem ko nekatere adherentne linije zahtevajo optimizacijo koncentracije virusa, polibrena in spinokulacije.

Zastopanost knjižnice - število celic, ki vsebujejo vsako sgRNA - odločilno vpliva na kakovost pregleda. Pri pregledih, ki zajemajo celoten genom, je treba ohraniti 500-1000 celic na sgRNA ves čas poskusa, da se prepreči stohastična izguba vodnikov zaradi naključnih učinkov vzorčenja. Za knjižnico s 100 000 sgRNA to zahteva začetne populacije s 50-100 milijoni celic in ohranjanje sorazmernega števila celic s selekcijo in predvajanjem. Nezadostna zastopanost vnaša šum, ki zakriva prave zadetke in ustvarja lažno pozitivne rezultate zaradi naključnega izpadanja.

Pregledi z negativno selekcijo: Prepoznavanje bistvenih genov

Negativni selekcijski zasloni identificirajo gene, ki so potrebni za preživetje ali razmnoževanje celic v standardnih pogojih gojenja. Celice se transducirajo s knjižnicami sgRNA, izberejo za integracijo, nato pa se 2-4 tedne neprekinjeno pasažirajo, pri čemer se ohranja zastopanost knjižnice. sgRNA, ki ciljajo na bistvene gene, se izčrpajo, saj se celice, ki vsebujejo te izločitve, ne razmnožujejo ali umrejo. Primerjava številčnosti sgRNA v končni časovni točki v primerjavi z začetno populacijo (T0) pokaže, kateri geni so potrebni za kondicijo v eksperimentalnih pogojih.

Zasloni z esencialnimi geni ustvarijo zemljevide odvisnosti, specifične za posamezne celične linije, ki razkrivajo ranljivosti, uporabne za terapevtske posege. Rakave celične linije so pogosto odvisne od onkogenov ali komponent poti, ki jih normalne celice ne potrebujejo, kar predstavlja potencialne terapevtske tarče. Na primer, celice HeLa kažejo značilne odvisnosti od genov, ki podpirajo hitro razmnoževanje in upravljanje genomske nestabilnosti. V okviru projekta Cancer Dependency Map so bili opravljeni pregledi CRISPR po genomu na stotinah rakavih celičnih linij, pri čemer so bile popisane genetske odvisnosti in povezane z genomskimi značilnostmi za napovedovanje ranljivosti specifičnih za bolnike.

Zasloni esencialnosti, specifični za kontekst, primerjajo odvisnosti genov med pogoji ali celičnimi linijami. Z vzporednimi pregledi v normalnih in transformiranih celicah ali v celicah z različnim genetskim ozadjem se opredelijo sintetične smrtonosne interakcije, pri katerih je izguba gena smrtonosna le v posebnih okoliščinah. Te kontekstno specifične odvisnosti zagotavljajo terapevtska okna - ciljanje na gene, ki so bistveni pri raku, vendar so nepotrebni v normalnih tkivih, zmanjšuje toksičnost. Pri celičnih linijah Cytion, ki predstavljajo različna tkiva in stanja transformacije, primerjalni pregled CRISPR kartira genetsko arhitekturo celičnih odvisnosti.

Presejalni testi pozitivne selekcije: Mehanizmi odpornosti in preživetja

Pri pregledih s pozitivno selekcijo se uporabljajo selektivni pritiski, ki uničijo večino celic, pri čemer se obogatijo za sgRNA, ki zagotavljajo preživetje ali odpornost. Pri zaslonih odpornosti na zdravila se celice, okužene s knjižnico, zdravijo s terapevtiki v koncentracijah, ki ubijajo nemodificirane celice. Preživele celice so obogatene s sgRNA, ki motijo tarče zdravil, aktivirajo poti odpornosti ali blokirajo proapoptotično signalizacijo. Identifikacija teh genov razkrije mehanizme delovanja zdravil in možne mehanizme odpornosti, ki se lahko pojavijo v klinični praksi.

S presejanjem odpornosti proti toksinom se identificirajo geni, potrebni za sprejem, aktivacijo ali citotoksičnost toksina. Pri presejanju z difteričnim toksinom se na primer obogatijo sgRNA, ki so usmerjene na toksinski receptor in komponente membranskega prometa, potrebne za vnos toksina. Pri pregledih občutljivosti na patogene so celice izpostavljene virusom ali bakterijskim toksinom, pri čemer se ugotavljajo dejavniki gostitelja, ki so bistveni za okužbo. S temi zasloni so bili kartirani celični mehanizmi, ki jih izkoriščajo patogeni, in razkriti potencialni terapevtski cilji za blokiranje okužbe.

Zasloni za neodvisnost od rastnih dejavnikov gojijo celice v zmanjšanem serumu ali z odtegnitvijo specifičnih rastnih dejavnikov, pri čemer ugotavljajo gene, ki ob prekinitvi omogočajo proliferacijo, neodvisno od rastnih dejavnikov. Ti zadetki pogosto predstavljajo tumorske supresorje ali negativne regulatorje signalnih poti rasti. Razumevanje poti, ki omogočajo neodvisnost od rastnih dejavnikov, osvetljuje mehanizme napredovanja raka in opredeljuje potencialne tarče za kombinirane terapije, ki preprečujejo nastanek odpornosti.

Pregledi CRISPR na podlagi FACS

S fluorescenčno aktiviranim sortiranjem celic je mogoče opraviti preglede genov, ki uravnavajo vse fluorescenčno merljive fenotipe. Celice, ki izražajo fluorescenčni reporter pod nadzorom zanimive poti, se transducirajo s knjižnicami sgRNA, nato pa se razvrstijo glede na izražanje reporterja. Celice z visokim in nizkim izražanjem reporterja se zberejo ločeno, med populacijami pa se primerja številčnost sgRNA. Obogatene sgRNA identificirajo pozitivne regulatorje (obogatene v populaciji z nizko ekspresijo, ko so izločene) in negativne regulatorje (obogatene v populaciji z visoko ekspresijo, ko so prekinjene).

Zasloni površinskih označevalcev razvrščajo celice na podlagi barvanja s protitelesi za beljakovine celične površine. S temi zasloni se določijo regulatorji predstavitve antigenov, ligandi imunskih kontrolnih točk ali adhezijske molekule. Za razvoj imunoterapije so zasloni na podlagi FACS identificirali gene, ki nadzorujejo izražanje PD-L1, in razkrili ciljne poti, ki bi lahko izboljšale odziv na imunoterapijo. Možnost razvrščanja na podlagi endogenega izražanja beljakovin in ne na podlagi inženirskih reporterjev razširja obseg pregleda na vse beljakovine z ustreznimi protitelesi.

Večparametrski sistem FACS omogoča prefinjeno fenotipsko razlikovanje. S hkratnim merjenjem več označevalcev se identificirajo geni, ki specifično vplivajo na določene populacije ali stanja celic. Na primer, razvrščanje na podlagi velikosti in zrnatosti v kombinaciji z barvili za viabilnost ločuje apoptotične celice od zdravih, kar omogoča iskanje regulatorjev apoptoze. Glavna omejitev ostaja prepustnost - zasloni, ki temeljijo na FACS, zahtevajo več celic kot preproste selekcije za preživetje in se soočajo s praktičnimi omejitvami glede števila celic, ki jih je mogoče razvrstiti, kar lahko omeji velikost ali zastopanost knjižnice.

Pregledi CRISPR na podlagi slik

Avtomatizirana mikroskopija v kombinaciji z analizo slik omogoča preglede morfoloških fenotipov, ki niso dostopni za FACS. Celice, okužene s knjižnicami sgRNA (eno ali nekaj vodil na vdolbino), se fiksirajo in slikajo, pri čemer se pridobi na stotine morfoloških značilnosti na celico. Strojno učenje razvrsti fenotipe in določi vodila, ki povzročajo značilne morfološke spremembe. Za razliko od skupinskih zaslonov se pri matričnih oblikah ohranja prostorska ločitev motenj, kar omogoča odčitavanje na podlagi mikroskopije.

Zasloni morfologije organelov identificirajo gene, ki uravnavajo mitohondrijske mreže, Golgijevo strukturo, jedrno morfologijo ali citoskeletno organizacijo. Ti zasloni so razkrili mehanizme nadzora kakovosti, ki vzdržujejo delovanje organelov, in identificirali gene, ki usklajujejo dinamiko organelov z napredovanjem celičnega cikla. Pri celičnih linijah Cytion z dobro opisano morfologijo lahko s slikovnim presejanjem prepoznamo subtilne fenotipe, ki so nevidni pri drugih načinih odčitavanja.

Zasloni s slikanjem živih celic spremljajo dinamične procese, kot so delitev celic, migracija ali signalizacija kalcija v daljšem časovnem obdobju. S časovno usklajenim slikanjem nizov izpadov se odkrijejo geni, ki nadzorujejo čas delitve, usmerjenost mitotičnega vretena ali hitrost in usmerjenost migracije. Bogastvo slikovnih podatkov gre na račun prepustnosti - zasloni z matrikami preučujejo manj motenj kot združeni zasloni, čeprav usmerjene knjižnice, usmerjene v določene družine genov, uravnotežijo pokritost s praktičnimi omejitvami.

Analiza in potrditev zadetkov

Po izbiri in zbiranju vzorcev se ekstrahira genomska DNK, območje sgRNA pa se pomnoži s PCR s primerji, ki vključujejo adapterje za sekvenciranje. Z globokim sekvenciranjem se kvantificira številčnost vsake sgRNA, pri čemer se število odčitkov primerja med eksperimentalnimi in kontrolnimi vzorci. Računalniška orodja, kot so MAGeCK, BAGEL ali JACKS, statistično ovrednotijo obogatitev ali izčrpanje, pri čemer upoštevajo večkratno testiranje hipotez na tisoče genov.

Zadetki z visokim zaupanjem kažejo dosledne učinke več neodvisnih sgRNA, ki ciljajo na isti gen. Geni, pri katerih ima učinke le eden ali dva vodnika, verjetno predstavljajo artefakte izven cilja in ne pravih zadetkov. Statistične metode združujejo dokaze za vsa vodila na gen, kar povečuje moč za odkrivanje resničnih pozitivnih rezultatov, hkrati pa zmanjšuje število lažnih odkritij zaradi posameznih vodil, ki niso tarče. Kontrolna vodila, usmerjena na znane bistvene gene, ali kontrolne skupine, ki niso usmerjene, potrjujejo učinkovitost pregleda in umerjajo statistične pragove.

Validacijski poskusi potrjujejo zadetke zaslona z uporabo neodvisnih sgRNA ali ortogonalnih metod izločanja. Posamezne sgRNA se klonirajo in testirajo v presejalni celični liniji in po možnosti v dodatnih celičnih linijah, da se ocenita ponovljivost in posplošljivost. Poskusi reševanja, ki ponovno izražajo ciljni gen iz cDNA brez ciljnega zaporedja sgRNA, potrjujejo ciljne učinke. Za potrditev terapevtskega cilja se s testiranjem zadetkov v skupinah celičnih linij Cytion, ki predstavljajo različna genetska ozadja, opredelijo splošno uporabne odvisnosti v primerjavi z odvisnostmi, specifičnimi za določen kontekst.

Variante in napredni pristopi presejanja

Pri pregledih CRISPRi in CRISPRa se uporablja katalitično mrtvi Cas9, ki je spojen s transkripcijskimi represorji ali aktivatorji, kar omogoča reverzibilno izločanje ali aktivacijo genov namesto trajnega izločanja. Ti pristopi preprečujejo zmedo zaradi popolne izgube gena, modelirajo spremembe izražanja gena in ne ničelnih mutacij ter omogočajo pregledovanje regulacijskih elementov, ki ne kodirajo proteinov. Pri bistvenih genih, pri katerih izločitev povzroči smrtnost, lahko delna izločitev s CRISPRi razkrije fenotipe, odvisne od odmerka, in terapevtska okna.

Pri pregledih z urejevalnikom baz se namesto vstavitev/izbrisov uvedejo natančne točkovne mutacije, kar omogoča sistematično mutagenezo proteinskih domen ali regulacijskih elementov. Zasloni z osnovnim urejanjem obljubljajo še večjo natančnost, saj uvajajo ali popravljajo specifične mutacije. Ti zasloni naslednje generacije bodo omogočili sistematično razčlenjevanje odnosov med strukturo in funkcijo beljakovin ter obsežno raziskovanje različic, povezanih z boleznimi.

Kombinatorični zasloni z uporabo knjižnic z dvojno sgRNA sistematično testirajo genske pare in ugotavljajo genetske interakcije, vključno s sintetično smrtnostjo, supresijo in epistazo. Čeprav so kombinatorični zasloni tehnično zahtevni zaradi faktorskega povečanja kompleksnosti knjižnic, pa kartirajo genetska omrežja in določajo kombinirane terapevtske strategije. Usmerjeni kombinatorični zasloni, usmerjeni v genske pare, ki jih je mogoče zdraviti, odkrivajo kombinirane terapije, ki bi lahko preprečile odpornost ali povečale učinkovitost v primerjavi z zdravljenjem z enim zdravilom.

Uporaba pri odkrivanju in razvoju zdravil

Zasloni CRISPR pospešujejo identifikacijo tarč s sistematičnim preverjanjem, kateri geni, če so moteni, povzročajo želene terapevtske fenotipe. Zasloni odvisnosti od raka identificirajo gene, ki so nujno potrebni zlasti v rakavih celicah in predstavljajo potencialne terapevtske tarče. Pregledi v celicah, pridobljenih od bolnikov, ali izogenih celičnih linijah stratificirajo cilje glede na genetski kontekst, kar omogoča pristope precizne medicine, ki terapije prilagajajo bolnikovim biomarkerjem.

Študije mehanizma delovanja za spojine z neznanimi cilji uporabljajo zaslone CRISPR za identifikacijo genov, ki določajo odpornost ali občutljivost. Če prekinitev določenega gena povzroči odpornost na spojino, ta gen verjetno kodira tarčo ali komponento poti, ki je bistvena za delovanje zdravila. S tem pristopom so bili pojasnjeni mehanizmi za uveljavljena in nova zdravila, kar je pospešilo klinični razvoj in opredelilo biomarkerje za izbiro bolnikov.

Pri pregledih za napovedovanje mehanizmov odpornosti se celice med pregledovanjem CRISPR zdravijo s subletalnimi odmerki zdravil, pri čemer se opredelijo geni, ki ob prekinitvi povzročajo odpornost. Ti geni predstavljajo potencialne mehanizme, s katerimi se lahko tumorji izognejo zdravljenju, kar omogoča razvoj kombiniranih strategij, ki blokirajo poti odpornosti. Pri celičnih linijah Cytion, ki modelirajo različne vrste raka, se s presejanjem odpornosti pridobivajo informacije za načrtovanje kliničnih preskušanj in strategije spremljanja bolnikov.

Izzivi in najboljše prakse

Kljub izboljšanim algoritmom za načrtovanje sgRNA ostajajo zaskrbljujoči učinki zunaj cilja. Nekatera vodila cepijo nenačrtovana genomska mesta, ki so po zaporedju podobna ciljnim, kar lahko povzroči fenotipe, ki niso povezani z nameravano prekinitvijo gena. Uporaba več neodvisnih vodil na gen in statistično združevanje vodil ublaži to težavo. Potrjevanje najboljših zadetkov z ortogonalnimi metodami potrjuje učinke na cilju.

Nepopolna ali zapoznela kinetika izločanja lahko vpliva na rezultate pregleda. Nekatere sgRNA rezajo neučinkovito in povzročijo delno izločitev namesto popolne izločitve. Stabilnost proteinov pomeni, da je za izločitev na ravni DNA/RNA potreben čas, da se obstoječi protein razgradi, preden se pojavijo fenotipi. Presejalni testi morajo potekati dovolj dolgo po selekciji, da se beljakovine popolnoma odstranijo, običajno 7-14 dni, odvisno od razpolovne dobe ciljnih beljakovin in časa podvojitve celic.

Nadzor kakovosti presejanja vključuje spremljanje zastopanosti knjižnice, potrditev aktivnosti Cas9 in potrditev pričakovanega obnašanja kontrolnih vodnikov. Sekvenciranje začetnih populacij potrdi kompleksnost in zastopanost knjižnice. Vodila, ki ciljajo na znane bistvene gene, morajo v negativnih selekcijskih pregledih pokazati močno izčrpavanje, medtem ko se kontrolne skupine, ki ne ciljajo, ne smejo bistveno spremeniti. Odstopanje od pričakovanega obnašanja kontrol kaže na tehnične težave, ki jih je treba odpraviti pred razlago rezultatov poskusov.

Prihodnje usmeritve in širitev uporabe

Perturb-seq združuje presejanje CRISPR z enoceličnim sekvenciranjem RNK, pri čemer se hkrati profilirajo transkriptomski odzivi na tisoče genetskih motenj. Ta pristop prikazuje, kako se genske motnje širijo po molekularnih omrežjih, razkriva regulativne odnose in arhitekturo poti. Pri celičnih linijah Cytion podatkovni nizi Perturb-seq zagotavljajo celovito funkcionalno karakterizacijo, ki dopolnjuje tradicionalne pristope presejanja.

In vivo CRISPR presejanje razširja združeno presejanje na živalske modele, pri čemer identificira gene, ki nadzorujejo rast tumorjev, metastaziranje ali odziv na imunoterapijo v fiziološko pomembnih kontekstih. S knjižnico okužene celice se vsadijo v miši, tumorji pa se odvzamejo za kvantifikacijo sgRNA. Geni, obogateni v rastočih tumorjih, predstavljajo dejavnike, ki vplivajo na sposobnost in vivo, ki bi jih lahko spregledali pri pregledih celičnih kultur. Ti pristopi so most med študijami celičnih linij in klinično uporabo.

Za podjetje Cytion in skupnost celičnih kultur je presejanje CRISPR spremenilo celične linije iz pasivnih eksperimentalnih modelov v aktivne motorje za odkrivanje. Sistematično funkcionalno preiskovanje, ki ga omogoča presejanje celotnega genoma, še naprej razkriva temeljno biologijo in terapevtske možnosti, s čimer se gojene celice utrjujejo kot nepogrešljivo orodje za sodobne biološke raziskave in razvoj zdravil.