Primarne človeške celice

Kaj so človeške primarne celice?

Primarne celice so najčistejši primerki svojih tkiv. Izolirane so iz tkiva in obdelane tako, da se lahko ustalijo v okolju kulture z idealnimi pogoji. Bolj posnemajo stanje in vivo in kažejo normalno fiziologijo, ker so pridobljene iz tkiva in ne spremenjene. Zaradi tega so lahko uporabni modeli za raziskave celične farmakologije, toksikologije in fiziologije (vključno s študijami metabolizma, staranja in prenosa signalov). Upoštevajte, da je primarne celice težje gojiti in vzdrževati kot neprekinjene celične linije, saj imajo krajšo življenjsko dobo in se po določenem številu celičnih delitev prenehajo deliti (ali zastarajo). Študije celičnih signalnih poti otežuje variabilnost primarnih celic, pridobljenih od darovalcev in s postopki subkulture. Pred začetkom študij signalizacije raziskovalci pogosto opravijo pregled, da ugotovijo, ali se celice odzivajo na pogosto uporabljene dražljaje. Da bi se izognili izgubi časa in denarja, je mogoče primarne celice pred pregledom stimulirati, da aktivirajo glavne signalne poti.

Zakaj uporabljati človeške primarne celice?

Za testiranje celic se običajno uporabljajo imortalizirane celične linije. Čeprav so znanstveniki priznali, da so lahko biološke spremembe zaradi celičnih linij škodljive pri preučevanju njihovega fiziološkega pomena. Uporaba človeških primarnih celic izboljša fiziološko vrednost podatkov, pridobljenih s celičnimi kulturami, in vse bolj velja, da so pomembne za preučevanje bioloških procesov, napredovanja bolezni in razvoja zdravil.

Človeške primarne celice se pogosto uporabljajo pri in vitro študijah medcelične in znotrajcelične komunikacije, razvojne biologije ter mehanizmov, ki so osnova raka, Parkinsonove bolezni in sladkorne bolezni, med številnimi drugimi predkliničnimi in raziskovalnimi biološkimi področji. Raziskovalci že dolgo uporabljajo imortalizirane celične linije za preučevanje delovanja tkiv; vendar celične linije z očitnimi mutacijami in kromosomskimi nepravilnostmi morda niso dobri nadomestki za normalne celice in razvoj bolezni v zgodnjih fazah. Natančnejši model določene celične vrste tkiva je zdaj mogoče doseči z uporabo človeških primarnih celic, izoliranih iz tega tkiva in vzdrževanih v primarnih celičnih gojiščih in dodatkih.

Kaj je primarna celična kultura?

Namesto uporabe imortaliziranih celičnih linij primarna celična kultura vključuje gojenje celic neposredno iz večceličnega organizma zunaj telesa. V nekaterih državah, na primer v Združenem kraljestvu, je pravno priznano, da so primarne celične kulture bolj reprezentativne za tkiva in vivo kot celične linije. Kljub temu primarne celice za rast potrebujejo ustrezen substrat in hranila, po določenem številu delitev pa razvijejo senescentni fenotip, zaradi katerega se trajno prenehajo deliti. Ta dva dejavnika spodbujata ustvarjanje celičnih linij. Tako naravno imortalizirane primarne celice (npr. celice HeLa) kot umetno imortalizirane primarne celice (npr. celice HEK) je mogoče v celičnih kulturah gojiti neomejeno dolgo.

Človeške primarne celice po vrstah tkiv

Epitelijske celice, fibroblasti, keratinociti, melanociti, endotelne celice, mišične celice, imunske celice in matične celice, kot so mezenhimske matične celice, so med najpogosteje uporabljenimi človeškimi primarnimi celicami v znanstvenih študijah. Za začetek so kulture heterogene (predstavljajo mešanico celičnih tipov, ki so prisotni v tkivu) in jih je mogoče ohraniti pri življenju in vitro le določen čas. Transformacija je postopek in vitro, ki omogoča manipulacijo s človeškimi primarnimi celicami za neomejeno število subkultur. Transformacija lahko poteka naravno ali pa jo povzročijo kemikalije ali virusi. Po genskem preoblikovanju se lahko primarna kultura v neskončnost deli v nesmrtno sekundarno celično linijo, če ima na voljo dovolj hranil in prostora.

Endotelijske celice

Zdravljenje raka, celjenje ran, raziskave celičnih signalov, visoko zmogljivi in visoko vsebnostni pregledi ter toksikološki pregledi so le nekatera od področij, ki jim lahko koristi uporaba primarnih endotelijskih celic kot raziskovalnega orodja.

Keratinociti

Keratinociti, pridobljeni iz epidermisa odrasle človeške kože ali novorojenčkove presredka, imajo ključno vlogo pri preučevanju kožnih bolezni, kot sta luskavica in rak.

Epitelijske celice

Primarne epitelne celice so se izkazale za neprecenljiv vir za modeliranje naravne obrambe telesa, od študij raka do toksikoloških preiskav.

Fibroblasti

Induciranje pluripotentnih matičnih celic (iPS) in preučevanje celjenja ran je le nekaj od številnih načinov uporabe primarnih fibroblastov.

Imunske celice

Mononuklearne celice periferne krvi, krajše PBMC, so enojedrne celice krvi z okroglim celičnim jedrom. V glavnem vključujejo limfocite in monocite, ki med imunskim odzivom prevzamejo pomembne funkcije. Mononuklearne celice periferne krvi se pogosto uporabljajo za diagnosticiranje okužb ali odkrivanje morebitne zaščite pred cepljenjem. Vpogled v celični imunski odziv, ki ga posredujejo celice T, je pogosto ključnega pomena.

Melanociti

Melanociti, specializirane kožne celice, ki proizvajajo pigment melanin, so koristni kot modeli za raziskave tem, kot so celjenje ran, toksičnost, melanom, odziv kože na ultravijolično (UV) sevanje, kožne bolezni in kozmetika.

Matične celice

Matične celice se lahko diferencirajo v najrazličnejše vrste celic. Zaradi svoje sposobnosti diferenciacije ponujajo nove možnosti za modeliranje človeških tkiv in zdravstvenih stanj.

Mezenhimske matične celice

Mezenhimske matične celice, znane tudi kot MSC, je mogoče pridobiti iz različnih človeških virov, kot so kostni mozeg, maščoba (maščobno tkivo), tkivo popkovnice (Whartonov žele) in amnijska tekočina (tekočina, ki obdaja plod), ter jih je mogoče razširiti in vitro. Te odrasle stromalne matične celice se lahko razvijejo v najrazličnejše vrste celic. Nekatere od teh vrst celic vključujejo celice kosti, hrustanca, mišic, živčnih celic, kože in roženice.

Gladke mišične celice

V votlih organih primarne gladke mišične celice (SMC) oblikujejo notranjost in posredujejo pri krčljivosti. Poleg raka in drugih bolezni se lahko SMC uporabljajo za modeliranje hipertenzivne fibroze.

Primarne celice in celične linije

Bodisi s spontano mutacijo, kot pri transformiranih celičnih linijah raka, bodisi z namernim spreminjanjem, kot pri umetni proizvodnji genov raka, so kontinuirane celične linije pridobile možnost neskončnega razmnoževanja (imortalizacija). Neprekinjene celične linije so praviloma zanesljivejše in priročnejše za uporabo kot primarne celice. Lahko se širijo v nedogled in omogočajo hiter dostop do bistvenih podatkov. Uporaba kontinuiranih celičnih linij ima nekatere omejitve, med drugim dejstvo, da so gensko spremenjene/transformirane, kar lahko spremeni fiziološke lastnosti in ne ustreza stanju in vivo, ter da se to lahko sčasoma še dodatno spremeni s precejšnjim prehodom.

Napredek pri gojenju primarnih celic

Primarne celice so znane po tem, da je z njimi težko delati. Vendar je postopek zaradi razvoja na področju primarnih celičnih kultur, razpoložljivosti komercialnih primarnih celic s popolnoma optimiziranimi protokoli in novih analiznih tehnik, ki zahtevajo manj vložka, lažji kot kdaj koli prej.

Prehod z dvodimenzionalnih na tridimenzionalne celične kulture velja za pomemben mejnik na tem področju. V dvodimenzionalni kulturi so lahko oslabljeni tkivno specifična arhitektura, interakcije med celicami in mehanski/biokemični signali. Zato je biološka vrednost teh kultur omejena.

Po drugi strani pa 3D celična kultura omogoča celicam, da se razširijo in medsebojno delujejo s 3D zunajceličnim ogrodjem. To celicam omogoča medsebojno interakcijo in interakcijo z zunajceličnim matriksom, zaradi česar so 3D kulture fiziološko ustreznejše. Zaradi natančnosti te metode pri napovedovanju odzivov in vivo je postala revolucionarna na področjih, kot sta odkrivanje in razvoj zdravil. Zaradi tega najsodobnejše tehnologije, kot so organoidi, pridobljeni iz bolnikov, in organi na čipu, zagotavljajo zelo kontekstualne modele za pregledovanje in razvoj zdravil.

Ustvarjanje primarnih celic je ozko grlo pri primarnih kulturah. Za premagovanje te težave je običajno potrebna večja količina tkiva, kar je lahko izziv. Vendar pa izboljšana analitična občutljivost omogoča napredek. Potreba po gojenju velikih količin primarnih celic se na primer zmanjša z uporabo tehnologije posameznih celic, ki vključuje sekvenciranje, western blotting in masno citometrijo.

Obetavni obeti za gojenje primarnih celic

Splošne težave pri gojenju primarnih celic se zmanjšujejo s tehnološkim napredkom. Ta metoda hitro nadomešča druge kot zlati standard v študiju in praksi celične in molekularne biologije. Proizvodnja cepiv, zamenjava organov, zdravljenje z matičnimi celicami, raziskave raka in še veliko več bodo imeli veliko koristi od stalnega napredka na področju primarnih celičnih kultur.

Nasveti in triki za gojenje primarnih celic

Potrebe po širjenju celic

Dve najpogostejši metodi gojenja primarnih celic sta v suspenziji ali na površini (2D). Nekatere celice lahko prosto plavajo v krvnem obtoku, ne da bi se kdaj prilepile na površino (na primer celice, pridobljene iz periferne krvi). Različne celične linije so bile oblikovane tako, da uspevajo v suspenzijskih kulturah, kjer lahko dosežejo gostoto, ki je v 2D pogojih rasti ni mogoče doseči. Primarne celice, ki za rast in vitro potrebujejo sidrišče, se imenujejo adherentne celice in vključujejo tiste, ki jih najdemo v trdnih tkivih. Za izboljšanje adhezijskih lastnosti in zagotavljanje drugih signalov, potrebnih za rast in diferenciacijo, se te celice običajno gojijo v ploščati neprevlečeni plastični posodi, občasno pa tudi v mikronosilcu. Ta je lahko prevlečen z beljakovinami zunajceličnega matriksa (kot sta kolagen in laminin). Medij, ki se uporablja pri gojenju celic, je sestavljen iz osnovnega medija, ki je bil dopolnjen z ustreznimi rastnimi dejavniki in citokini. Celični inkubator je posebna vrsta laboratorijskega inkubatorja, ki se uporablja za gojenje in vzdrževanje celic pri določeni temperaturi in mešanici plinov (običajno 37 °C, 5 % CO2 za celice sesalcev). Odvisno od vrste gojenih celic so lahko optimalni pogoji zelo različni. Odvisno od vrste celic, ki se gojijo, bo optimalno gojišče za rast vsebovalo edinstveno kombinacijo dejavnikov, med drugim pH, koncentracijo glukoze, rastne dejavnike in prisotnost drugih hranil.

Antibiotiki v rastnem gojišču so ključnega pomena med vzpostavitvijo primarne kulture, da se prepreči kontaminacija iz gostiteljskega tkiva. Nekateri antibiotični režimi vključujejo kombinacijo gentamicina, penicilina, streptomicina in amfotericina B. Vendar se uporaba antibiotikov za daljše časovno obdobje ne priporoča, ker so lahko nekateri reagenti (kot je amfotericin B) dolgoročno toksični za celice.

Večina primarnih celic po določenem številu podvojitev populacije preide v senescenco in se preneha deliti, zato je ključnega pomena, da jih po izolaciji ohranimo pri življenju. Za dolgoročno preživetje celic so potrebne strokovne tehnike gojenja celic in idealni pogoji gojenja (vključno s pravim gojiščem, pravo temperaturo, pravo mešanico plinov, pravim pH, pravo koncentracijo rastnih dejavnikov, prisotnostjo hranil in prisotnostjo glukoze). Ker so številni rastni dejavniki, ki se uporabljajo za dopolnjevanje gojišč, pridobljeni iz živalske krvi (sestavine, pridobljene iz krvi, imajo možnost kontaminacije), je priporočljivo, da se njihova uporaba zmanjša ali popolnoma izogne. Prav tako je pomembno, da uporabljate aseptično tehniko.

Subkultura in vzdrževanje

Ko se izolirane celice prilepijo na površino posode za gojenje, se začne faza vzdrževanja. Do pritrditve običajno pride 24 ur po začetku gojenja. Celice je treba subkultivirati, ko dosežejo določen odstotek konfluence in se aktivno razmnožujejo. Ker lahko postkonfluentne celice po prehodu doživijo diferenciacijo in se počasneje razmnožujejo, je najbolje primarne celične kulture subkultivirati, preden dosežejo 100-odstotno konfluenco.

Subkultiviranje v svežih medijih ohranja eksponentno rast celic, ki so odvisne od sidrišča. Podkultivacija monoslojev prekine medcelične in znotrajcelične interakcije na površini celic. Nizke koncentracije proteolitičnih encimov, kot je tripsin/EDTA, se uporabljajo za ekstrakcijo adherentnih primarnih celic iz monoslojev ali tkiv. Ko so disociirane in razredčene v enocelično raztopino, se celice preštejejo in prenesejo v sveže posode za gojenje, da se ponovno povežejo in razmnožijo.

Kriokonzervacija in obnova

Krioprezervacija ohranja žive celice tako, da jih zamrzne pri nizkih temperaturah. Kriokonzervacija in odtaljevanje človeških primarnih celic preprečujeta celično smrt in poškodbe med shranjevanjem in uporabo. Človeške primarne celice se krioprotektivirajo z uporabo DMSO ali glicerola (pri ustrezni temperaturi in nadzorovani hitrosti zamrzovanja). Postopek zamrzovanja mora biti postopen, pri -1 °C vsako minuto, da se prepreči nastanek ledenih kristalov. Za dolgoročno shranjevanje je potreben tekoči dušik (-196 °C) ali temperature pod -130 °C.

Za odmrznitev kriokonzerviranih celic zadostuje, če jih za približno 1 do 2 minuti potopite v vodno kopel s temperaturo 37 °C. Človeških primarnih celic po odmrznitvi iz zamrzovalnika ne smete centrifugirati (ker so med obnovo po kriokonzervaciji izjemno občutljive na poškodbe). Primeren je za plasiranje celic takoj po odmrznitvi, v prvih 24 urah po plasiranju pa spodbuja pritrjevanje v kulturah. 1 Ko se kriokonzervirane primarne celice pritrdijo, je treba odstraniti porabljeno gojišče (ker je DMSO škodljiv za primarne celice in lahko povzroči upad vitalnosti po odmrznitvi).