Bunky HaCaT - skúmanie biológie kože a chorôb

2.genetické vlastnosti a pôvod buniek HaCaT

Bunky HaCaT sú spontánne imortalizované ľudské keratinocytové bunkové línie pochádzajúce z dospelej kože a predstavujú jedinečnú evolučnú cestu. Tieto bunky majú mutácie v oboch alelách génu p53, čo je typické pre mutácie vyvolané UV žiarením [3,4]. Okrem toho sa predpokladá, že bunky HaCaT vznikli mutáciou tumor supresorového génu p53, po ktorej nasledovala strata senescenčných génov [5].

Tumor supresorový gén p53, známy svojou úlohou pri oprave DNA a ako strážca genómu, vyvoláva odpoveď ľudskej kože na poškodenie DNA [4]. Bolo zistené, že bunky HaCaT čiastočne stratili svoj ochranný mechanizmus proti poškodeniu DNA v dôsledku mutácie génu p53 in vivo, čím sa stali náchylnými na akumuláciu cytogenetických zmien v reakcii na zvýšenú teplotu kultivácie. Ďalší mechanizmus imortalizácie buniek HaCaT zahŕňa zvýšenú aktivitu enzýmu telomerázy [7]. V normálnych bunkách sa teloméry kontinuálne skracujú pri každom delení buniek, až kým sa nedosiahne bunková senescencia. Telomeráza je špecializovaný bunkový enzýmový komplex s reverznou transkriptázovou aktivitou, ktorý udržiava stabilnú dĺžku telomér. Naopak, bunky HaCaT vykazujú výrazne zvýšenú aktivitu telomerázy, čo vedie k dobre udržiavanej dĺžke telomér. Tieto pozorovania potvrdzujú úlohu telomerázy v procese imortalizácie buniek HaCaT.

Boli identifikované tri špecifické chromozómové translokácie, ktoré vedú k strate jednej kópie ramien chromozómov 3p, 4p a 9p, zisku 9q a vzniku izochromozómov. Strata krátkeho ramena chromozómu 3p môže viesť k strate senescenčných génov a k imortalizácii buniek HaCaT [8]. Bunky HaCaT sú hypodiploidné a majú odlišné a stabilné markerové chromozómy, ktoré predstavujú ich monoklonálny pôvod. Charakteristiky a hlava bunkovej línie HaCaT boli potvrdené pomocou DNA fingerprintingu s hypervariabilnými minisatelitnými markermi [3-6].

3.ako získať bunky HaCaT v 5 jednoduchých krokoch

4. Odstráňte kultivačné médium a opláchnite prirastené bunky pomocou 3 - 5 ml PBS bez vápnika a horčíka pre banky T25 alebo 5 - 10 ml pre banky T75.
5. Pridajte 1 - 2 ml čerstvo pripraveného 0,05 % roztoku EDTA na banku T25 alebo 2,5 ml na banku T75, pričom sa uistite, že je pokrytý celý bunkový list, a inkubujte pri 37 °C počas 10 minút.
6. Pridajte 1 ml čerstvo pripraveného roztoku trypsínu/EDTA (0,05 %/0,025 %) na banku T25 alebo 2,5 ml na banku T75, pričom opäť zabezpečte úplné pokrytie bunkového listu. Bunky by sa mali oddeliť do 1 - 2 minút.
7. Zastavte trypsínovú aktivitu pridaním bunkového kultivačného média obsahujúceho FBS.
8. Rozdajte bunky do nových baniek obsahujúcich čerstvé médium na kultiváciu buniek.

4. Použitie buniek HaCaT

Bunky HaCaT sú cenným nástrojom na štúdium keratinocytov [9]. Tieto nesmrteľné bunky fungujú ako preneoplastické bunky a môžu poskytnúť pohľad na zmeny, ktoré sa podieľajú na malígnej a neoplastickej transformácii [10]. Monovrstvové bunkové kultúry HaCaT sú nevyhnutné pre aplikácie analýzy bunkovej toxicity a hojenia rán in vitro. Bunky HaCaT sa môžu použiť aj na hodnotenie toxicity kože spôsobenej rôznymi látkami a neoplastickými alebo zápalovými procesmi. Možno ich využiť na analýzu rôznych mechanizmov kožných alergických reakcií, účinkov reaktívnych foriem kyslíka a ožiarenia UV žiarením. Bunky HaCaT sa po stimulácii môžu diferencovať a exprimovať špecifické diferenciačné markery, ako sú involukrín, K14 a K10. Bunky HaCaT sa bežne používajú aj ako model na štúdium patofyziológie epidermálnej homeostázy [6].

Bunky HaCaT si po transplantácii zachovávajú schopnosť rekonštituovať štruktúrovanú epidermis in vivo, čo vedie k stratifikovanej epidermálnej štruktúre, ktorú možno meniť medzi bazálnym a diferencovaným stavom pomocou zmien koncentrácie vápnika v médiu. Tieto bunky umožňujú aj charakterizáciu viacerých biologických procesov, napríklad ich použitie ako modelového systému pre vitamín D a metabolizmus v koži. Keďže bunky HaCaT nie sú geneticky upravené, predstavujú nezaujatý pohľad na široké spektrum počiatočných genetických udalostí v ľudskej koži.

5. Odporúčané videá: Preskúmanie sveta buniek HaCaT

"Migrácia buniek HaCaT": Toto video ukazuje proces migrácie buniek HaCaT. Migrácia buniek je nevyhnutným procesom pre rôzne biologické procesy, ako je hojenie rán a metastázovanie rakoviny. Video demonštruje pohyb buniek HaCaT pod mikroskopom a poskytuje vizuálne znázornenie toho, ako tieto bunky migrujú. Pri pohybe buniek z jedného miesta na druhé sa pozoruje ich aktivita a video poskytuje jasnú ilustráciu zmien, ku ktorým dochádza v bunkách počas tohto procesu.

"Scratch Assay carried out on HaCaT cells": V tomto videu je znázornený test Scratch Assay vykonaný na bunkách HaCaT. Scratch Assay je široko používaná technika na štúdium migrácie buniek a v tomto prípade sa používa na analýzu migrácie buniek HaCaT. Video demonštruje proces vytvorenia škrabancov na povrchu misky s bunkovou kultúrou, ktoré sa potom pozorujú pod mikroskopom, ako bunky HaCaT migrujú a časom uzatvárajú medzeru.

"Bunkový rast keratinocytov HaCaT pre experimenty s hojením rán": Toto video ukazuje proces rastu buniek keratinocytov HaCaT pre experimenty s hojením rán. Keratinocyty HaCaT sú bežne používanou bunkovou líniou v štúdiách hojenia rán.

"Diferenciácia buniek HaCaT": Toto video ukazuje kroky potrebné na diferenciáciu buniek HaCaT. Bunky HaCaT sa môžu diferencovať na rôzne typy kožných buniek. Video demonštruje zmeny v bunkách HaCaT počas ich diferenciácie, pričom vizuálne znázorňuje rôzne markery a charakteristiky diferenciácie. Proces diferenciácie je rozhodujúci pre normálne fungovanie kože a video poukazuje na rôzne štádiá diferenciácie, ktorými prechádzajú bunky HaCaT.

Odkazy

1. Angel P a Karin M: Úloha Jun, Fos a komplexu AP-1 v bunkovej proliferácii a transformácii. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Isolation and characterization of a spontaneously arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutation hotspots due to sunlight in the p53 gene of nonmelanoma skin cancer. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes (Aktivita telomerázy v regeneračnej bazálnej vrstve epidermis v ľudskej koži a v nesmrteľných a karcinómových keratinocytoch). Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line (Normálna keratinizácia v spontánne imortalizovanej aneuploidnej ľudskej bunkovej línii) J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analysing qualitative data. The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide (Aplikovaný výskumný dizajn: praktická príručka). Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normal keratinization in a spontaneously immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. Cell Biol. 1988;106:761-771.