Cultura de células de mamíferos: Fundamentos e Técnicas
A cultura de células de mamíferos é uma técnica fundamental na investigação biológica, permitindo aos cientistas estudar células num ambiente controlado fora dos organismos vivos. Este processo envolve o isolamento de células de tecidos, a sua manutenção em condições cuidadosamente controladas e a sua propagação para vários fins experimentais. A cultura de células de mamíferos é crucial para a compreensão dos processos celulares, dos mecanismos de doença e para o desenvolvimento de novas terapias, incluindo as que utilizam linhas celulares imortais
Principais lições:
- As células podem ser isoladas de tecidos utilizando métodos de digestão enzimática ou de cultura de explantes
- As células primárias têm um tempo de vida limitado, enquanto as linhas celulares imortalizadas podem proliferar indefinidamente
- As condições de cultura, incluindo a composição dos meios de crescimento, são críticas para a sobrevivência e proliferação das células
- As células podem ser cultivadas em suspensão ou como culturas aderentes, dependendo do seu tipo e das necessidades da investigação
- Os meios de cultura comuns incluem MEM, DMEM e RPMI 1640, cada um adaptado a tipos de células específicos
- As condições típicas de crescimento envolvem uma temperatura de 37°C, 5% de CO2 e 95% de humidade relativa
- Alternativas ao soro, como o lisado de plaquetas humanas (hPL), são cada vez mais utilizadas para evitar potenciais problemas de contaminação
Técnicas de isolamento de células
O processo de estabelecimento de uma cultura de células começa com o isolamento de células de tecidos. Existem vários métodos para o conseguir, cada um adequado a diferentes tipos de tecidos e objectivos de investigação. Para amostras de sangue, o isolamento de células é relativamente simples, sendo os glóbulos brancos o foco principal da cultura devido às suas capacidades de crescimento. Os tecidos sólidos requerem técnicas de isolamento mais complexas. Um método comum envolve a digestão enzimática, em que enzimas como a colagenase, a tripsina ou a pronase são utilizadas para quebrar a matriz extracelular, libertando células individuais em suspensão. Em alternativa, os investigadores podem utilizar o método de cultura de explantes, em que pequenos pedaços de tecido são colocados diretamente em meios de crescimento, permitindo que as células migrem para fora e proliferem. A escolha entre estes métodos depende frequentemente do tipo de tecido específico, da população celular pretendida e da utilização experimental pretendida. É importante notar que as células isoladas diretamente de um organismo são designadas por células primárias e, com algumas excepções como as células derivadas de tumores, têm normalmente um tempo de vida limitado em cultura antes de entrarem em senescência
Produtos essenciais para a cultura de células de mamíferos
| Nome do Produto | Número do Produto | Categoria do produto | Aplicação |
|---|---|---|---|
| DMEM, com: 4,5 g/L de glucose, com: 4 mM de L-Glutamina, com: 1,5 g/L de NaHCO3, com: 1,0 mM de piruvato de sódio | 820300a | Meios de cultura | Meio de uso geral para vários tipos de células de mamíferos |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3.1 g/L Glucose, w: 1.6 mM L-Glutamina, w: 15 mM HEPES, w: 1.0 mM Piruvato de sódio, w: 1.2 g/L NaHCO3 | 820400a | Meios de cultura | Adequado para uma vasta gama de células de mamíferos, especialmente células epiteliais |
| RPMI 1640, com: 2,1 mM de glutamina estável, com: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Meios de cultura | Comummente utilizado para células linfóides e linhas celulares híbridas |
| Acutase | 830100 | Dissociação celular | Solução de descolamento celular suave para células aderentes |
| Meio de congelação CM-1 | 800150 | Criopreservação | Para congelação e armazenamento a longo prazo de células de mamíferos |
| Freeze medium CM-ACF, sem soro | 800650 | Criopreservação | Meio sem componentes animais para congelação de células |
| PBS | 860015 | Solução tampão | Para lavar as células e manter o equilíbrio do pH |
| Meio de crescimento de células endoteliais | 820731 | Meio especializado | Optimizado para cultura de células endoteliais |
| Teste de micoplasma | 900159 | Controlo de qualidade | Essencial para a deteção de contaminação por micoplasma em culturas |
| Autenticação de linhas celulares - Humanas | 900154 | Controlo de qualidade | Verifica a identidade de linhas celulares humanas |
Esta tabela representa uma seleção de produtos essenciais para a cultura de células de mamíferos. Para obter a nossa gama completa de produtos para cultura de células, incluindo meios e reagentes especializados, visite a nossa página da categoria Meios e Reagentes.
- Uma Alternativa Suave à Tripsina
Accutase é uma solução de descolamento celular que está a revolucionar a indústria da cultura celular. É uma mistura de enzimas proteolíticas e colagenolíticas que imita a ação da tripsina e da colagenase. Ao contrário da tripsina, o Accutase não contém quaisquer componentes de mamíferos ou bactérias e é muito mais suave para as células, o que o torna uma solução ideal para o descolamento rotineiro de células de material plástico de cultura de tecidos padrão e material plástico revestido de adesão. Nesta publicação do blogue, vamos explorar as vantagens e utilizações do Accutase e a forma como está a mudar o jogo na cultura de células.
Vantagens do Accutase
A Accutase tem várias vantagens em relação às soluções tradicionais de tripsina. Em primeiro lugar, pode ser utilizado sempre que for necessário um descolamento suave e eficiente de qualquer linha celular aderente, o que o torna um substituto direto da tripsina. Em segundo lugar, a Accutase funciona extremamente bem em células estaminais embrionárias e neuronais, tendo sido demonstrado que mantém a viabilidade destas células após a passagem. Em terceiro lugar, a Accutase preserva a maioria dos epítopos para posterior análise por citometria de fluxo, tornando-a ideal para a análise de marcadores de superfície celular.
Além disso, a Accutase não necessita de ser neutralizada aquando da passagem das células aderentes. A adição de mais meios após a divisão das células dilui a Accutase de modo a que esta deixe de ser capaz de destacar as células. Isto elimina a necessidade de um passo de inativação e poupa tempo aos técnicos de cultura de células. Finalmente, o Accutase não precisa de ser aliquotado e um frasco mantém-se estável no frigorífico durante 2 meses.
Aplicações do Accutase
Accutase é um substituto direto da solução de tripsina e pode ser utilizado para a passagem de linhas celulares. Além disso, Accutase tem um bom desempenho na separação de células para a análise de muitos marcadores de superfície celular utilizando citometria de fluxo e para a seleção de células. Outras aplicações a jusante do tratamento com Accutase incluem a análise de marcadores de superfície celular, ensaio de crescimento de vírus, proliferação celular, ensaios de migração de células tumorais, passagem celular de rotina, aumento da escala de produção (bioreactor) e citometria de fluxo.
Composição do Accutase
Accutase não contém componentes de mamíferos ou bactérias e é uma mistura de enzimas naturais com atividade enzimática proteolítica e colagenolítica. É formulado numa concentração muito mais baixa do que a tripsina e a colagenase, tornando-o menos tóxico e mais suave, mas igualmente eficaz.
Eficácia do Accutase
O Accutase demonstrou ser eficiente na separação de células primárias e estaminais e na manutenção de uma elevada viabilidade celular em comparação com enzimas de origem animal, como a tripsina. 100% das células são recuperadas ao fim de 10 minutos e não há qualquer problema em deixar as células no Accutase até 45 minutos, graças à autodigestão do Accutase.
Em resumo
Em conclusão, o Accutase é uma solução poderosa que está a mudar o jogo na cultura de células. Com a sua natureza suave, eficiência e versatilidade, Accutase é a alternativa ideal à tripsina. Se procura uma solução fiável e eficiente para o descolamento de células, Accutase é a solução para si.
A solução salina tamponada com fosfato (PBS) é uma solução tampão amplamente utilizada na investigação biológica e química. Desempenha um papel crucial na manutenção do equilíbrio do pH e da osmolaridade durante vários procedimentos experimentais, incluindo o processamento de tecidos e a cultura de células. A nossa solução PBS é meticulosamente formulada com ingredientes de elevada pureza para garantir estabilidade e fiabilidade em todas as experiências. A osmolaridade e as concentrações de iões do nosso PBS imitam de perto as do corpo humano, tornando-o isotónico e não tóxico para a maioria das células.
Composição da nossa solução PBS
A nossa solução PBS é uma mistura com pH ajustado de tampões de fosfato de grau ultrapuro e soluções salinas. Numa concentração de trabalho 1X, contém
8000 mg/L de cloreto de sódio (NaCl)
200 mg/L de cloreto de potássio (KCl)
1150 mg/L Fosfato de sódio dibásico anidro (Na2HPO4)
200 mg/L Fosfato de potássio monobásico anidro (KH2PO4)
Esta composição assegura um pH e um equilíbrio iónico óptimos, adequados a uma vasta gama de aplicações biológicas.
Aplicações da nossa solução PBS
A nossa solução PBS é ideal para várias aplicações na investigação biológica. As suas propriedades isotónicas e não tóxicas tornam-na adequada para a diluição de substâncias e lavagem de recipientes de células. As soluções PBS que contêm EDTA são eficazes para desprender células ligadas e aglomeradas. No entanto, os metais divalentes, como o zinco, não devem ser adicionados ao PBS, uma vez que podem causar precipitação. Nestes casos, recomenda-se a utilização de tampões Good's. Além disso, a nossa solução de PBS é uma alternativa aceitável ao meio de transporte viral para o transporte e armazenamento de vírus de ARN, incluindo o SARS-CoV-2.
Controlo de qualidade
Estéril-filtrado
Armazenamento e prazo de validade
Armazenar entre +2°C e +25°C, protegido da luz.
Depois de aberto, conservar a uma temperatura entre 2°C e 25°C e utilizar no prazo de 24 meses.
Condições de transporte
Temperatura ambiente
Manutenção
Manter refrigerado a uma temperatura entre +2°C e +8°C, ao abrigo da luz. Evitar o congelamento e o aquecimento frequente a +37°C, uma vez que reduz a qualidade do produto.
Não aquecer o meio para além de 37°C nem utilizar fontes de calor não controladas, tais como aparelhos de micro-ondas.
Se apenas uma parte do meio for utilizada, retirar a quantidade necessária e aquecê-la à temperatura ambiente antes de a utilizar.
Composição
Categoria
Componentes
Concentração (mg/L)
Sais
Cloreto de potássio
200
Fosfato de potássio monobásico anidro
200
Cloreto de sódio
8000
Fosfato de sódio dibásico anidro
1150
Método de análise
A CLS oferece testes de curto e longo prazo para a deteção de micoplasma. No primeiro caso, as amostras são testadas imediatamente após a sua chegada, ao passo que no segundo caso é iniciada uma cultura celular e as células são testadas após 14 dias de cultivo sem antibióticos. O teste de micoplasma é efectuado utilizando um sistema de deteção de dois pontos com o PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) e o Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Amostras
Para o teste rápido, é necessário fornecer um mínimo de 50 µl de suspensão celular contendo 50.000 células. A suspensão de células pode ser enviada à temperatura ambiente.
Para o teste premium, fornecer um mínimo de 1 milhão de células num meio de congelação adequado para assegurar uma cultura robusta e saudável para o cultivo e subsequente teste das células. Envie as amostras em gelo seco.
Preencher o Formulário de Amostra de Teste de Micoplasma e incluí-lo no envio da amostra.
Ensaio Colorimétrico de Repetição
Este teste é um ensaio colorimétrico baseado em células. Na presença de micoplasma, uma linha celular repórter induz uma cascata de sinalização que desencadeia uma mudança de cor no meio de vermelho para azul. O ensaio é efectuado em placas multipoços de 96 poços. Os sinais são detectados num espetrofotómetro de microplacas a 620-655 nm. São detectadas todas as espécies de micoplasma e acholeplasma, mas também outros contaminantes da cultura de células, como bactérias.
Amplificação isotérmica
A amplificação isotérmica é um teste rápido e fiável baseado na amplificação isotérmica do ADN específico do micoplasma combinada com a deteção em tempo real utilizando um corante intercalante de ADN. O ensaio é capaz de detetar seis das espécies mais comuns que representam >95% das contaminações: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis e A.laidlawii. Devido à homologia das sequências, serão igualmente detectadas outras espécies de micoplasma (M.pneumoniae, M.gallisepticum e M.synoviae). Para identificar se a amostra é positiva ou negativa para micoplasma, é estudada a temperatura de fusão (Tm).
Conclusão: O papel fundamental da cultura de células de mamíferos na investigação moderna
A cultura de células de mamíferos revolucionou a investigação biológica e médica, fornecendo aos cientistas ferramentas poderosas para estudar processos celulares complexos, mecanismos de doenças e potenciais intervenções terapêuticas. Desde o isolamento de células primárias até ao desenvolvimento de linhas celulares imortalizadas, esta técnica tornou-se uma parte indispensável do conjunto de ferramentas científicas modernas
A viagem da cultura de células de mamíferos começa com técnicas de isolamento cuidadosas, progride através da manutenção meticulosa de células em meios especializados e culmina numa vasta gama de aplicações em vários campos de estudo. Quer se trate da investigação do cancro, da descoberta de medicamentos ou da biologia celular básica, a capacidade de cultivar e manipular células de mamíferos in vitro abriu caminhos sem precedentes para a exploração científica
A chave para o sucesso da cultura de células de mamíferos são as condições cuidadosamente controladas sob as quais as células são mantidas. Desde a composição dos meios de crescimento até aos parâmetros ambientais precisos nas incubadoras, todos os aspectos são optimizados para imitar o mais possível as condições naturais das células. Esta atenção ao pormenor garante a fiabilidade e a reprodutibilidade das experiências, uma pedra angular das boas práticas científicas
O desenvolvimento de linhas celulares imortalizadas, como as células HeLa, amplamente utilizadas, expandiu ainda mais as possibilidades da cultura celular. Estas linhas celulares fornecem modelos celulares consistentes e prontamente disponíveis que aceleraram a investigação em várias disciplinas
Ao olharmos para o futuro, a cultura de células de mamíferos continua a evoluir. Os avanços nas técnicas de cultura 3D, o desenvolvimento de organóides e a utilização de meios quimicamente definidos estão a alargar os limites do que é possível na cultura de células. Estes desenvolvimentos prometem aproximar ainda mais os modelos in vitro da complexidade dos sistemas in vivo, revolucionando potencialmente a descoberta de medicamentos, a medicina personalizada e a nossa compreensão da biologia humana
Em conclusão, a cultura de células de mamíferos continua a ser uma técnica dinâmica e essencial na investigação das ciências da vida. O seu aperfeiçoamento e aplicação contínuos desempenharão, sem dúvida, um papel crucial na abordagem de algumas das questões mais prementes da biologia e da medicina, impulsionando o progresso científico nos próximos anos