Primarne človeške celice

Kaj so primarne človeške celice?

Primarne celice so najčistejša oblika svojih tkiv. Izolirajo se iz tkiva in obdelajo tako, da se lahko ustalijo v kultiviranem okolju z idealnimi pogoji. Bolj natančno posnemajo stanje v živo in kažejo normalno fiziologijo, saj izhajajo iz tkiva in niso genetsko spremenjene. Zaradi tega lahko služijo kot koristni modeli za raziskave na področju celične farmakologije, toksikologije in fiziologije (vključno z raziskavami presnove, staranja in signalne transdukcije). Upoštevajte, da je gojenje in vzdrževanje primarnih celic zahtevnejše kot pri neprekinjenih celičnih linijah, saj imajo krajšo življenjsko dobo in po določenem številu celičnih delitev prenehajo z delitvijo (ali senescirajo). Raziskave celičnih signalnih poti so zapletene zaradi naravne spremenljivosti primarnih celic, pridobljenih od darovalcev in s postopki subkultiviranja. Pred začetkom raziskav signalnih poti raziskovalci pogosto opravijo presejanje, da ugotovijo, ali se celice odzivajo na pogosto uporabljene dražljaje. Da bi se izognili izgubi časa in denarja, je mogoče primarne celice pred presejanjem stimulirati, da aktivirajo glavne signalne poti.

Zakaj uporabljati človeške primarne celice?

Za celične teste se pogosto uporabljajo imortalizirane celične linije. Čeprav so znanstveniki priznali, da lahko biološke spremembe, ki jih povzročajo celične linije, škodujejo pri preučevanju njihovega fiziološkega pomena. Uporaba človeških primarnih celic izboljša fiziološko vrednost podatkov, pridobljenih s celičnimi kulturami, in se vedno bolj štejejo za pomembne pri preučevanju bioloških procesov, poteka bolezni in razvoja zdravil.

Človeške primarne celice se široko uporabljajo v in vitro študijah medcelične in intracelularne komunikacije, razvojne biologije ter mehanizmov, ki so osnova za raka, Parkinsonovo bolezen in sladkorno bolezen, med mnogimi drugimi predkliničnimi in raziskovalnimi področji bioloških raziskav. Raziskovalci že dolgo uporabljajo imortalizirane celične linije za preučevanje delovanja tkiv; vendar pa celične linije z očitnimi mutacijami in kromosomskimi anomalijami morda niso dobri nadomestki za normalne celice in razvoj bolezni v njenih zgodnjih stopnjah. Natančnejši model določenega tipa tkivne celice je zdaj mogoče doseči z uporabo človeških primarnih celic, izoliranih iz tega tkiva in gojenih v gojiščih za primarne celice ter z dodatki.

Kaj je primarna celična kultura?

Namesto uporabe nesmrtnih celičnih linij primarna celična kultura vključuje gojenje celic neposredno iz večceličnega organizma zunaj telesa. V nekaterih državah, kot je Združeno kraljestvo, je pravno priznano, da so primarne celične kulture bolj reprezentativne za tkiva in vivo kot celične linije. Kljub temu primarne celice za rast potrebujejo ustrezen substrat in hranila, po določenem številu delitev pa razvijejo senescentni fenotip, zaradi katerega se njihovo deljenje trajno ustavi. Ti dve dejavniki spodbujata ustvarjanje celičnih linij. Tako naravno nesmrne primarne celice (npr. celice HeLa) kot umetno nesmrne primarne celice (npr. celice HEK) je mogoče v celični kulturi gojiti neomejeno dolgo.

Človeške primarne celice po vrstah tkiva

Epitelne celice, fibroblasti, keratinociti, melanociti, endotelne celice, mišične celice, imunske celice in matične celice, kot so mezenhimalne matične celice, so med najpogosteje uporabljenimi človeškimi primarnimi celicami v znanstvenih raziskavah. Kulture so sprva heterogene (predstavljajo mešanico tipov celic, prisotnih v tkivu) in jih je mogoče in vitro ohranjati pri življenju le določen čas. Transformacija je in vitro postopek, ki omogoča manipulacijo človeških primarnih celic za neomejeno število subkultur. Transformacija lahko poteka naravno ali pa jo lahko sprožijo kemikalije ali virusi. Po genetski transformaciji se lahko primarna kultura ob zadostni količini hranil in prostora neomejeno deli v nesmrtno sekundarno celično linijo.

Endotelne celice

Zdravljenje raka, celjenje ran, raziskave celičnega signaliziranja, presejanje z visoko zmogljivostjo in visoko vsebnostjo ter toksikološko presejanje so le nekatera od področij, ki lahko izkoristijo uporabo primarnih endotelnih celic kot raziskovalnega orodja.

Keratinociti

Keratinociti, pridobljeni iz povrhnjice odrasle človeške kože ali novorojenčkove kožice, igrajo ključno vlogo pri raziskovanju kožnih bolezni, kot sta luskavica in rak.

Epitelne celice

Od raziskav raka do toksikoloških preiskav so se primarne epitelne celice izkazale za neprecenljiv vir pri modeliranju naravnih obrambnih mehanizmov telesa.

Fibroblasti

Indukcija pluripotentnih izvornih celic (iPS) in preučevanje celjenja ran sta le dve od številnih uporab primarnih fibroblastov.

Imunske celice

Mononuklearne celice perifernega krvi, skrajšano PBMC, so mononuklearne celice krvi z okroglim celičnim jedrom. Vključujejo predvsem limfocite in monocite, ki prevzemajo pomembne funkcije v poteku imunskega odziva. Mononuklearne celice perifernega krvi se pogosto uporabljajo za diagnosticiranje okužb ali za ugotavljanje morebitne zaščite po cepljenju. Pogosto je ključnega pomena vpogled v celični imunski odziv, ki ga posredujejo T-celice.

Melanociti

Melanociti, specializirane kožne celice, ki proizvajajo pigment melanin, so koristni kot modeli za raziskave na področjih, kot so celjenje ran, toksičnost, melanom, odziv kože na ultravijolično (UV) sevanje, kožne bolezni in kozmetika.

Matične celice

Matične celice imajo potencial, da se diferencirajo v široko paleto celičnih tipov. Zaradi svoje sposobnosti diferenciacije ponujajo nove možnosti za modeliranje človeškega tkiva in zdravstvenih stanj.

Mezenske matične celice

Mezenskimalne izvorne celice, znane tudi kot MSC, se lahko pridobijo iz različnih človeških virov, kot so kostni mozeg, maščoba (maščobno tkivo), tkivo popkovine (Whartonova želatina) in amnionska tekočina (tekočina, ki obdaja plod), ter se lahko razmnožujejo in vitro. Te odrasle stromalne matične celice imajo sposobnost, da se razvijejo v široko paleto celičnih tipov. Med te celične tipe spadajo kostne celice, hrustančne celice, mišične celice, živčne celice, kožne celice in celice roženice.

Celice gladkih mišic

V votlih organih primarne gladkomišične celice (SMC) obdajajo notranjost in posredujejo kontraktilnost. Poleg raka in drugih bolezni se SMC lahko uporabljajo za modeliranje hipertenzijske fibroze.

Primarne celice in celične linije

Bodisi s spontano mutacijo, kot pri transformiranih rakavih celičnih linijah, bodisi z namerno spremembo, kot pri umetnem ustvarjanju rakavih genov, so neprekinjene celične linije pridobile sposobnost neskončnega razmnoževanja (nesmrtnost). Neprekinjene celične linije so praviloma zanesljivejše in lažje za uporabo kot primarne celice. Lahko se neomejeno razmnožujejo in omogočajo hiter dostop do bistvenih podatkov. Uporaba kontinuiranih celičnih linij ima določene omejitve, vključno z dejstvom, da so genetsko spremenjene/transformirane, kar lahko spremeni fiziološke lastnosti in ne ustreza in vivo pogojem, ter da se to s časom in številnimi pasážami lahko še dodatno spremeni.

Napredek na področju gojenja primarnih celic

Primarne celice so znane po tem, da je delo z njimi zahtevno. Vendar pa postaja ta proces lažji kot kdaj koli prej zahvaljujoč napredku na področju gojenja primarnih celic, dostopnosti komercialnih primarnih celic s popolnoma optimiziranimi protokoli ter novim analiznim tehnikam, ki zahtevajo manj vložka.

Prehod z dvodimenzionalne na tridimenzionalno celično kulturo velja za pomemben mejnik na tem področju. V 2D kulturi so lahko tkivno specifična arhitektura, interakcije med celicami ter mehansko-biokemično signaliziranje oslabljene. Zato je biološka vrednost teh kultur omejena.

Po drugi strani tridimenzionalna celična kultura omogoča celicam, da se razširjajo in interagirajo s tridimenzionalnim ekstracelularnim ogrodjem. To celicam omogoča medsebojno interakcijo ter interakcijo z ekstracelularno matriko, zaradi česar so tridimenzionalne kulture fiziološko relevantnejše. Natančnost te metode pri napovedovanju odzivov in vivo jo je naredila revolucionarno na področjih, kot sta odkrivanje in razvoj zdravil. Zaradi tega najsodobnejše tehnologije, kot so organoidi, pridobljeni iz pacientov, in »organi na čipu«, zagotavljajo visoko kontekstualne modele za presejanje in razvoj zdravil.

Pridobivanje primarnih celic je ozko grlo v primarni kulturi. Za premagovanje te ovire je običajno potrebna večja količina tkiva, kar je lahko težko doseči. Vendar pa izboljšana analitična občutljivost ponuja pot naprej. Na primer, potreba po gojenju velikih količin primarnih celic se zmanjša z uporabo tehnologije posameznih celic, ki vključuje sekvenciranje, western blotting in masno citometrijo.

Obetavne perspektive za kulturo primarnih celic

Splošne težave pri gojenju primarnih celic se zmanjšujejo zaradi tehnoloških napredkov. Ta metoda zato hitro nadomešča druge metode kot zlati standard v študiju in praksi celične in molekularne biologije. Proizvodnja cepiv, nadomestitev organov, terapije s matičnimi celicami, raziskave raka in še mnogo več bodo imele velike koristi od nadaljnjih napredkov na področju gojenja primarnih celic.

Nasveti in triki za kultiviranje primarnih celic

Potrebe po razmnoževanju celic

Najpogostejši načini gojenja primarnih celic sta v suspenziji ali na površini (2D). Nekatere celice se lahko prosto gibljejo v krvnem obtoku, ne da bi se kdajkoli prilepile na površino (na primer tiste, pridobljene iz periferne krvi). Razvite so bile različne celične linije, ki uspevajo v suspenzijskih kulturah, kjer lahko dosežejo gostote, nedosegljive v 2D rastnih pogojih. Primarne celice, ki za rast in vitro potrebujejo pritrditev, se imenujejo adhezivne celice in vključujejo tiste, ki jih najdemo v trdnih tkivih. Za izboljšanje adhezijskih lastnosti in zagotavljanje drugih signalov, potrebnih za rast in diferenciacijo, se te celice običajno gojijo v ravni, neprevlečeni plastični posodi, včasih pa tudi na mikro-nosilcu. Ta zadnja možnost je lahko prevlečena s proteini ekstracelularne matrice (kot sta kolagen in laminin). Medij, ki se uporablja v celični kulturi, je sestavljen iz osnovnega medija, ki je bil dopolnjen z ustreznimi rastnimi faktorji in citokini. Celični inkubator je posebna vrsta laboratorijskega inkubatorja, ki se uporablja za gojenje in vzdrževanje celic pri določeni temperaturi in mešanici plinov (običajno 37 °C, 5 % CO₂ za sesalske celice). Optimalni pogoji se lahko zelo razlikujejo glede na vrsto gojenih celic. Glede na vrste gojenih celic bo optimalno gojišče vsebovalo edinstveno kombinacijo dejavnikov, vključno z, vendar ne omejeno na, pH, koncentracijo glukoze, rastne faktorje in prisotnost drugih hranilnih snovi.

Antibiotiki v gojišču so ključnega pomena med vzpostavljanjem primarne kulture, da se prepreči kontaminacija iz gostiteljskega tkiva. Nekateri antibiotiki vključujejo kombinacijo gentamicina, penicilina, streptomicina in amfotericina B. Uporaba antibiotikov za daljše časovno obdobje pa ni priporočljiva, saj so nekatera zdravila (kot je amfotericin B) dolgoročno lahko toksična za celice.

Večina primarnih celic po določenem številu podvojitev populacije preide v senescenco in preneha z delitvijo, zato je ključnega pomena, da jih po izolaciji ohranimo pri življenju. Dolgoročna vitalnost celic zahteva strokovne tehnike gojenja celic in idealne pogoje gojenja (vključno s primernim gojiščem, primerno temperaturo, primerno plinsko mešanico, primernim pH, primerno koncentracijo rastnih faktorjev, prisotnostjo hranil in prisotnostjo glukoze). Ker se mnogi rastni faktorji, ki se uporabljajo za dopolnjevanje gojišč, pridobivajo iz živalske krvi (sestavine, pridobljene iz krvi, lahko povzročijo kontaminacijo), se priporoča, da se njihova uporaba zmanjša na minimum ali se ji v celoti izogne. Prav tako je pomembno uporabljati aseptično tehniko.

Subkultiviranje in vzdrževanje

Ko se izolirane celice prilepijo na površino kultivacijske posode, se začne faza vzdrževanja. Prilepitev se običajno zgodi 24 ur po začetku gojenja. Celice je treba subkultivirati, ko dosežejo določen odstotek konfluence in se aktivno razmnožujejo. Ker se lahko celice po doseganju konfluence diferencirajo in po pasazu kažejo počasnejšo proliferacijo, je najbolje subkultivirati primarne celične kulture, preden dosežejo 100-odstotno konfluenco.

Subkultiviranje v svežih gojiščih ohranja eksponentno rast celic, odvisnih od pritrditve. Subkultiviranje monosloj prekinja medcelične in intracelularne interakcije na celični površini. Za izolacijo adhezivnih primarnih celic iz monosloj ali tkiv se uporabljajo nizke koncentracije proteolitičnih encimov, kot sta tripsin/EDTA. Po disociaciji in razredčitvi v raztopino posameznih celic se celice preštejejo in prenesejo v sveže kultivacijske posode, kjer se ponovno pritrdijo in razmnožijo.

Krioprezervacija in obnovitev

Krioprezervacija ohranja žive celice z zamrzovanjem pri nizkih temperaturah. Krioprezervacija in odmrzovanje človeških primarnih celic preprečujeta celično smrt in poškodbe med shranjevanjem in uporabo. Človeške primarne celice se zaščitijo pred zamrzovanjem z DMSO ali glicerolom (pri pravilni temperaturi in s kontrolirano hitrostjo zamrzovanja). Postopek zamrzovanja mora potekati postopoma, s hitrostjo -1 °C na minuto, da se prepreči nastajanje lednih kristalov. Za dolgoročno shranjevanje je potreben tekoči dušik (-196 °C) ali temperature pod -130 °C.

Za odmrzovanje krioprezerviranih celic je dovolj, da zamrznjene celice potopimo v vodno kopel s temperaturo 37 °C za približno 1 do 2 minuti. Primarne človeške celice se po odmrzovanju iz zamrzovalnika ne smejo centrifugirati (ker so izredno občutljive na poškodbe med obnovo po krioprezervaciji). Primerno je za posaditev celic takoj po odmrznitvi, kar spodbuja njihovo prirastanje v kulturah v prvih 24 urah po posaditvi. 1 Ko se krioprezervirane primarne celice prirastejo, je treba odstraniti izrabljeno gojišče (saj je DMSO škodljiv za primarne celice in lahko povzroči zmanjšanje njihove vitalnosti po odmrznitvi).