Células primárias humanas

O que são células primárias humanas?

As células primárias são a representação mais pura dos seus respectivos tecidos. São isoladas do tecido e processadas de modo a poderem estabelecer-se num ambiente de cultura com condições ideais. Imitam melhor o estado in vivo e apresentam uma fisiologia normal porque são derivadas do tecido e não modificadas. Por este motivo, podem servir como modelos úteis para a investigação em farmacologia celular, toxicologia e fisiologia (incluindo estudos do metabolismo, envelhecimento e transdução de sinais). Tenha em atenção que as células primárias são mais difíceis de cultivar e manter do que uma linha celular contínua, porque têm um tempo de vida mais curto e deixam de se dividir (ou senescer) após um determinado número de divisões celulares. Os estudos das vias de sinalização celular são complicados pela variabilidade inerente às células primárias adquiridas de dadores e através de práticas de subcultura. Antes de iniciar os estudos de sinalização, os investigadores efectuam frequentemente um rastreio para determinar se as células respondem ou não aos estímulos habitualmente utilizados. Para evitar o desperdício de tempo e dinheiro, as células primárias podem ser estimuladas para ativar as principais vias de sinalização antes de serem analisadas.

Porquê utilizar células primárias humanas?

As linhas de células imortalizadas são normalmente utilizadas como ensaio celular. No entanto, os cientistas reconheceram que as alterações biológicas provocadas pelas linhas celulares podem ser prejudiciais para o estudo do seu significado fisiológico. A utilização de células primárias humanas melhora o valor fisiológico dos dados obtidos através de culturas de células e são cada vez mais consideradas importantes para o estudo de processos biológicos, da evolução das doenças e do desenvolvimento de medicamentos.

As células primárias humanas são amplamente utilizadas em estudos in vitro da comunicação intercelular e intracelular, da biologia do desenvolvimento e dos mecanismos subjacentes ao cancro, à doença de Parkinson e à diabetes, entre muitas outras áreas de investigação biológica pré-clínica e de investigação. Há muito que os investigadores utilizam linhas celulares imortalizadas para estudar a função dos tecidos; no entanto, as linhas celulares com mutações óbvias e anomalias cromossómicas podem não ser bons substitutos para as células normais e para o desenvolvimento de doenças nas suas fases iniciais. Atualmente, é possível obter um modelo mais preciso de um tipo específico de células de um tecido utilizando células primárias humanas isoladas desse tecido e mantidas em meios e suplementos de cultura de células primárias.

O que é a cultura de células primárias?

Em vez de utilizar linhas celulares imortalizadas, a cultura de células primárias envolve o cultivo de células diretamente a partir de um organismo multicelular fora do corpo. Em alguns países, como o Reino Unido, existe o reconhecimento legal de que as culturas de células primárias são mais representativas dos tecidos in vivo do que as linhas celulares. No entanto, as células primárias necessitam do substrato e dos nutrientes adequados para crescerem e, após um certo número de divisões, desenvolvem um fenótipo senescente que faz com que deixem de se dividir permanentemente. Estes dois factores motivam a criação de linhas celulares. Tanto as células primárias imortalizadas naturalmente (por exemplo, as células HeLa) como as células primárias imortalizadas artificialmente (por exemplo, as células HEK) podem ser cultivadas indefinidamente em cultura celular.

Células primárias humanas por tipos de tecido

As células epiteliais, os fibroblastos, os queratinócitos, os melanócitos, as células endoteliais, as células musculares, as células imunitárias e as células estaminais, como as células estaminais mesenquimais, estão entre as células primárias humanas mais utilizadas em estudos científicos. Para começar, as culturas são heterogéneas (representam uma mistura de tipos de células presentes no tecido) e só podem ser mantidas vivas in vitro durante um período de tempo específico. A transformação é um processo in vitro que permite que as células primárias humanas sejam manipuladas para subculturas ilimitadas. A transformação pode ocorrer naturalmente, ou pode ser induzida por químicos ou vírus. Depois de sofrer uma transformação genética, uma cultura primária pode dividir-se indefinidamente numa linha celular secundária imortalizada, se lhe forem dados nutrientes e espaço suficientes.

Células endoteliais

O tratamento do cancro, a cicatrização de feridas, a investigação da sinalização celular, o rastreio de alto rendimento e de alto conteúdo e o rastreio toxicológico são apenas algumas das áreas que podem beneficiar da utilização de células endoteliais primárias como ferramenta de investigação.

Queratinócitos

Os queratinócitos, derivados da epiderme da pele humana adulta ou do prepúcio neonatal, desempenham um papel crucial no estudo de doenças da pele como a psoríase e o cancro.

Células epiteliais

Desde estudos de cancro a investigações toxicológicas, as células epiteliais primárias provaram ser recursos inestimáveis para modelar as defesas naturais do corpo.

Fibroblastos

A indução de células estaminais pluripotentes (iPS) e o estudo da cicatrização de feridas são apenas algumas das muitas utilizações dos fibroblastos primários.

Células imunitárias

As células mononucleares do sangue periférico, abreviadamente PBMC, são células mononucleares do sangue com um núcleo celular redondo. Incluem principalmente linfócitos e monócitos, que assumem funções importantes no decurso de uma resposta imunitária. As células mononucleares do sangue periférico são frequentemente utilizadas para diagnosticar infecções ou para detetar uma possível proteção vacinal. O conhecimento da resposta imunitária celular mediada pelas células T é muitas vezes crucial.

Melanócitos

Os melanócitos, as células especializadas da pele que produzem o pigmento melanina, são úteis como modelos para a investigação de temas como a cicatrização de feridas, a toxicidade, o melanoma, a resposta dérmica à radiação ultravioleta (UV), as doenças da pele e os cosméticos.

Células estaminais

As células estaminais têm o potencial de se diferenciar numa grande variedade de tipos de células. Devido à sua capacidade de diferenciação, oferecem novas oportunidades para modelar tecidos humanos e condições de saúde.

Células estaminais mesenquimatosas

As células estaminais mesenquimais, também conhecidas como MSC, podem ser obtidas a partir de diferentes fontes humanas, como a medula óssea, a gordura (tecido adiposo), o tecido do cordão umbilical (geleia de Wharton) e o líquido amniótico (o líquido que envolve o feto) e podem ser expandidas in vitro. Estas células estaminais estromais adultas têm a capacidade de se desenvolver numa grande variedade de tipos de células. Alguns destes tipos de células incluem células ósseas, células de cartilagem, células musculares, células neurais, células da pele e células da córnea.

Células musculares lisas

Nos órgãos ocos, as células musculares lisas primárias (SMCs) revestem o interior e medeiam a contratilidade. Para além do cancro e de outras doenças, as SMC podem ser utilizadas para modelar a fibrose da hipertensão.

Células primárias e linhas celulares

Quer por mutação espontânea, como nas linhas celulares cancerígenas transformadas, quer por alteração intencional, como na produção artificial de genes cancerígenos, as linhas celulares contínuas ganharam o potencial de se reproduzirem infinitamente (imortalizadas). Regra geral, as linhas celulares contínuas são mais fiáveis e convenientes do que as células primárias. Podem expandir-se indefinidamente e proporcionar um acesso rápido a dados essenciais. A utilização de linhas celulares contínuas tem certas limitações, incluindo o facto de serem geneticamente modificadas/transformadas, o que pode alterar as caraterísticas fisiológicas e não corresponder às condições in vivo, e que estas podem mudar ainda mais ao longo do tempo com passagens significativas.

Avanços na cultura de células primárias

As células primárias têm uma reputação notória de serem difíceis de trabalhar. No entanto, o processo está a tornar-se mais fácil do que nunca, graças aos desenvolvimentos na cultura de células primárias, à disponibilidade de células primárias comerciais com protocolos totalmente optimizados e a novas técnicas de análise que requerem menos informação.

A passagem da cultura de células bidimensionais para tridimensionais é considerada um marco importante neste domínio. A arquitetura específica dos tecidos, as interações célula-célula e a sinalização mecânica/bioquímica podem ser atenuadas numa cultura 2D. Assim, existe um limite máximo para o valor biológico destas culturas.

Por outro lado, a cultura de células 3D permite que as células se expandam e interajam com uma estrutura extracelular 3D. Isto permite que as células interajam entre si e com a matriz extracelular, tornando as culturas 3D mais relevantes do ponto de vista fisiológico. A precisão deste método na previsão das respostas in vivo tornou-o revolucionário em domínios como a descoberta e o desenvolvimento de medicamentos. Por este motivo, as tecnologias mais avançadas, como os organóides derivados de doentes e os órgãos num chip, fornecem modelos altamente contextuais para o rastreio e o desenvolvimento de medicamentos.

A geração de células primárias é um ponto de estrangulamento na cultura primária. Normalmente, é necessário um maior volume de tecido para ultrapassar este problema, o que pode ser difícil de conseguir. No entanto, a melhoria da sensibilidade analítica está a proporcionar um caminho a seguir. Por exemplo, a necessidade de cultivar grandes quantidades de células primárias é reduzida através da utilização da tecnologia de célula única, que inclui sequenciação, western blotting e citometria de massa.

Perspectivas promissoras para a cultura de células primárias

As dificuldades gerais da cultura de células primárias estão a ser atenuadas pelos avanços tecnológicos. Por sua vez, este método está a substituir rapidamente outros como padrão de ouro no estudo e na prática da biologia celular e molecular. O fabrico de vacinas, a substituição de órgãos, as terapias com células estaminais, a investigação sobre o cancro e muito mais irão beneficiar muito com os avanços contínuos da cultura de células primárias.

Dicas e truques para a cultura de células primárias

As necessidades de expansão celular

Os dois métodos mais comuns para cultivar células primárias são em suspensão ou numa superfície (2D). Algumas células são capazes de flutuar livremente na corrente sanguínea sem nunca se tornarem aderentes a uma superfície (por exemplo, as derivadas do sangue periférico). Diferentes linhas celulares foram concebidas para se desenvolverem em culturas em suspensão, onde podem atingir densidades inatingíveis em condições de crescimento 2D. As células primárias que necessitam de ancoragem para crescer in vitro são designadas por células aderentes e incluem as que se encontram em tecidos sólidos. Para melhorar as propriedades de adesão e fornecer outros sinais necessários para o crescimento e a diferenciação, estas células são normalmente cultivadas num recipiente plano de plástico não revestido, mas ocasionalmente num micro-transportador. Esta última opção pode ser revestida com proteínas da matriz extracelular (como o colagénio e a laminina). O meio utilizado na cultura de células consiste num meio básico que foi suplementado com os factores de crescimento e citocinas adequados. Uma incubadora de células é um tipo especial de incubadora de laboratório utilizada para cultivar e manter as células a uma temperatura e mistura de gases específicas (normalmente 37 °C, 5% CO2 para células de mamíferos). Dependendo do tipo de célula a ser cultivada, as condições óptimas podem ser muito diferentes. Dependendo dos tipos de células que estão a ser cultivadas, o meio de crescimento ideal terá uma combinação única de factores, incluindo, entre outros, o pH, a concentração de glucose, os factores de crescimento e a presença de outros nutrientes.

Os antibióticos no meio de crescimento são cruciais durante o estabelecimento da cultura primária para evitar a contaminação do tecido hospedeiro. Alguns regimes antibióticos incluem uma combinação de gentamicina, penicilina, estreptomicina e anfotericina B. No entanto, não se aconselha a utilização de antibióticos durante um período de tempo prolongado, porque alguns reagentes (como a anfotericina B) podem ser tóxicos para as células a longo prazo.

A maioria das células primárias entra em senescência e deixa de se dividir após um determinado número de duplicações da população, pelo que é crucial mantê-las vivas após o isolamento. A viabilidade celular a longo prazo requer técnicas especializadas de cultura de células e condições de cultura ideais (incluindo o meio certo, a temperatura certa, a mistura de gases certa, o pH certo, a concentração certa de factores de crescimento, a presença de nutrientes e a presença de glucose). Uma vez que muitos dos factores de crescimento utilizados para suplementar os meios são obtidos a partir de sangue animal (os ingredientes derivados do sangue possuem o potencial de contaminação), recomenda-se que a sua utilização seja minimizada ou totalmente evitada. Também é importante utilizar uma técnica asséptica.

Subcultura e manutenção

Quando as células em isolamento aderem à superfície da placa de cultura, este facto marca o início da fase de manutenção. A adesão ocorre normalmente 24 horas após o início da cultura. As células devem ser subcultivadas quando tiverem atingido uma determinada percentagem de confluência e se estiverem a replicar ativamente. Uma vez que as células pós-confluentes podem sofrer diferenciação e apresentar uma proliferação mais lenta após a passagem, é preferível subcultivar culturas de células primárias antes de atingirem 100% de confluência.

A subcultura em meios frescos mantém o crescimento exponencial das células dependentes de ancoragem. A subcultura de monocamadas perturba as interações inter e intracelulares da superfície celular. São utilizadas baixas concentrações de enzimas proteolíticas, como a tripsina/EDTA, para extrair células primárias aderentes de monocamadas ou tecidos. Depois de dissociadas e diluídas numa solução unicelular, as células são contadas e transferidas para novos recipientes de cultura para se voltarem a ligar e multiplicarem.

Criopreservação e recuperação

A criopreservação preserva as células vivas, congelando-as a baixas temperaturas. A criopreservação e descongelação de células primárias humanas previne a morte e os danos celulares durante o armazenamento e a utilização. As células primárias humanas são crioprotegidas utilizando DMSO ou glicerol (à temperatura correta e com uma velocidade de congelação controlada). O processo de congelação deve ser progressivo, a -1 °C por minuto, para evitar a formação de cristais de gelo. O armazenamento a longo prazo requer azoto líquido (-196 °C) ou temperaturas inferiores a -130 °C.

Para descongelar células criopreservadas, basta submergir as células congeladas num banho de água a 37 °C durante cerca de 1 a 2 minutos. As células primárias humanas não devem ser centrifugadas depois de descongeladas (uma vez que são extremamente sensíveis a danos durante a recuperação da criopreservação). É adequado para o plaqueamento de células imediatamente após o descongelamento e promove a fixação em culturas durante as primeiras 24 horas após o plaqueamento. 1 Depois de as células primárias criopreservadas se terem fixado, o meio gasto deve ser removido (uma vez que o DMSO é prejudicial para as células primárias e pode causar uma queda na viabilidade pós-descongelamento).