Células primárias humanas

O que são células primárias humanas?

As células primárias são a representação mais pura dos respetivos tecidos. São isoladas do tecido e processadas de forma a poderem estabelecer-se num ambiente de cultura com condições ideais. Imitam mais fielmente o estado in vivo e apresentam uma fisiologia normal, uma vez que são derivadas do tecido e não modificadas. Por este motivo, podem servir como modelos úteis para a investigação em farmacologia celular, toxicologia e fisiologia (incluindo estudos sobre metabolismo, envelhecimento e transdução de sinais). É importante ter em conta que as células primárias são mais difíceis de cultivar e manter do que uma linha celular contínua, uma vez que têm um tempo de vida mais curto e deixam de se dividir (ou envelhecem) após um determinado número de divisões celulares. Os estudos das vias de sinalização celular são complicados pela variabilidade inerente às células primárias obtidas de dadores e através das práticas de subcultura. Antes de iniciar estudos de sinalização, os investigadores realizam frequentemente uma triagem para determinar se as células respondem ou não a estímulos comumente utilizados. Para evitar desperdício de tempo e dinheiro, as células primárias podem ser estimuladas para ativar as principais vias de sinalização antes de serem submetidas à triagem.

Porquê utilizar células primárias humanas?

As linhas celulares imortalizadas são frequentemente utilizadas em ensaios celulares. No entanto, os cientistas reconhecem que as alterações biológicas decorrentes das linhas celulares podem ser prejudiciais ao estudo do seu significado fisiológico. A utilização de células primárias humanas melhora o valor fisiológico dos dados obtidos através de culturas celulares, sendo estas cada vez mais consideradas importantes para o estudo de processos biológicos, da evolução de doenças e do desenvolvimento de medicamentos.

As células primárias humanas são amplamente utilizadas em estudos in vitro sobre a comunicação intercelular e intracelular, a biologia do desenvolvimento e os mecanismos subjacentes ao cancro, à doença de Parkinson e à diabetes, entre muitas outras áreas de investigação biológica pré-clínica e de investigação. Os investigadores utilizam há muito linhas celulares imortalizadas para estudar a função dos tecidos; no entanto, as linhas celulares com mutações evidentes e anomalias cromossómicas podem não ser bons substitutos das células normais nem do desenvolvimento da doença nas suas fases iniciais. É agora possível obter um modelo mais preciso de um tipo específico de célula de um tecido, utilizando células primárias humanas isoladas desse tecido e mantidas em meios de cultura de células primárias e suplementos.

O que é a cultura de células primárias?

Em vez de utilizar linhas celulares imortalizadas, a cultura de células primárias envolve o crescimento de células diretamente a partir de um organismo multicelular fora do corpo. Em alguns países, como o Reino Unido, existe reconhecimento legal do facto de que as culturas de células primárias são mais representativas dos tecidos in vivo do que as linhas celulares. No entanto, as células primárias necessitam do substrato e dos nutrientes adequados para crescer e, após um determinado número de divisões, desenvolvem um fenótipo senescente que as leva a deixar de se dividir definitivamente. Estes dois fatores motivam a criação de linhas celulares. Tanto as células primárias imortalizadas naturalmente (por exemplo, as células HeLa) como as células primárias imortalizadas artificialmente (por exemplo, as células HEK) podem ser cultivadas indefinidamente em cultura celular.

Células primárias humanas por tipo de tecido

As células epiteliais, os fibroblastos, os queratinócitos, os melanócitos, as células endoteliais, as células musculares, as células imunitárias e as células estaminais, como as células estaminais mesenquimais, estão entre as células primárias humanas mais frequentemente utilizadas em estudos científicos. Para começar, as culturas são heterogéneas (representando uma mistura dos tipos de células presentes no tecido) e só podem ser mantidas vivas in vitro durante um período de tempo específico. A transformação é um processo in vitro que permite que as células primárias humanas sejam manipuladas para subculturas ilimitadas. A transformação pode ocorrer naturalmente ou ser induzida por substâncias químicas ou vírus. Após sofrer uma transformação genética, uma cultura primária pode dividir-se indefinidamente, dando origem a uma linha celular secundária imortalizada, desde que lhe sejam fornecidos nutrientes e espaço suficientes.

Células endoteliais

O tratamento do cancro, a cicatrização de feridas, a investigação sobre a sinalização celular, o rastreio de alto rendimento e de alto conteúdo e o rastreio toxicológico são apenas algumas das áreas que podem beneficiar da utilização de células endoteliais primárias como ferramenta de investigação.

Queratinócitos

Os queratinócitos, derivados da epiderme da pele humana adulta ou do prepúcio neonatal, desempenham um papel crucial no estudo de doenças de pele como a psoríase e o cancro.

Células epiteliais

Desde estudos sobre o cancro até investigações toxicológicas, as células epiteliais primárias revelaram-se recursos inestimáveis para modelar as defesas naturais do organismo.

Fibroblastos

A indução de células estaminais pluripotentes (iPS) e o estudo da cicatrização de feridas são apenas algumas das muitas aplicações dos fibroblastos primários.

Células imunitárias

As células mononucleares do sangue periférico, abreviadas como PBMC, são células mononucleares do sangue com um núcleo celular redondo. Incluem principalmente linfócitos e monócitos, que desempenham funções importantes no decorrer de uma resposta imunitária. As células mononucleares do sangue periférico são frequentemente utilizadas para diagnosticar infeções ou para detetar uma possível proteção vacinal. Compreender a resposta imunitária celular mediada pelas células T é, muitas vezes, crucial.

Melanócitos

Os melanócitos, células cutâneas especializadas que produzem o pigmento melanina, são úteis como modelos para a investigação em temas como a cicatrização de feridas, a toxicidade, o melanoma, a resposta dérmica à radiação ultravioleta (UV), as doenças de pele e os cosméticos.

Células estaminais

As células estaminais têm o potencial de se diferenciarem numa ampla variedade de tipos celulares. Devido à sua capacidade de diferenciação, oferecem novas oportunidades para a modelagem de tecidos humanos e de condições de saúde.

Células estaminais mesenquimais

As células estaminais mesenquimais, também conhecidas como MSCs, podem ser obtidas a partir de diferentes fontes humanas, como a medula óssea, a gordura (tecido adiposo), o tecido do cordão umbilical (gelatina de Wharton) e o líquido amniótico (o líquido que envolve o feto), e podem ser multiplicadas in vitro. Estas células estaminais estromais adultas têm a capacidade de se desenvolver numa ampla variedade de tipos celulares. Alguns destes tipos celulares incluem células ósseas, células cartilaginosas, células musculares, células neurais, células cutâneas e células da córnea.

Células do músculo liso

No interior dos órgãos ocos, as células musculares lisas primárias (SMCs) revestem o interior e medeiam a contratilidade. Para além do cancro e de outras doenças, as SMCs podem ser utilizadas para modelar a fibrose associada à hipertensão.

Células primárias e linhas celulares

Seja por mutação espontânea, como nas linhas celulares cancerosas transformadas, seja por alteração intencional, como na produção artificial de genes cancerígenos, as linhas celulares contínuas adquiriram o potencial de se reproduzirem infinitamente (imortalizadas). Regra geral, as linhas celulares contínuas são mais fiáveis e convenientes de manusear do que as células primárias. Podem expandir-se indefinidamente e proporcionar acesso rápido a dados essenciais. A utilização de linhas celulares contínuas apresenta certas limitações, incluindo o facto de serem geneticamente modificadas/transformadas, o que pode alterar características fisiológicas e não corresponder às condições in vivo, e de que estas alterações podem acentuar-se ao longo do tempo com um número significativo de passagens.

Avanços na cultura de células primárias

As células primárias têm a reputação notória de serem difíceis de trabalhar. O processo, no entanto, está a tornar-se mais fácil do que nunca, graças aos desenvolvimentos na cultura de células primárias, à disponibilidade de células primárias comerciais com protocolos totalmente otimizados e a novas técnicas de análise que requerem menos intervenção.

A transição da cultura celular bidimensional para a tridimensional é considerada um marco importante na área. A arquitetura específica do tecido, as interações célula-célula e a sinalização mecânica/bioquímica podem ser atenuadas numa cultura 2D. Assim, existe um limite para o valor biológico destas culturas.

Por outro lado, a cultura celular 3D permite que as células se expandam e interajam com uma estrutura extracelular tridimensional. Isto permite que as células interajam entre si e com a matriz extracelular, tornando as culturas 3D mais relevantes do ponto de vista fisiológico. A precisão deste método na previsão de respostas in vivo tornou-o revolucionário em áreas como a descoberta e o desenvolvimento de fármacos. Por este motivo, tecnologias de ponta, como os organóides derivados de doentes e os «órgãos num chip», fornecem modelos altamente contextuais para a triagem e o desenvolvimento de fármacos.

A geração de células primárias constitui um estrangulamento na cultura primária. Normalmente, é necessário um maior volume de tecido para superar este obstáculo, o que pode ser difícil de conseguir. No entanto, a melhoria da sensibilidade analítica está a abrir caminho para o futuro. Por exemplo, a necessidade de cultivar grandes quantidades de células primárias é reduzida através da utilização de tecnologia de célula única, que inclui sequenciação, western blotting e citometria de massa.

Perspetivas promissoras para a cultura de células primárias

As dificuldades gerais da cultura de células primárias estão a ser atenuadas pelos avanços tecnológicos. Por sua vez, este método está a substituir rapidamente outros como o padrão de excelência no estudo e na prática da biologia celular e molecular. O fabrico de vacinas, a substituição de órgãos, as terapias com células estaminais, a investigação do cancro e muito mais deverão beneficiar grandemente dos avanços contínuos na cultura de células primárias.

Dicas e truques para a cultura de células primárias

As necessidades da expansão celular

Os dois métodos mais comuns para cultivar células primárias são em suspensão ou numa superfície (2D). Algumas células são capazes de flutuar livremente na corrente sanguínea sem nunca aderirem a uma superfície (por exemplo, as derivadas do sangue periférico). Foram desenvolvidas diferentes linhas celulares para se desenvolverem em culturas em suspensão, onde podem atingir densidades inatingíveis em condições de crescimento 2D. As células primárias que necessitam de ancoragem para crescer in vitro são denominadas células aderentes e incluem as encontradas em tecidos sólidos. Para melhorar as propriedades de adesão e fornecer outros sinais necessários ao crescimento e à diferenciação, estas células são normalmente cultivadas num recipiente plano de plástico não revestido, mas, ocasionalmente, num microportador. Esta última opção pode ser revestida com proteínas da matriz extracelular (tais como colagénio e laminina). O meio utilizado na cultura celular consiste num meio básico que foi suplementado com os fatores de crescimento e citocinas adequados. Uma incubadora celular é um tipo especial de incubadora de laboratório utilizada para cultivar e manter células a uma temperatura e mistura de gases específicas (normalmente 37 °C, 5% de CO₂ para células de mamíferos). Dependendo do tipo de célula a ser cultivada, as condições ideais podem variar significativamente. Consoante os tipos de células em crescimento, o meio de crescimento ideal terá uma combinação única de fatores, incluindo, entre outros, o pH, a concentração de glicose, os fatores de crescimento e a presença de outros nutrientes.

A presença de antibióticos no meio de crescimento é crucial durante o estabelecimento da cultura primária para prevenir a contaminação proveniente do tecido do hospedeiro. Alguns regimes antibióticos incluem uma combinação de gentamicina, penicilina, estreptomicina e anfotericina B. No entanto, não é aconselhável a utilização de antibióticos durante um período prolongado, uma vez que alguns reagentes (como a anfotericina B) podem ser tóxicos para as células a longo prazo.

A maioria das células primárias entra em senescência e deixa de se dividir após um determinado número de duplicações populacionais, tornando-se crucial mantê-las vivas após o isolamento. A viabilidade celular a longo prazo requer técnicas especializadas de cultura celular e condições de cultura ideais (incluindo o meio adequado, a temperatura adequada, a mistura de gases adequada, o pH adequado, a concentração adequada de fatores de crescimento, a presença de nutrientes e a presença de glicose). Uma vez que muitos dos fatores de crescimento utilizados para suplementar os meios de cultura são obtidos a partir de sangue animal (os ingredientes derivados do sangue apresentam potencial de contaminação), recomenda-se que a sua utilização seja minimizada ou totalmente evitada. É igualmente importante utilizar uma técnica asséptica.

Subcultura e manutenção

Quando as células isoladas aderem à superfície da placa de cultura, isso marca o início da fase de manutenção. A adesão ocorre normalmente 24 horas após o início da cultura. As células devem ser subcultivadas quando atingirem uma determinada percentagem de confluência e estiverem a replicar-se ativamente. Uma vez que as células pós-confluentes podem sofrer diferenciação e apresentar uma proliferação mais lenta após a passagem, é preferível subcultivar as culturas de células primárias antes de atingirem 100% de confluência.

A subcultura em meio fresco mantém o crescimento exponencial das células dependentes de ancoragem. A subcultura de monocamadas interrompe as interações intercelulares e intracelulares na superfície celular. São utilizadas baixas concentrações de enzimas proteolíticas, tais como tripsina/EDTA, para extrair células primárias aderentes de monocamadas ou tecidos. Após serem dissociadas e diluídas numa solução de células individuais, as células são contadas e transferidas para recipientes de cultura novos para se fixarem novamente e se multiplicarem.

Criopreservação e recuperação

A criopreservação preserva as células vivas através do seu congelamento a baixas temperaturas. A criopreservação e a descongelação de células primárias humanas evitam a morte celular e os danos durante o armazenamento e a utilização. As células primárias humanas são crioprotegidas utilizando DMSO ou glicerol (à temperatura correta e com uma taxa de congelamento controlada). O processo de congelamento deve ser progressivo, a -1 °C por minuto, para evitar a formação de cristais de gelo. O armazenamento a longo prazo requer nitrogénio líquido (-196 °C) ou temperaturas inferiores a -130 °C.

Basta submergir as células congeladas num banho-maria a 37 °C durante cerca de 1 a 2 minutos para descongelar as células criopreservadas. As células primárias humanas não devem ser centrifugadas após a descongelação do congelador (uma vez que são extremamente sensíveis a danos durante a recuperação da criopreservação). É adequado para a sementeira das células imediatamente após a descongelação e promove a adesão nas culturas durante as primeiras 24 horas após a sementeira. 1 Após a adesão das células primárias criopreservadas, o meio usado deve ser removido (uma vez que o DMSO é prejudicial para as células primárias e pode causar uma diminuição da viabilidade pós-descongelação).