Kultura sesalskih celic: Osnove in tehnike: celične celice: osnove in tehnike
Kultura sesalskih celic je temeljna tehnika bioloških raziskav, ki znanstvenikom omogoča preučevanje celic v nadzorovanem okolju zunaj živih organizmov. Ta postopek vključuje izolacijo celic iz tkiv, njihovo vzdrževanje v skrbno nadzorovanih pogojih in razmnoževanje za različne eksperimentalne namene. Celične kulture sesalcev so ključne za razumevanje celičnih procesov, mehanizmov bolezni in razvoj novih terapij, vključno s tistimi, ki uporabljajo nesmrtne celične linije
Ključne ugotovitve:
- Celice lahko izoliramo iz tkiv z uporabo encimske razgradnje ali metod eksplantacijske kulture
- Primarne celice imajo omejeno življenjsko dobo, medtem ko se lahko nesmrtne celične linije razmnožujejo neomejeno dolgo
- Pogoji gojenja, vključno s sestavo rastnega medija, so ključni za preživetje in razmnoževanje celic
- Celice lahko gojimo v suspenziji ali kot adherentne kulture, odvisno od njihove vrste in raziskovalnih potreb
- Običajna gojišča vključujejo MEM, DMEM in RPMI 1640, ki so prilagojena določenim tipom celic
- Običajni pogoji rasti vključujejo temperaturo 37 °C, 5 % CO2 in 95 % relativno vlažnost
- Da bi se izognili morebitnim težavam s kontaminacijo, se vse pogosteje uporabljajo nadomestni serumi, kot je človeški trombocitni lizat (hPL)
Tehnike izolacije celic
Postopek vzpostavitve celične kulture se začne z izolacijo celic iz tkiv. Za to obstaja več metod, ki so primerne za različne vrste tkiv in raziskovalne cilje. Pri vzorcih krvi je izolacija celic razmeroma preprosta, pri čemer so bele krvničke zaradi svoje sposobnosti rasti glavni cilj za gojenje. Trdna tkiva zahtevajo bolj zapletene tehnike izolacije. Ena od običajnih metod vključuje encimsko razgradnjo, pri kateri se encimi, kot so kolagenaza, tripsin ali pronaza, uporabijo za razgradnjo zunajceličnega matriksa, pri čemer se posamezne celice sprostijo v suspenzijo. Raziskovalci lahko uporabijo tudi metodo eksplantacijske kulture, pri kateri se majhni koščki tkiva dajo neposredno v rastno gojišče, kar omogoči celicam, da se izselijo in razmnožujejo. Izbira med temi metodami je pogosto odvisna od določene vrste tkiva, želene populacije celic in predvidene eksperimentalne uporabe. Pomembno je opozoriti, da se celice, izolirane neposredno iz organizma, imenujejo primarne celice in imajo, z nekaterimi izjemami, kot so celice tumorskega izvora, običajno omejeno življenjsko dobo v kulturi, preden začnejo starati
Bistveni izdelki za gojenje celic sesalcev
| Ime izdelka | Številka izdelka | Kategorija | Uporaba |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/L glukoze, w: 4 mM L-glutamina, w: 1,5 g/L NaHCO3, w: 1,0 mM natrijevega piruvata | 820300a | Mediji za gojenje | Splošno namensko gojišče za različne tipe celic sesalcev |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L glukoze, w: 1,6 mM L-glutamina, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM natrijevega piruvata, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Medij za gojenje | Primerno za široko paleto celic sesalcev, zlasti epitelijskih celic |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabilnega glutamina, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Medij za gojenje | Običajno se uporablja za limfoidne celice in hibridne celične linije |
| Accutase | 830100 | Disociacija celic | Raztopina za nežno ločevanje celic za adherentne celice |
| Sredstvo za zamrzovanje CM-1 | 800150 | Krioprezervacija | Za zamrzovanje in dolgoročno shranjevanje celic sesalcev |
| Sredstvo za zamrzovanje CM-ACF, brez seruma | 800650 | Krioprezervacija | Gojišče brez živalskih sestavin za zamrzovanje celic |
| PBS | 860015 | Pufrska raztopina | Za izpiranje celic in vzdrževanje ravnovesja pH |
| Sredstvo za rast endotelijskih celic | 820731 | Specializirano gojišče | Optimizirano za gojenje endotelijskih celic |
| Testiranje na mikoplazme | 900159 | Nadzor kakovosti | Bistveno za odkrivanje kontaminacije z mikoplazmo v kulturah |
| Preverjanje pristnosti celičnih linij - človeške | 900154 | Nadzor kakovosti | Preverja identiteto človeških celičnih linij |
Ta preglednica predstavlja izbor bistvenih izdelkov za celične kulture sesalcev. Celotno ponudbo izdelkov za celične kulture, vključno s specializiranimi gojišči in reagenti, najdete na strani s kategorijo Gojišča in reagenti.
- nežna alternativa tripsinu
Accutase je raztopina za ločevanje celic, ki revolucionarno spreminja industrijo celičnih kultur. Je mešanica proteolitičnih in kolagenolitičnih encimov, ki posnema delovanje tripsina in kolagenaze. Za razliko od tripsina Accutase ne vsebuje sesalskih ali bakterijskih sestavin in je do celic veliko nežnejša, zato je idealna rešitev za rutinsko ločevanje celic s standardne plastične posode za tkivne kulture in plastične posode z adhezijsko prevleko. V tem prispevku bomo raziskali prednosti in uporabo Accutase ter kako spreminja pravila igre v celičnih kulturah.
Prednosti Accutase
Accutase ima več prednosti pred tradicionalnimi raztopinami tripsina. Prvič, uporablja se lahko, kadar koli je potrebna nežna in učinkovita ločitev katere koli adherentne celične linije, zato je neposredna zamenjava za tripsin. Drugič, Accutase zelo dobro deluje na embrionalnih in nevronskih matičnih celicah in dokazano ohranja vitalnost teh celic po prehodu. Tretjič, Accutase ohrani večino epitopov za kasnejšo analizo s pretočno citometrijo, zaradi česar je idealna za analizo označevalcev celične površine.
Poleg tega Accutase ni treba nevtralizirati, ko se prenašajo adherentne celice. Dodajanje večje količine medija po razdelitvi celic razredči Accutase, tako da ta ne more več ločiti celic. S tem odpade potreba po postopku inaktivacije, tehniki celičnih kultur pa prihranijo čas. Accutase ni treba alikvotno odmerjati, steklenička pa je v hladilniku stabilna 2 meseca.
Uporaba Accutase
Accutase je neposreden nadomestek za raztopino tripsina in se lahko uporablja za pasažiranje celičnih linij. Poleg tega se Accutase dobro obnese pri ločevanju celic za analizo številnih označevalcev celične površine s pretočno citometrijo in za sortiranje celic. Druge nadaljnje uporabe obdelave z Accutase vključujejo analizo celičnih površinskih označevalcev, testiranje rasti virusov, proliferacijo celic, teste migracije tumorskih celic, rutinsko prehajanje celic, povečanje proizvodnje (bioreaktor) in pretočno citometrijo.
Sestava zdravila Accutase
Accutase ne vsebuje sesalskih ali bakterijskih sestavin in je naravna mešanica encimov s proteolitično in kolagenolitično encimsko aktivnostjo. Sestavljena je v veliko nižji koncentraciji kot tripsin in kolagenaza, zato je manj toksična in nežnejša, vendar enako učinkovita.
Učinkovitost zdravila Accutase
Dokazano je, da je akutaza učinkovita pri ločevanju primarnih in matičnih celic ter ohranjanju visoke vitalnosti celic v primerjavi z encimi živalskega izvora, kot je tripsin. po 10 minutah se obnovi 100 % celic, zaradi avtodigestije v kislini Accutase pa ni škode, če celice pustite v kislini Accutase do 45 minut.
Če povzamemo
Accutase je učinkovita rešitev, ki spreminja pravila igre na področju celičnih kultur. Zaradi svoje nežne narave, učinkovitosti in vsestranskosti je Accutase idealna alternativa tripsinu. Če iščete zanesljivo in učinkovito rešitev za ločevanje celic, je Accutase prava rešitev za vas.
S fosfatom puferirana fiziološka raztopina (PBS) je široko uporabljena puferska raztopina v bioloških in kemijskih raziskavah. Ima ključno vlogo pri ohranjanju ravnovesja pH in osmolarnosti med različnimi eksperimentalnimi postopki, vključno z obdelavo tkiv in gojenjem celic. Naša raztopina PBS je skrbno pripravljena iz sestavin visoke čistosti, kar zagotavlja stabilnost in zanesljivost pri vsakem poskusu. Osmolarnost in koncentracije ionov v naši raztopini PBS natančno posnemajo tiste v človeškem telesu, zato je izotonična in nestrupena za večino celic.
Sestava naše raztopine PBS
Naša raztopina PBS je mešanica fosfatnih pufrov in fizioloških raztopin ultračiste kakovosti, ki ji je prilagojen pH. V 1-kratni delovni koncentraciji vsebuje:
8000 mg/L natrijevega klorida (NaCl)
200 mg/L kalijev klorid (KCl)
1150 mg/L natrijev fosfat dvodazni brezvodni (Na2HPO4)
200 mg/L Kalijev fosfat enobazni brezvodni (KH2PO4)
Ta sestava zagotavlja optimalno pH in ionsko ravnovesje, primerno za širok spekter bioloških aplikacij.
Uporaba naše raztopine PBS
Naša raztopina PBS je idealna za različne aplikacije v bioloških raziskavah. Zaradi izotoničnih in netoksičnih lastnosti je primerna za redčenje snovi in izpiranje celičnih posod. Raztopine PBS, ki vsebujejo EDTA, so učinkovite za odstranjevanje pritrjenih in zlepljenih celic. Vendar se PBS ne sme dodajati dvovalentnih kovin, kot je cink, saj lahko povzroči obarjanje. V takih primerih se priporočajo Goodovi pufri. Poleg tega je naša raztopina PBS sprejemljiva alternativa mediju za prenos virusov za prenos in shranjevanje virusov RNA, vključno z virusom SARS-CoV-2.
Nadzor kakovosti
Sterilno filtriran
Shranjevanje in rok uporabnosti
Shranjujte pri temperaturi od +2 °C do +25 °C, zaščiteni pred svetlobo.
Po odprtju hranite pri temperaturi od 2 °C do 25 °C in porabite v 24 mesecih.
Pogoji pošiljanja
Temperatura okolja
Vzdrževanje
Hranite v hladilniku pri temperaturi od +2 °C do +8 °C v temi. Izogibajte se zamrzovanju in pogostemu segrevanju na +37 °C, saj to zmanjša kakovost izdelka.
Medija ne segrevajte nad 37 °C in ne uporabljajte nenadzorovanih virov toplote, kot so mikrovalovne naprave.
Če želite uporabiti le del medija, pred uporabo odstranite potrebno količino in jo segrejte na sobno temperaturo.
Sestava
Kategorija
Sestavine
Koncentracija (mg/L)
Soli
Kalijev klorid
200
Kalijev fosfat monobazni brezvodni
200
Natrijev klorid
8000
Natrijev fosfat dvobazni brezvodni
1150
Analitična metoda
Podjetje CLS ponuja tako kratkoročno kot dolgoročno testiranje za odkrivanje mikoplazme. V prvem primeru se vzorci testirajo takoj po prispetju, v drugem pa se začne gojenje celične kulture in celice se testirajo po 14 dneh gojenja brez antibiotikov. Testiranje na mikoplazme se izvaja z dvotočkovnim sistemom odkrivanja s kompletom za odkrivanje mikoplazme PlasmoTest™ (Invivogen) in kompletom Certus QC
- mycoADVANCED (Certus).
Vzorci
Za hitri test zagotovite najmanj 50 µl celične suspenzije, ki vsebuje 50 000 celic. Celično suspenzijo lahko pošljete pri sobni temperaturi.
Za test Premium zagotovite najmanj 1 milijon celic v ustreznem zamrzovalnem gojišču, da zagotovite trdno in zdravo kulturo za gojenje in poznejše testiranje celic. Vzorce pošljite v suhem ledu.
Izpolnite obrazec za vzorec za testiranje mikoplazme in ga priložite pošiljki vzorcev.
Kolorimetrični poročevalski test
Ta test je kolorimetrični test, ki temelji na celicah. V prisotnosti mikoplazme reporterska celična linija inducira signalno kaskado, ki sproži spremembo barve medija iz rdeče v modro. Preskus se izvaja v 96-delčnih večkotličnih ploščah. Signali se zaznavajo v spektrofotometru za mikroplošče pri 620-655 nm. Zaznamo vse vrste mikoplazme in aholeplazme, pa tudi druge kontaminante v celičnih kulturah, kot so bakterije.
Izotermno pomnoževanje
Izotermalna amplifikacija je hiter in zanesljiv test, ki temelji na izotermalni amplifikaciji za mikoplazmo specifične DNK v kombinaciji z detekcijo v realnem času z uporabo barvila, ki interkalira DNK. S testom je mogoče odkriti šest najpogostejših vrst, ki predstavljajo > 95 % kontaminacij: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis in A.laidlawii. Zaradi homologije zaporedja bodo zaznane tudi druge vrste mikoplazme (M.pneumoniae, M.gallisepticum in M.synoviae). Da bi ugotovili, ali je vzorec pozitiven ali negativen na mikoplazmo, preučimo temperaturo taljenja (Tm).
Zaključek: Ključna vloga kulture sesalskih celic v sodobnih raziskavah
Celične kulture sesalcev so revolucionarno spremenile biološke in medicinske raziskave, saj so znanstvenikom na voljo učinkovita orodja za preučevanje kompleksnih celičnih procesov, mehanizmov bolezni in morebitnih terapevtskih posegov. Ta tehnika je postala nepogrešljiv del sodobnega znanstvenega orodja, od izolacije primarnih celic do razvoja nesmrtnih celičnih linij
Potovanje kulture sesalskih celic se začne s skrbnimi tehnikami izolacije, nadaljuje s skrbnim vzdrževanjem celic v specializiranih medijih in se konča s široko paleto aplikacij na različnih študijskih področjih. Ne glede na to, ali gre za raziskave raka, odkrivanje zdravil ali osnovno celično biologijo, je zmožnost gojenja in manipuliranja sesalskih celic in vitro odprla poti za znanstveno raziskovanje brez primere
Ključ do uspeha gojenja sesalskih celic so skrbno nadzorovani pogoji, v katerih se celice vzdržujejo. Od sestave gojišč do natančnih okoljskih parametrov v inkubatorjih - vsak vidik je optimiziran, da čim bolj posnema naravne pogoje celic. Ta pozornost do podrobnosti zagotavlja zanesljivost in ponovljivost poskusov, kar je temelj dobre znanstvene prakse
Razvoj imortaliziranih celičnih linij, kot so široko uporabljene celice HeLa, je še dodatno razširil možnosti celičnih kultur. Te celične linije zagotavljajo dosledne in lahko dostopne celične modele, ki so pospešili raziskave na številnih področjih
V prihodnosti se celične kulture sesalcev še naprej razvijajo. Napredek pri tehnikah 3D-kulture, razvoju organoidov in uporabi kemično opredeljenih medijev premika meje mogočega v celični kulturi. Ta razvoj obeta, da se bodo modeli in vitro še bolj približali kompleksnosti sistemov in vivo, kar lahko povzroči revolucijo pri odkrivanju zdravil, personalizirani medicini in našem razumevanju človeške biologije
Skratka, celične kulture sesalcev ostajajo dinamična in bistvena tehnika v raziskavah znanosti o življenju. Njeno nadaljnje izpopolnjevanje in uporaba bosta nedvomno imela ključno vlogo pri reševanju nekaterih najbolj perečih vprašanj v biologiji in medicini, kar bo v prihodnjih letih spodbujalo znanstveni napredek