Bunky HaCaT – skúmanie biológie kože a kožných ochorení

Genetické charakteristiky a pôvod buniek HaCaT

HaCaT bunky sú spontánne imortalizovaná ľudská keratinocytová bunka pochádzajúca z dospelého kožného tkaniva, ktorá predstavuje jedinečnú evolučnú cestu. Tieto bunky vykazujú mutácie v oboch alelách génu p53, čo je typické pre mutácie indukované UV žiarením [3,4]. Okrem toho sa predpokladá, že bunky HaCaT vznikli mutáciami tumor-supresorového génu p53, po ktorých nasledovala strata génov senescencie [5].

Tumor supresorový gén p53, známy svojou úlohou pri oprave DNA a ako strážca genómu, indukuje reakciu ľudskej kože na poškodenie DNA [4]. Bolo pozorované, že bunky HaCaT čiastočne stratili svoj ochranný mechanizmus proti poškodeniu DNA v dôsledku in vivo mutácie génu p53, čo ich robí náchylnými na akumuláciu cytogenetických zmien v reakcii na zvýšené kultivačné teploty. Ďalší mechanizmus imortalizácie buniek HaCaT zahŕňa zvýšenú aktivitu enzýmu telomerázy [7]. V normálnych bunkách sa teloméry s každým delením buniek neustále skracujú, až kým nedosiahnu bunkovú senescenciu. Telomeráza je špecializovaný bunkový enzýmový komplex s aktivitou reverznej transkriptázy, ktorý udržiava stabilnú dĺžku telomér. Naopak, bunky HaCaT vykazujú výrazne zvýšenú aktivitu telomerázy, čo vedie k dobre udržiavanej dĺžke telomér. Tieto pozorovania potvrdzujú úlohu telomerázy v procese imortalizácie buniek HaCaT.

Boli identifikované tri špecifické chromozómové translokácie, ktoré vedú k strate jednej kópie ramien chromozómov 3p, 4p a 9p, k získaniu 9q a k tvorbe izochromozómov. Strata krátkeho ramienka chromozómu 3p môže viesť k strate génov senescencie a imortalizácii buniek HaCaT [8]. Bunky HaCaT sú hypodiploidné a majú výrazné a stabilné markerové chromozómy, ktoré reprezentujú ich monoklonálny pôvod. Charakteristiky a hlava buniek HaCaT boli potvrdené pomocou DNA fingerprintingu s hypervariabilnými minisatelitnými markermi [3-6].

Ako získať bunky HaCaT v 5 jednoduchých krokoch

4. Odstráňte kultivačné médium a prepláchnite adhezívne bunky pomocou 3–5 ml PBS bez vápnika a horčíka pre T25 fľaše alebo 5–10 ml pre T75 fľaše.
5. Pridajte 1–2 ml čerstvo pripraveného 0,05 % roztoku EDTA na fľašu T25 alebo 2,5 ml na fľašu T75, pričom sa uistite, že je pokrytá celá bunková vrstva, a inkubujte pri 37 °C počas 10 minút.
6. Pridajte 1 ml čerstvo pripraveného roztoku trypsínu/EDTA (0,05 %/0,025 %) na každú fľašu T25 alebo 2,5 ml na každú fľašu T75, pričom opäť zabezpečte úplné pokrytie bunkovej vrstvy. Bunky by sa mali odlepiť do 1–2 minút.
7. Zastavte aktivitu trypsínu pridaním kultivačného média obsahujúceho FBS.
8. Rozdeľte bunky do nových fliaš obsahujúcich čerstvé kultivačné médium.

Aplikácie buniek HaCaT

Bunky HaCaT sú cenným nástrojom na štúdium keratinocytov [9]. Tieto nesmrteľné bunky fungujú ako preneoplastické bunky a môžu poskytnúť pohľad na zmeny súvisiace s malígnym a neoplastickým premenou [10]. Jednovrstvové kultúry buniek HaCaT sú nevyhnutné pre aplikácie v oblasti analýzy bunkovej toxicity a hojenia rán in vitro. Bunky HaCaT sa môžu použiť aj na posúdenie kožnej toxicity spôsobenej rôznymi látkami a neoplastickými alebo zápalovými procesmi. Dajú sa využiť na analýzu rôznych mechanizmov kožných alergických reakcií, účinkov reaktívnych foriem kyslíka a ožiarenia UV žiarením. Po stimulácii sa bunky HaCaT môžu diferencovať a exprimovať špecifické diferenciácie markery, ako sú involucrin, K14 a K10. Bunky HaCaT sa tiež bežne používajú ako model na štúdium patofyziológie homeostázy epidermis [6].

Odporúčané videá: Objavovanie sveta buniek HaCaT

„Migrácia buniek HaCaT“: Toto video ukazuje proces migrácie buniek HaCaT. Migrácia buniek je nevyhnutným procesom pre rôzne biologické procesy, ako je hojenie rán a metastázovanie rakoviny. Video demonštruje pohyb buniek HaCaT pod mikroskopom a poskytuje vizuálnu reprezentáciu toho, ako tieto bunky migrujú. Aktivita buniek sa pozoruje, keď sa pohybujú z jedného miesta na druhé, a video poskytuje jasnú ilustráciu zmien, ktoré sa v bunkách počas tohto procesu odohrávajú.

„Scratch Assay vykonaný na bunkách HaCaT“: Toto video ukazuje Scratch Assay vykonaný na bunkách HaCaT. Test škrabancov je široko používaná technika na štúdium migrácie buniek a v tomto prípade sa používa na analýzu migrácie buniek HaCaT. Video demonštruje proces vytvorenia škrabanca na povrchu misky s bunkovou kultúrou, ktorý sa potom pozoruje pod mikroskopom, ako bunky HaCaT migrujú a postupne uzatvárajú medzeru.

„Rast buniek keratinocytov HaCaT pre experimenty s hojením rán“: Toto video demonštruje proces rastu buniek keratinocytov HaCaT pre experimenty s hojením rán. Keratinocyty HaCaT sú bežne používanou bunkovou líniou v štúdiách hojenia rán.

„Diferenciácia buniek HaCaT“: Toto video predstavuje kroky potrebné na diferenciáciu buniek HaCaT. Bunky HaCaT sa môžu diferencovať na rôzne typy kožných buniek. Video demonštruje zmeny v bunkách HaCaT počas diferenciácie a vizuálne znázorňuje rôzne markery a charakteristiky diferenciácie. Proces diferenciácie je kľúčový pre normálne fungovanie kože a video zdôrazňuje rôzne štádiá diferenciácie, ktorými prechádzajú bunky HaCaT.

Referencie

1. Angel P a Karin M: Úloha Jun, Fos a komplexu AP-1 v bunkovej proliferácii a transformácii. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Regulácia hyperplastického rastu epidermis. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Izolácia a charakterizácia spontánne vznikajúcej dlhožijúcej línie ľudských keratinocytov (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: Mutácie p53 v ľudských imortalizovaných epitelových bunkových líniách. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutácie spôsobené slnečným žiarením v géne p53 pri nemelanómovom rakovine kože. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Viacero štádií a genetické zmeny pri imortalizácii, malígnej transformácii a progresi nádoru ľudských kožných keratinocytov. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Aktivita telomerázy v regeneratívnej bazálnej vrstve epidermis v ľudskej koži a v nesmrteľných a z karcinómu odvodených kožných keratinocytoch. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. Bunky HaCaT ako spoľahlivý in vitro diferenciačný model na analýzu zápalovej/reparatívnej odpovede ľudských keratinocytov. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normálna keratinizácia v spontánne imortalizovanej aneuploidnej línii ľudských keratinocytov. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
9. Gibbs, Graham: Analýza kvalitatívnych údajov. Sada Sage pre kvalitatívny výskum. Londýn: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Návrh aplikovaného výskumu: praktická príručka. Sage: Londýn
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normálna keratinizácia v spontánne imortalizovanej aneuploidnej ľudskej keratinocytovej buneckej línii.  Cell Biol. (1988); 106: 761–771.