Cultura de células de mamíferos: Fundamentos e Técnicas
A cultura de células de mamíferos é uma técnica fundamental na investigação biológica, permitindo aos cientistas estudar células num ambiente controlado fora dos organismos vivos. Este processo envolve o isolamento de células de tecidos, a sua manutenção em condições cuidadosamente controladas e a sua propagação para vários fins experimentais. A cultura de células de mamíferos é crucial para a compreensão dos processos celulares, dos mecanismos de doença e para o desenvolvimento de novas terapias, incluindo as que utilizam linhas celulares imortais
Principais lições:
- As células podem ser isoladas de tecidos utilizando métodos de digestão enzimática ou de cultura de explantes
- As células primárias têm um tempo de vida limitado, enquanto as linhas celulares imortalizadas podem proliferar indefinidamente
- As condições de cultura, incluindo a composição dos meios de crescimento, são críticas para a sobrevivência e proliferação das células
- As células podem ser cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes, dependendo do seu tipo e das necessidades da investigação
- Os meios de cultura comuns incluem MEM, DMEM e RPMI 1640, cada um adaptado a tipos de células específicos
- As condições típicas de crescimento envolvem uma temperatura de 37°C, 5% de CO2 e 95% de humidade relativa
- Alternativas ao soro, como o lisado de plaquetas humanas (hPL), são cada vez mais utilizadas para evitar potenciais problemas de contaminação
Técnicas de isolamento de células
O processo de estabelecimento de uma cultura de células começa com o isolamento de células de tecidos. Existem vários métodos para o conseguir, cada um adequado a diferentes tipos de tecidos e objectivos de investigação. Para amostras de sangue, o isolamento de células é relativamente simples, sendo os glóbulos brancos o foco principal da cultura devido às suas capacidades de crescimento. Os tecidos sólidos requerem técnicas de isolamento mais complexas. Um método comum envolve a digestão enzimática, em que enzimas como a colagenase, a tripsina ou a pronase são utilizadas para quebrar a matriz extracelular, libertando células individuais em suspensão. Em alternativa, os investigadores podem utilizar o método de cultura de explantes, em que pequenos pedaços de tecido são colocados diretamente em meios de crescimento, permitindo que as células migrem para fora e proliferem. A escolha entre estes métodos depende frequentemente do tipo de tecido específico, da população celular pretendida e da utilização experimental pretendida. É importante notar que as células isoladas diretamente de um organismo são designadas por células primárias e, com algumas excepções como as células derivadas de tumores, têm normalmente um tempo de vida limitado em cultura antes de entrarem em senescência
Produtos essenciais para a cultura de células de mamíferos
| Nome do Produto | Número do Produto | Categoria do produto | Aplicação |
|---|---|---|---|
| DMEM, com: 4,5 g/L de glucose, com: 4 mM de L-Glutamina, com: 1,5 g/L de NaHCO3, com: 1,0 mM de piruvato de sódio | 820300a | Meios de cultura | Meio de uso geral para vários tipos de células de mamíferos |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3.1 g/L Glucose, w: 1.6 mM L-Glutamina, w: 15 mM HEPES, w: 1.0 mM Piruvato de sódio, w: 1.2 g/L NaHCO3 | 820400a | Meios de cultura | Adequado para uma vasta gama de células de mamíferos, especialmente células epiteliais |
| RPMI 1640, com: 2,1 mM de glutamina estável, com: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Meios de cultura | Comummente utilizado para células linfóides e linhas celulares híbridas |
| Acutase | 830100 | Dissociação celular | Solução de descolamento celular suave para células aderentes |
| Meio de congelação CM-1 | 800150 | Criopreservação | Para congelação e armazenamento a longo prazo de células de mamíferos |
| Freeze medium CM-ACF, sem soro | 800650 | Criopreservação | Meio sem componentes animais para congelação de células |
| PBS | 860015 | Solução tampão | Para lavar as células e manter o equilíbrio do pH |
| Meio de crescimento de células endoteliais | 820731 | Meio especializado | Optimizado para cultura de células endoteliais |
| Teste de micoplasma | 900159 | Controlo de qualidade | Essencial para a deteção de contaminação por micoplasma em culturas |
| Autenticação de linhas celulares - Humanas | 900154 | Controlo de qualidade | Verifica a identidade de linhas celulares humanas |
Esta tabela representa uma seleção de produtos essenciais para a cultura de células de mamíferos. Para obter a nossa gama completa de produtos para cultura de células, incluindo meios e reagentes especializados, visite a nossa página da categoria Meios e Reagentes.
Accutase é uma solução de desprendimento celular pronta a usar e filtrada esterilizada, concebida como uma alternativa suave à tripsina/EDTA para a dissociação de células de mamíferos aderentes de material plástico padrão para cultura de tecidos e superfícies revestidas para adesão. Combina atividade enzimática proteolítica e colagenolítica numa solução salina equilibrada para proporcionar uma dissociação eficaz, mas controlada, preservando as proteínas da superfície celular e favorecendo uma elevada viabilidade pós-passagem e uma rápida readesão.
A formulação do Accutase baseia-se na solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) com EDTA e vermelho de fenol como indicador visual de pH. As enzimas são de origem não mamífera e não bacteriana, tornando o Accutase particularmente adequado para a investigação com células estaminais, fluxos de trabalho de vacinas e qualquer aplicação em que seja necessário minimizar os contaminantes de origem animal ou microbiana. A solução autoinibe-se a 37 °C, pelo que não é necessário qualquer reagente neutralizante ou meio contendo soro após a dissociação – as células podem ser transferidas diretamente para um meio fresco.
Características principais
Líquido 1x pronto a usar e filtrado esterilizado – não requer diluição nem reconstituição
Atividade enzimática proteolítica e colagenolítica combinada para uma dissociação suave
Cada lote padronizado para uma atividade de dissociação definida, garantindo a consistência entre lotes
Enzimas de origem não mamífera e não bacteriana
Autoinibe-se a 37 °C – não é necessária solução neutralizante
Formulado em PBS de Dulbecco com EDTA
Fenol vermelho incluído como indicador visual de pH
pH 6,8 – 7,8
Aplicações típicas
O Accutase dissocia suavemente uma ampla variedade de tipos de células aderentes e sensíveis, incluindo células estaminais embrionárias humanas (hESCs), células estaminais pluripotentes induzidas humanas (iPSCs), células estaminais neurais, neurónios primários e linhas aderentes cultivadas rotineiramente, tais como HeLa, HEK 293, CHO, MDCK, Vero, NIH/3T3, BHK-21 e A549. Casos de utilização típicos incluem:
Subcultura e passagem de rotina de células mamíferas aderentes
Dissociação suave de células individuais de hESCs, iPSCs e outras linhas sensíveis
Preparação de amostras para citometria de fluxo e análise FACS
Análise de marcadores da superfície celular em que a integridade do epítopo é importante
Ensaios de migração, proliferação e apoptose celular
Ensaios de quiescência por privação de soro e estudos de transfecção de oncogenes
Ensaios de migração de células tumorais e de crista neural
Aumento da escala de produção em fluxos de trabalho com biorreatores
Para trabalhos de rotina, aplique aproximadamente 10 ml de Accutase por 75 cm² de superfície de cultura e incube durante 5–10 minutos à temperatura ambiente. O tempo de incubação ideal deve ser determinado para cada linha celular e não deve exceder uma hora. Antes da adição, lave a camada celular com uma solução salina isenta de Ca²⁺/Mg²⁺, como DPBS sem cálcio e magnésio, para remover soro residual e catiões divalentes.
Manuseamento e armazenamento
Armazene o frasco fechado congelado a -15 °C ou abaixo. Descongele à temperatura ambiente ou durante a noite a +2 °C a +8 °C. Não descongele o Accutase num banho-maria a 37 °C, uma vez que as temperaturas elevadas reduzem a atividade enzimática. Após a descongelação, a solução pode ser armazenada por um período de até 2 meses a +2 °C a +8 °C; não armazene à temperatura ambiente. Não pré-aqueça o reagente a 37 °C antes da aplicação – adicione-o diretamente às células lavadas à temperatura ambiente. Para uma vida útil prolongada, recomenda-se a divisão em alíquotas de uso único para evitar ciclos de descongelação repetidos. Trabalhe sempre em condições assépticas.
Qualidade
Fabricado sob rigorosos padrões de qualidade. Cada lote de Accutase é filtrado em estéril e testado quanto à esterilidade, pH, aspeto e atividade de dissociação para garantir um desempenho consistente e reprodutível de lote para lote.
Especificações do produto
Especificação
Detalhe
Tipo de produtoReagente de desprendimento/dissociação celular
FormatoLíquido filtrado esterilizado, pronto a usar
Volume100 ml
Concentração de trabalho1x (pronto a usar)
Atividade enzimáticaProteolítica e colagenolítica combinadas
Origem enzimáticaNão mamífera e não bacteriana
Sistema tampãoPBS de Dulbecco com EDTA
Indicador de pHVermelho de fenol
Intervalo de pH6,8 – 7,8
AspectoSolução límpida, de cor vermelho-pálido a laranja
Temperatura de armazenamento-15 °C ou inferior
Estabilidade após descongelaçãoAté 2 meses a +2 °C a +8 °C
Volume de utilização recomendado~10 ml por 75 cm² de superfície de cultura
Tempo de incubação típico5 – 10 minutos à temperatura ambiente
Condições de envioCongelado em gelo seco
Utilização previstaApenas para uso em investigação e fabrico posterior
Formulação (Composição por litro)
Componente
Concentração (mg/L)
Sais inorgânicos
Cloreto de sódio (NaCl)8000,00
Hidrogenofosfato dissódico (Na₂HPO₄)1150,00
Cloreto de potássio (KCl)200,00
Dihidrogenofosfato de potássio (KH₂PO₄)200,00
Outros componentes
EDTA · 4Na (EDTA tetrassódico)220,00
Vermelho de fenol3,00
Mistura enzimática patenteada (atividade proteolítica e colagenolítica)1x
Accutase é uma marca registada da Innovative Cell Technologies, Inc.
A solução salina tamponada com fosfato (PBS) é uma solução tampão amplamente utilizada na investigação biológica e química. Desempenha um papel crucial na manutenção do equilíbrio do pH e da osmolaridade durante vários procedimentos experimentais, incluindo o processamento de tecidos e a cultura de células. A nossa solução PBS é meticulosamente formulada com ingredientes de elevada pureza para garantir estabilidade e fiabilidade em todas as experiências. A osmolaridade e as concentrações de iões do nosso PBS imitam de perto as do corpo humano, tornando-o isotónico e não tóxico para a maioria das células.
Composição da nossa solução PBS
A nossa solução PBS é uma mistura com pH ajustado de tampões de fosfato de grau ultrapuro e soluções salinas. Numa concentração de trabalho 1X, contém
8000 mg/L de cloreto de sódio (NaCl)
200 mg/L de cloreto de potássio (KCl)
1150 mg/L Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4)
200 mg/L Fosfato de potássio monobásico anidro (KH2PO4)
Esta composição assegura um pH e um equilíbrio iónico óptimos, adequados a uma vasta gama de aplicações biológicas.
Aplicações da nossa solução PBS
A nossa solução PBS é ideal para várias aplicações na investigação biológica. As suas propriedades isotónicas e não tóxicas tornam-na adequada para a diluição de substâncias e lavagem de recipientes de células. As soluções PBS que contêm EDTA são eficazes para desprender células ligadas e aglomeradas. No entanto, os metais divalentes, como o zinco, não devem ser adicionados ao PBS, uma vez que podem causar precipitação. Nestes casos, recomenda-se a utilização de tampões Good's. Além disso, a nossa solução de PBS é uma alternativa aceitável ao meio de transporte viral para o transporte e armazenamento de vírus de ARN, incluindo o SARS-CoV-2.
Controlo de qualidade
Estéril-filtrado
Armazenamento e prazo de validade
Armazenar entre +2°C e +25°C, protegido da luz.
Depois de aberto, conservar a uma temperatura entre 2°C e 25°C e utilizar no prazo de 24 meses.
Condições de transporte
Temperatura ambiente
Manutenção
Manter refrigerado a uma temperatura entre +2°C e +8°C, ao abrigo da luz. Evitar o congelamento e o aquecimento frequente a +37°C, uma vez que reduz a qualidade do produto.
Não aquecer o meio para além de 37°C nem utilizar fontes de calor não controladas, tais como aparelhos de micro-ondas.
Se apenas uma parte do meio for utilizada, retirar a quantidade necessária e aquecê-la à temperatura ambiente antes de a utilizar.
Composição
Categoria
Componentes
Concentração (mg/L)
Sais
Cloreto de potássio
200
Fosfato de potássio monobásico anidro
200
Cloreto de sódio
8000
Fosfato de sódio dibásico anidro
1150
Método de análise
A CLS oferece testes de curto e longo prazo para a deteção de micoplasma. No primeiro caso, as amostras são testadas imediatamente após a sua chegada, ao passo que no segundo caso é iniciada uma cultura celular e as células são testadas após 14 dias de cultivo sem antibióticos. O teste de micoplasma é efectuado utilizando um sistema de deteção de dois pontos com o PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) e o Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Amostras
Para o teste rápido, é necessário fornecer um mínimo de 50 µl de suspensão celular contendo 50.000 células. A suspensão de células pode ser enviada à temperatura ambiente.
Para o teste premium, fornecer um mínimo de 1 milhão de células num meio de congelação adequado para assegurar uma cultura robusta e saudável para o cultivo e subsequente teste das células. Envie as amostras em gelo seco.
Preencher o Formulário de Amostra de Teste de Micoplasma e incluí-lo no envio da amostra.
Ensaio Colorimétrico de Repetição
Este teste é um ensaio colorimétrico baseado em células. Na presença de micoplasma, uma linha celular repórter induz uma cascata de sinalização que desencadeia uma mudança de cor no meio de vermelho para azul. O ensaio é efectuado em placas multipoços de 96 poços. Os sinais são detectados num espetrofotómetro de microplacas a 620-655 nm. São detectadas todas as espécies de micoplasma e acholeplasma, mas também outros contaminantes da cultura de células, como bactérias.
Amplificação isotérmica
A amplificação isotérmica é um teste rápido e fiável baseado na amplificação isotérmica do ADN específico do micoplasma combinada com a deteção em tempo real utilizando um corante intercalante de ADN. O ensaio é capaz de detetar seis das espécies mais comuns que representam >95% das contaminações: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis e A.laidlawii. Devido à homologia das sequências, serão igualmente detectadas outras espécies de micoplasma (M.pneumoniae, M.gallisepticum e M.synoviae). Para identificar se a amostra é positiva ou negativa para micoplasma, é estudada a temperatura de fusão (Tm).
Conclusão: O papel fundamental da cultura de células de mamíferos na investigação moderna
A cultura de células de mamíferos revolucionou a investigação biológica e médica, fornecendo aos cientistas ferramentas poderosas para estudar processos celulares complexos, mecanismos de doenças e potenciais intervenções terapêuticas. Desde o isolamento de células primárias até ao desenvolvimento de linhas celulares imortalizadas, esta técnica tornou-se uma parte indispensável do conjunto de ferramentas científicas modernas
A viagem da cultura de células de mamíferos começa com técnicas de isolamento cuidadosas, progride através da manutenção meticulosa de células em meios especializados e culmina numa vasta gama de aplicações em vários campos de estudo. Quer se trate da investigação do cancro, da descoberta de medicamentos ou da biologia celular básica, a capacidade de cultivar e manipular células de mamíferos in vitro abriu caminhos sem precedentes para a exploração científica
A chave para o sucesso da cultura de células de mamíferos são as condições cuidadosamente controladas sob as quais as células são mantidas. Desde a composição dos meios de crescimento até aos parâmetros ambientais precisos nas incubadoras, todos os aspectos são optimizados para imitar o mais possível as condições naturais das células. Esta atenção ao pormenor garante a fiabilidade e a reprodutibilidade das experiências, uma pedra angular das boas práticas científicas
O desenvolvimento de linhas celulares imortalizadas, como as células HeLa, amplamente utilizadas, expandiu ainda mais as possibilidades da cultura celular. Estas linhas celulares fornecem modelos celulares consistentes e prontamente disponíveis que aceleraram a investigação em várias disciplinas
Ao olharmos para o futuro, a cultura de células de mamíferos continua a evoluir. Os avanços nas técnicas de cultura 3D, o desenvolvimento de organóides e a utilização de meios quimicamente definidos estão a alargar os limites do que é possível na cultura de células. Estes desenvolvimentos prometem aproximar ainda mais os modelos in vitro da complexidade dos sistemas in vivo, revolucionando potencialmente a descoberta de medicamentos, a medicina personalizada e a nossa compreensão da biologia humana
Em conclusão, a cultura de células de mamíferos continua a ser uma técnica dinâmica e essencial na investigação das ciências da vida. O seu aperfeiçoamento e aplicação contínuos desempenharão, sem dúvida, um papel crucial na abordagem de algumas das questões mais prementes da biologia e da medicina, impulsionando o progresso científico nos próximos anos