Primære humane celler

Hva er primære celler fra mennesker?

Primærceller er den reneste representasjonen av sine respektive vev. De isoleres fra vevet og behandles slik at de kan etableres i et kulturmiljø med ideelle forhold. De etterligner in vivo-tilstanden mer nøyaktig og viser normal fysiologi fordi de stammer fra vev i stedet for å være modifisert. På grunn av dette kan de tjene som nyttige modeller for forskning innen cellefarmakologi, toksikologi og fysiologi (inkludert studier av metabolisme, aldring og signaltransduksjon). Husk at primærceller er mer krevende å dyrke og vedlikeholde enn en kontinuerlig cellelinje, fordi de har kortere levetid og vil slutte å dele seg (eller senesere) etter et visst antall celledelinger. Studier av cellesignalveier kompliseres av den iboende variasjonen i primærceller hentet fra donorer og gjennom subkulturpraksis. Før de starter signalstudier, gjennomfører forskere ofte en screening for å avgjøre om cellene reagerer på vanlige stimuli eller ikke. For å unngå å kaste bort tid og penger kan primærceller stimuleres til å aktivere viktige signalveier før de screenes.

Hvorfor bruke humane primærceller?

Immortaliserte cellelinjer brukes ofte som celleassay. Selv om forskere har erkjent at biologiske endringer forårsaket av cellelinjer kan være skadelige når man skal undersøke deres fysiologiske betydning, forbedrer bruken av humane primærceller den fysiologiske verdien av data innhentet gjennom cellekulturer, og de anses i økende grad som viktige for å studere biologiske prosesser, sykdomsforløp og legemiddelutvikling.

Primærceller fra mennesker brukes i stor utstrekning i in vitro-studier av intercellulær og intracellulær kommunikasjon, utviklingsbiologi og mekanismene som ligger til grunn for kreft, Parkinsons sykdom og diabetes, blant mange andre prekliniske og undersøkende biologiske forskningsområder. Forskere har lenge brukt immortalisert cellelinjer til å studere vevsfunksjon; imidlertid er cellelinjer med åpenbare mutasjoner og kromosomavvik kanskje ikke gode erstatninger for normale celler og utviklingen av sykdom i de tidlige stadiene. En mer nøyaktig modell av en spesifikk vevscelletype kan nå oppnås ved å bruke humane primærceller isolert fra det aktuelle vevet og opprettholdt i primærcellekulturmedier og tilskudd.

Hva er primærcellekultur?

I stedet for å bruke immortalisert cellelinjer innebærer primærcellekultur å dyrke celler direkte fra en flercellet organisme utenfor kroppen. I enkelte land, som Storbritannia, er det juridisk anerkjent at primærcellekulturer er mer representative for in vivo-vev enn cellelinjer. Likevel trenger primærceller riktig substrat og næringsstoffer for å vokse, og etter et visst antall delinger utvikler de en senescent fenotype som fører til at de slutter å dele seg permanent. Disse to faktorene er drivkraften bak utviklingen av cellelinjer. Både naturlig immortalisert primærceller (f.eks. HeLa-celler) og kunstig immortalisert primærceller (f.eks. HEK-celler) kan dyrkes på ubestemt tid i cellekultur.

Menneskelige primærceller etter vevstyper

Epitelceller, fibroblaster, keratinocytter, melanocytter, endotelceller, muskelceller, immunceller og stamceller som mesenkymale stamceller er blant de mest brukte humane primærcellene i vitenskapelig forskning. Til å begynne med er kulturene heterogene (de representerer en blanding av celletyper som finnes i vevet), og de kan bare holdes i live in vitro i en bestemt tidsperiode. Transformasjon er en in vitro-prosess som gjør det mulig å manipulere humane primærceller for ubegrenset antall subkulturer. Transformasjon kan skje naturlig, eller den kan fremkalles av kjemikalier eller virus. Etter å ha gjennomgått genetisk transformasjon kan en primærkultur dele seg i det uendelige og danne en udødeliggjort sekundær cellelinje dersom den får tilstrekkelig med næringsstoffer og plass.

Endotelceller

Kreftbehandling, sårheling, forskning på cellesignalering, screening med høy gjennomstrømning og høyt innhold samt toksikologisk screening er bare noen av områdene som kan dra nytte av bruken av primære endotelceller som forskningsverktøy.

Keratinocytter

Keratinocytter, hentet fra epidermis i enten voksen menneskehud eller forhud fra nyfødte, spiller en avgjørende rolle i studiet av hudsykdommer som psoriasis og kreft.

Epitelceller

Fra kreftstudier til toksikologiske undersøkelser har primære epitelceller vist seg å være uvurderlige ressurser for modellering av kroppens naturlige forsvar.

Fibroblaster

Induksjon av pluripotente stamceller (iPS-celler) og studier av sårheling er bare noen av de mange bruksområdene for primære fibroblaster.

Immunceller

Mononukleære celler i perifert blod, forkortet PBMC, er mononukleære celler i blodet med en rund cellekjerne. De består hovedsakelig av lymfocytter og monocytter, som har viktige funksjoner i løpet av en immunrespons. Mononukleære celler fra perifert blod brukes ofte til å diagnostisere infeksjoner eller til å påvise mulig beskyttelse etter vaksinasjon. Innsikt i den cellulære immunresponsen som formidles av T-celler, er ofte avgjørende.

Melanocytter

Melanocytter, de spesialiserte hudcellene som produserer pigmentet melanin, er nyttige som modeller for forskning på temaer som sårheling, toksisitet, melanom, hudens respons på ultrafiolett (UV) stråling, hudsykdommer og kosmetikk.

Stamceller

Stamceller har potensial til å differensiere seg til et bredt spekter av celletyper. Takket være deres evne til å differensiere gir de nye muligheter for modellering av menneskelig vev og helsetilstander.

Mesenchymale stamceller

Mesenchymale stamceller, også kjent som MSC-er, kan hentes fra ulike menneskelige kilder som benmarg, fett (fettvev), navlestrengsvev (Whartons gelé) og fostervann (væsken som omgir fosteret) og kan dyrkes in vitro. Disse voksne stromale stamcellene har evnen til å utvikle seg til et bredt spekter av celletyper. Noen av disse celletypene inkluderer beinceller, bruskceller, muskelceller, nerveceller, hudceller og hornhinneceller.

Glatte muskelceller

I hule organer kler primære glatte muskelceller (SMC-er) innsiden og medierer kontraktilitet. I tillegg til kreft og andre sykdommer kan SMC-er brukes til å modellere hypertensiv fibrose.

Primære celler og cellelinjer

Enten gjennom spontan mutasjon, som i transformerte kreftcellelinjer, eller gjennom bevisst endring, som ved kunstig fremstilling av kreftgener, har kontinuerlige cellelinjer fått evnen til å reprodusere seg i det uendelige (immortaliserte). Som regel er kontinuerlige cellelinjer mer pålitelige og enklere å arbeide med enn primære celler. De kan forplantes i det uendelige og gir rask tilgang til viktige data. Bruken av kontinuerlige cellelinjer har visse begrensninger, blant annet at de er genetisk modifiserte/transformerte, noe som kan endre fysiologiske egenskaper og føre til at de ikke samsvarer med in vivo-forholdene, og at dette kan endre seg ytterligere over tid ved hyppig passering.

Fremskritt innen primærcellekultur

Primærceller har et beryktet rykte for å være vanskelige å arbeide med. Prosessen blir imidlertid enklere enn noensinne takket være utviklingen innen primærcellekultur, tilgjengeligheten av kommersielle primærceller med fullt optimaliserte protokoller og nye analyseteknikker som krever mindre innsats.

Overgangen fra todimensjonal til tredimensjonal cellekultur regnes som en viktig milepæl innen feltet. Vevsspesifikk arkitektur, celle-celle-interaksjoner og mekanisk/biokjemisk signalering kan være svekket i en 2D-kultur. Dermed er det en grense for den biologiske verdien av disse kulturene.

På den annen side gjør 3D-cellekultur det mulig for cellene å vokse og samhandle med et tredimensjonalt ekstracellulært rammeverk. Dette gjør at cellene kan samhandle med hverandre og den ekstracellulære matrisen, noe som gjør 3D-kulturer mer fysiologisk relevante. Denne metodens nøyaktighet når det gjelder å forutsi in vivo-responser har gjort den revolusjonerende innen felt som legemiddelutvikling og -forskning. På grunn av dette gir toppmoderne teknologier, som organoider avledet fra pasienter og «organer på en chip», svært kontekstuelle modeller for legemiddelscreening og -utvikling.

Generering av primærceller er en flaskehals i primærkulturer. Det kreves vanligvis et større volum av vev for å overvinne dette, noe som kan være utfordrende å oppnå. Imidlertid gir forbedret analytisk følsomhet en vei fremover. For eksempel reduseres behovet for å dyrke store mengder primærceller ved bruk av enkeltcelleteknologi, som inkluderer sekvensering, western blotting og massecytometri.

Lovende utsikter for primærcellekultur

De generelle utfordringene ved primærcellekultur blir redusert gjennom teknologiske fremskritt. Dette fører til at denne metoden raskt erstatter andre metoder som gullstandarden innen celle- og molekylærbiologi, både i forskning og praksis. Vaksineproduksjon, organtransplantasjon, stamcellebehandlinger, kreftforskning og mye mer vil kunne dra stor nytte av de fortsatte fremskrittene innen primærcellekultur.

Tips og triks for primærcellekultur

Kravene til celleekspansjon

De to vanligste metodene for dyrking av primærceller er i suspensjon eller på en overflate (2D). Noen celler kan flyte fritt i blodstrømmen uten noensinne å feste seg til en overflate (for eksempel celler hentet fra perifert blod). Ulike cellelinjer er utviklet for å trives i suspensjonskulturer, der de kan oppnå tettheter som er umulige å oppnå under 2D-vekstforhold. Primærceller som trenger feste for å vokse in vitro kalles vedheftende celler og inkluderer celler som finnes i fast vev. For å forbedre vedheftsegenskapene og tilføre andre signaler som er nødvendige for vekst og differensiering, dyrkes disse cellene vanligvis i et flatt, ubelagt plastkar, men av og til på en mikrobærer. Det sistnevnte alternativet kan være belagt med ekstracellulære matriksproteiner (som kollagen og laminin). Mediet som brukes i cellekultur består av et grunnmedium som er tilsatt de riktige vekstfaktorene og cytokinene. En celleinkubator er en spesiell type laboratorieinkubator som brukes til å dyrke og opprettholde celler ved en bestemt temperatur og gassblanding (vanligvis 37 °C, 5 % CO₂ for pattedyrceller). Avhengig av hvilken type celle som dyrkes, kan de optimale forholdene variere betydelig. Avhengig av hvilke celletyper som dyrkes, vil det optimale vekstmediet ha en unik kombinasjon av faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, pH, glukosekonsentrasjon, vekstfaktorer og tilstedeværelsen av andre næringsstoffer.

Antibiotika i vekstmediet er avgjørende under etableringen av primærkulturen for å forhindre kontaminering fra vertsvevet. Noen antibiotikabehandlinger består av en kombinasjon av gentamicin, penicillin, streptomycin og amfotericin B. Det anbefales imidlertid ikke å bruke antibiotika over lengre tid, da enkelte midler (som amfotericin B) kan være giftige for cellene på lang sikt.

De fleste primære celler gjennomgår senesens og slutter å dele seg etter et visst antall populasjonsfordoblinger, noe som gjør det avgjørende å holde dem i live etter isolering. Langvarig cellelevbarhet krever avanserte cellekulturteknikker og ideelle dyrkingsforhold (inkludert riktig medium, riktig temperatur, riktig gassblanding, riktig pH, riktig konsentrasjon av vekstfaktorer, tilstedeværelse av næringsstoffer og tilstedeværelse av glukose). Siden mange av vekstfaktorene som brukes til å supplere medier, hentes fra dyreblod (de blodavledede ingrediensene har potensial for forurensning), anbefales det at bruken av dem minimeres eller unngås helt. Det er også viktig å bruke en aseptisk teknikk.

Subkultur og vedlikehold

Når isolerte celler fester seg til overflaten av dyrkingsskålen, markerer dette begynnelsen på vedlikeholdsfasen. Festing skjer vanligvis 24 timer etter at dyrkingen er startet. Cellene bør subkultiveres når de har nådd en viss konfluensprosent og replikerer aktivt. Siden celler som har nådd konfluens kan gjennomgå differensiering og vise langsommere proliferasjon etter passasje, er det best å subkultivere primære cellekulturer før de når 100 % konfluens.

Subkultivering i ferskt medium opprettholder den eksponentielle veksten av forankringsavhengige celler. Subkultivering av monolag forstyrrer inter- og intracellulære interaksjoner på celleoverflaten. Lave konsentrasjoner av proteolytiske enzymer, som trypsin/EDTA, brukes til å ekstrahere vedheftende primærceller fra monolag eller vev. Etter at cellene er dissociert og fortynnet til en enkeltcelleoppløsning, telles de og overføres til ferske dyrkningsbeholdere for å feste seg på nytt og formere seg.

Kryokonservering og gjenvinning

Kryokonservering bevarer levende celler ved å fryse dem ned ved lave temperaturer. Kryokonservering og tining av humane primærceller forhindrer celledød og skade under lagring og bruk. Humane primærceller kryobeskyttes ved hjelp av DMSO eller glyserol (ved riktig temperatur og med en kontrollert frysetakt). Fryseprosessen må foregå gradvis, med -1 °C per minutt, for å forhindre dannelse av iskrystaller. Langtidslagring krever flytende nitrogen (-196 °C) eller temperaturer under -130 °C.

Det er nok å senke de frosne cellene ned i et vannbad på 37 °C i omtrent 1 til 2 minutter for å tine kryokonserverte celler. Primærceller fra mennesker bør ikke sentrifugeres etter tining fra fryseren (da de er ekstremt følsomme for skade under gjenoppretting etter kryokonservering). Det er egnet for utplating av celler umiddelbart etter tining, og det fremmer vedheft i kulturer i løpet av de første 24 timene etter utplating. 1 Etter at de kryokonserverte primærcellene har festet seg, må det brukte mediet fjernes (siden DMSO er skadelig for primærceller og kan føre til en nedgang i levedyktigheten etter tining).