Bioprinting s celičnimi linijami: Od 2D do 3D tiskanih tkivnih konstrukcij

Tridimenzionalni biotisk predstavlja revolucionarno tehnologijo, ki omogoča natančno prostorsko nanašanje živih celic, biomaterialov in bioaktivnih molekul za izdelavo tkivnih konstrukcij z določeno arhitekturo, ki povzema naravno organizacijo tkiva. V podjetju Cytion se zavedamo, da imajo uveljavljene celične linije v primerjavi s primarnimi celicami za aplikacije bioprintinga pomembne prednosti, vključno z neomejeno zmogljivostjo širjenja, dobro opisanim vedenjem, dosledno kakovostjo in manjšimi etičnimi omejitvami. Prehod s tradicionalne dvodimenzionalne enoslojne kulture na tridimenzionalne biotiskane konstrukcije z uporabo celic in celičnih linij zahteva skrbno preučitev formulacije biološkega črnila, metodologije tiskanja, odzivov celic na mehanske obremenitve med nanašanjem in protokolov zorenja po tiskanju. Ta napredni proizvodni pristop omogoča izdelavo kompleksnih tkivnih modelov za presejanje zdravil, modeliranje bolezni in temeljne biološke raziskave z nadzorom nad celično sestavo, prostorsko organizacijo in mikroarhitekturnimi značilnostmi brez primere.

Formulacija in reološke lastnosti biološkega črnila

Formulacija bioinkov predstavlja najbolj kritičen dejavnik, ki določa uspešnost biotiskanja, saj zahteva skrbno ravnovesje med lastnostmi tiskanja, združljivostjo s celicami in strukturno celovitostjo po tiskanju. Idealne bioinke se obnašajo kot strižno redčenje, pri čemer se viskoznost med iztiskanjem zmanjšuje pod strižno obremenitvijo, nato pa se hitro obnovi pri odlaganju, da se ohrani zvestoba natisnjene strukture. Viskoznost običajno znaša od 30 do 6 × 10⁷ mPa-s, odvisno od metodologije tiskanja, pri čemer sistemi, ki temeljijo na ekstrudiranju, zahtevajo večjo viskoznost (≥ 1000 mPa-s) za ohranitev oblike v primerjavi s pristopi brizgalnega tiska, ki za tvorbo kapljic zahtevajo nizko viskoznost (3-12 mPa-s). Koncentracija celic v bioinkih se običajno giblje od 1 × 10⁶ do 2 × 10⁷ celic na mililiter, pri čemer se uravnoteži zadostna gostota celic za tvorbo tkiva z morebitno zamašitvijo tiskarskih šob in preveliko viskoznostjo materiala. Običajni osnovni materiali za bioink vključujejo alginat, želatino, želatin metakrilat (GelMA), hialuronsko kislino in agarozo, ki so pogosto kombinirani v večkomponentne formulacije za optimizacijo mehanskih lastnosti, kinetike razgradnje in biološke aktivnosti. Za celice in celične linije Cytiona je empirična optimizacija sestave bioink bistvenega pomena, da se prilagodi zahtevam po adheziji, specifičnim za posamezno vrsto celic, in občutljivosti na mehanske obremenitve med tiskanjem.

Sistemi za biotiskanje na osnovi ekstrudiranja

Biotiskanje na osnovi ekstrudiranja je najbolj razširjena tehnologija zaradi relativno nizkih stroškov opreme, združljivosti z visoko viskoznimi bioinki in visokimi gostotami celic ter razširljivosti za izdelavo centimetrskih konstrukcij. Ti sistemi skozi cilindrične šobe s premerom od 100 do 500 mikrometrov razpršijo neprekinjene filamente materiala, napolnjenega s celicami, pri čemer se nanašanje nadzoruje s pnevmatskim pritiskom, mehanskim premikanjem z vijaki ali pogonom na podlagi batov. Glavni problem je strižna napetost, ki jo celice doživljajo med iztiskanjem s šobo, njena velikost pa je odvisna od premera šobe, uporabljenega tlaka in viskoznosti bioinkovine v skladu z načeli mehanike tekočin. Celice občutijo največji strižni stres na steni šobe, kar lahko povzroči poškodbe membrane, zmanjšano sposobnost preživetja in spremenjene profile izražanja genov, če so ti preveliki. Optimizacija zahteva uravnoteženje premera šobe in tlaka iztiskanja, da se doseže želena ločljivost in hkrati ohrani vitalnost celic, ki je običajno nad 80 %. Zmogljivosti večmaterialnega biotiskanja omogočajo hkratno ali zaporedno nanašanje različnih vrst celic in materialov, kar olajša izdelavo heterogenih tkivnih konstrukcij s prostorsko določeno sestavo. Koaksialne konfiguracije šob omogočajo neposredno tiskanje votlih cevastih struktur, uporabnih za vaskularizacijo, pri čemer se osnovni material pozneje odstrani, da se ustvarijo patentirani lumeni, obloženi z endotelijskimi celicami.

Bioprint na osnovi brizgalke in kapljice

Tehnologije brizgalnega tiska, prilagojene komercialnim sistemom za tiskanje dokumentov, omogočajo natančno odlaganje kapljic, ki vsebujejo celice, s prostornino pikolitrov, kar omogoča prostorsko vzorčenje visoke ločljivosti in visoke hitrosti tiskanja, primerne za visoko zmogljive aplikacije. Toplotni brizgalni sistemi ustvarjajo parne mehurčke z uporovnimi grelnimi elementi, ki ustvarjajo tlačne impulze, ki iztisnejo kapljice iz tiskalne glave, medtem ko piezoelektrični sistemi uporabljajo napetostno deformacijo piezoelektričnih kristalov za ustvarjanje akustičnih valov, ki poganjajo kapljice. Pomisleki glede vitalnosti celic so sprva omejevali uporabo pristopov termičnega brizgalnega tiskanja zaradi prehodnih povišanj temperature, vendar optimizirani sistemi kažejo minimalno toplotno škodo, saj se temperature vzdržujejo pod kritičnimi mejnimi vrednostmi, trajanje izpostavljenosti pa je omejeno na mikrosekunde. Piezoelektrični sistemi se izogibajo toplotnim obremenitvam, vendar zahtevajo skrbno nastavitev akustičnih parametrov, da se uravnoteži zanesljivost tvorbe kapljic in mehanske obremenitve celic. Viskoznost biološkega črnila za brizgalne sisteme mora ostati pod približno 12 mPa-s, da se omogoči oblikovanje kapljic, kar omejuje možnosti materialov v primerjavi s pristopi, ki temeljijo na iztiskanju, in običajno zahteva zamreženje po nanosu, da se doseže strukturna stabilnost. Zaradi visoke natančnosti in prepustnosti je brizgalni biotisk še posebej primeren za aplikacije, ki zahtevajo določene prostorske vzorce več vrst celic, kot so modeli skupnih kultur ali ustvarjanje gradienta za presejanje zdravil z uporabo celic HeLa in drugih uveljavljenih celičnih linij.

Bioprint z lasersko podporo in vzorčenje visoke ločljivosti

Lasersko podprto biotiskanje (LAB), imenovano tudi lasersko induciran prenos naprej, dosega najvišjo prostorsko ločljivost med tehnologijami biotiskanja, saj omogoča nanašanje posameznih celic ali majhnih skupin celic z mikrometrsko natančnostjo. Sistem LAB je sestavljen iz pulznega laserskega vira, donorskega stekelca, prevlečenega z materialom, ki absorbira energijo, in biološkega črnila, ki vsebuje celice, ter sprejemnega substrata, ki je nameščen v neposredni bližini pod donorskim stekelcem. Fokusirani laserski impulzi uparijo plast, ki absorbira energijo, in ustvarijo mehurčke pod visokim tlakom, ki z natančnim prostorskim nadzorom poganjajo kapljice, ki vsebujejo celice, z donorskega stekelca na sprejemno podlago. Z optimiziranimi parametri je mogoče doseči ločljivost 10-50 mikrometrov in viabilnost celic, ki presega 95 %, kar je bistveno boljše od drugih načinov bioprintinga. Brezšobna narava sistema LAB odpravlja strižne napetosti, povezane z iztiskanjem, in preprečuje težave z zamašitvijo, ki pestijo sisteme, ki temeljijo na šobah, pri tiskanju celičnih suspenzij z visoko viskoznostjo ali visoko gostoto. Vendar sistemi LAB zahtevajo zapleteno optično opremo in skrbno optimizacijo laserskih parametrov, vključno z valovno dolžino, trajanjem impulza, gostoto energije in velikostjo žarišča, da se uravnoteži zanesljivost tiskanja in vitalnost celic. Zaradi zmožnosti tiskanja celic z ločljivostjo ene celice je sistem LAB še posebej dragocen za aplikacije, ki zahtevajo natančno prostorsko organizacijo, kot so ko-kulture nevronov in glije ali raziskave signalizacije celic na določenih razdaljah.

Stereolitografija in digitalna obdelava svetlobe

Stereolitografija (SLA) in digitalna obdelava svetlobe (DLP) pri biotiskanju uporabljata fotopolimerizacijo po plasteh fotokroslinabilnih hidrogelov s celicami za hitro izdelavo kompleksnih tridimenzionalnih geometrij z ločljivostjo 25-100 mikrometrov. V nasprotju z metodami, ki temeljijo na nanašanju, pri katerih se strukture gradijo z zaporednim nameščanjem materiala, pristopi, ki temeljijo na svetlobi, hkrati zamrežijo celotne plasti, kar bistveno skrajša čas izdelave zapletenih geometrij. Sistemi DLP projicirajo svetlobne vzorce, ki ustrezajo presekom celotnih plasti, z uporabo digitalnih mikrozrcalnih nizov, medtem ko sistemi SLA pregledujejo usmerjene laserske žarke za sledenje vzorcev plasti, pri čemer DLP na splošno ponuja višje hitrosti tiskanja. Fotokroslinska bioinkovacijska sredstva vsebujejo fotoiniciatorje, ki ob izpostavljenosti svetlobi ustvarjajo reaktivne snovi, ki sprožijo polimerizacijo ali zamreženje hidrogelnih predhodnikov, kot so metakrilat želatine, diakrilat polietilenglikola ali metakrilat hialuronske kisline. Viabilnost celic je zelo odvisna od koncentracije fotoiniciatorja, intenzivnosti svetlobe in trajanja izpostavljenosti, saj lahko reaktivne vrste kisika, ki nastanejo med fotoiniciatorjem, poškodujejo celične komponente. Optimizirani sistemi dosegajo 75-95-odstotno sposobnost preživetja po tiskanju z uporabo fotoiniciatorjev, ki so združljivi s celicami v vidni svetlobi (litijev fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinat), nizkimi koncentracijami fotoiniciatorjev (0,05-0,5 %) in čim manjšo izpostavljenostjo svetlobi. SLA/DLP je zaradi možnosti hitre izdelave kompleksnih žilnih mrež in zapletenih tkivnih arhitektur še posebej obetaven za aplikacije organov na čipu in tkivno inženirstvo, vendar zahteva združljive fotokroslinske materiale in skrbno upravljanje kinetike fotopolimerizacije.

Zorenje po tiskanju in optimizacija kulture

Bioprintani konstrukti takoj po izdelavi običajno kažejo omejene interakcije med celicami, minimalno odlaganje zunajceličnega matriksa in mehanske lastnosti, pri katerih prevladuje material bioink in ne biološke značilnosti tkiva. Kultura za zorenje po tiskanju je bistvenega pomena, da se omogoči širjenje celic s prvotno sferične morfologije, vzpostavitev celičnih povezav, izločanje in organizacija endogenega zunajceličnega matriksa ter razvoj tkivno specifičnih funkcij. Zahteve glede trajanja gojenja se gibljejo od dni do tednov, odvisno od vrste celic, kompleksnosti konstrukcije in predvidene uporabe, pri čemer metabolno aktivne celice običajno zahtevajo pogostejše menjavanje gojišča, da se prepreči izčrpavanje hranil in kopičenje metabolitov. Dopolnjevanje medijev za celične kulture s tkivno specifičnimi rastnimi dejavniki, hormoni in drugimi bioaktivnimi molekulami lahko pospeši zorenje in izboljša funkcionalne značilnosti, čeprav so posebne zahteve odvisne od vrste celic in želenega fenotipa. Mehanska stimulacija s perfuzijskim tokom, cikličnim raztezanjem ali stiskanjem spodbuja zorenje tkiva in funkcionalni razvoj mehansko občutljivih vrst celic, pri čemer posnema fiziološke pogoje obremenitve. Pri bioinkih, ki vsebujejo biorazgradljive sestavine, časovni razvoj mehanskih lastnosti odraža tako razgradnjo matriksa kot kopičenje matriksa, ki ga izločajo celice, kar zahteva skrbno ravnotežje med kinetiko razgradnje in hitrostjo odlaganja matriksa. Spremljanje zorenja z morfološko oceno, analizo izražanja genov in funkcionalnimi testi omogoča optimizacijo pogojev gojenja in določanje ustreznih časovnih točk za eksperimentalno preizkušanje bioprikazanih modelov tkiva.

Uporaba pri preverjanju zdravil in modeliranju bolezni

Bioprintani tkivni konstrukti, ki uporabljajo uveljavljene celične linije iz Cytionovega kataloga, ponujajo zmogljive platforme za presejanje farmacevtskih spojin in modeliranje bolezni z večjo fiziološko ustreznostjo v primerjavi s tradicionalnimi dvodimenzionalnimi kulturami. Možnost natančnega nadzora celične sestave, prostorske organizacije in mikroarhitekturnih značilnosti omogoča sistematično raziskovanje razmerij med strukturo in funkcijo ter ustvarjanje ponovljivih tkivnih modelov, primernih za visoko zmogljive delovne postopke presejanja. Modeli raka, ki so bioprintani z linijami tumorskih celic, stromalnimi fibroblasti in endotelijskimi celicami v določenih prostorskih ureditvah, bolje povzemajo značilnosti tumorskega mikrookolja, vključno s hipoksičnimi gradienti, heterogenim prodiranjem zdravil ter interakcijami med stromo in tumorjem, ki vplivajo na terapevtski odziv. Modeli jetrnega tkiva, ki vključujejo celične linije hepatocitov v določenih strukturah, kažejo večje izražanje citokroma P450 in presnovno delovanje v primerjavi z običajnimi kulturami, kar izboljša natančnost napovedovanja za presejanje hepatotoksičnosti. Bioprintani modeli živčnega tkiva z natančno organizacijo nevronov in glije omogočajo raziskave mehanizmov nevrodegenerativnih bolezni in presejanje nevroprotektivnih spojin. Prednosti reproduktibilnosti biotiskanja v primerjavi z ročno ustvarjenimi tridimenzionalnimi kulturami olajšujejo standardizacijo, ki je bistvena za regulativno sprejemljivost in vključitev v farmacevtske razvojne linije, čeprav je potrditev rezultatov in vivo še vedno bistvena za vzpostavitev zaupanja v napovedno zmogljivost.