Primære humane celler

Hva er humane primærceller?

Primære celler er den reneste representasjonen av deres respektive vev. De isoleres fra vevet og behandles slik at de kan etablere seg i en kultur med ideelle forhold. De etterligner i større grad in vivo-tilstanden og viser normal fysiologi fordi de er avledet fra vev i stedet for å være modifisert. På grunn av dette kan de fungere som nyttige modeller for forskning innen cellulær farmakologi, toksikologi og fysiologi (inkludert studier av metabolisme, aldring og signaltransduksjon). Husk at primærceller er mer utfordrende å dyrke og vedlikeholde enn en kontinuerlig cellelinje, fordi de har kortere levetid og slutter å dele seg (eller eldes) etter et visst antall celledelinger. Studier av cellenes signalveier kompliseres av den iboende variabiliteten i primærceller som er anskaffet fra donorer og gjennom subkulturer. Før forskerne setter i gang med signalstudier, må de ofte gjennomføre en screening for å finne ut om cellene reagerer på vanlige stimuli eller ikke. For å unngå å kaste bort tid og penger kan primærceller stimuleres til å aktivere de viktigste signalveiene før de screenes.

Hvorfor bruke humane primærceller?

Udødeliggjorte cellelinjer brukes ofte som celleassay. Selv om forskere har erkjent at biologiske endringer på grunn av cellelinjer kan være skadelige når man studerer deres fysiologiske betydning. Bruken av humane primærceller forbedrer den fysiologiske verdien av data som er innhentet gjennom cellekulturer, og de anses i økende grad som viktige for å studere biologiske prosesser, sykdomsutvikling og utvikling av legemidler.

Humane primærceller er mye brukt i in vitro-studier av intercellulær og intracellulær kommunikasjon, utviklingsbiologi og mekanismene som ligger til grunn for kreft, Parkinsons sykdom og diabetes, blant mange andre prekliniske og utforskende biologiske forskningsområder. Forskere har lenge brukt udødeliggjorte cellelinjer til å studere vevsfunksjon, men cellelinjer med åpenbare mutasjoner og kromosomavvik er ikke nødvendigvis gode surrogater for normale celler og sykdomsutvikling i tidlige stadier. En mer nøyaktig modell av en spesifikk vevstype kan nå oppnås ved å bruke humane primærceller som er isolert fra det aktuelle vevet og vedlikeholdt i primærcellekulturmedier og -tilskudd.

Hva er primærcellekultur?

I stedet for å bruke udødeliggjorte cellelinjer innebærer primærcellekultur at man dyrker celler direkte fra en flercellet organisme utenfor kroppen. I noen land, for eksempel Storbritannia, er det juridisk anerkjent at primærcellekulturer er mer representative for in vivo-vev enn cellelinjer. Likevel trenger primærceller det rette substratet og de rette næringsstoffene for å vokse, og etter et visst antall delinger utvikler de en senescent fenotype som gjør at de slutter å dele seg permanent. Disse to faktorene motiverer til å lage cellelinjer. Både naturlig udødeliggjorte primærceller (f.eks. HeLa-celler) og kunstig udødeliggjorte primærceller (f.eks. HEK-celler) kan dyrkes på ubestemt tid i cellekultur.

Humane primærceller etter vevstype

Epitelceller, fibroblaster, keratinocytter, melanocytter, endotelceller, muskelceller, immunceller og stamceller som mesenkymale stamceller er blant de mest brukte humane primærcellene i vitenskapelige studier. Til å begynne med er kulturene heterogene (de representerer en blanding av celletyper som finnes i vevet), og de kan bare holdes i live in vitro i en bestemt tidsperiode. Transformasjon er en in vitro-prosess som gjør det mulig å manipulere humane primærceller i et ubegrenset antall subkulturer. Transformasjon kan skje naturlig, eller den kan induseres med kjemikalier eller virus. Etter å ha gjennomgått genetisk transformasjon kan en primærkultur dele seg i det uendelige til en udødeliggjort sekundær cellelinje hvis den får nok næring og plass.

Endotelceller

Kreftbehandling, sårheling, forskning på cellesignalering, screening med høy gjennomstrømning og høyt innhold samt toksikologisk screening er bare noen av områdene som kan dra nytte av primære endotelceller som forskningsverktøy.

Keratinocytter

Keratinocytter, som stammer fra epidermis fra enten voksen hud eller nyfødt forhud, spiller en avgjørende rolle i studier av hudsykdommer som psoriasis og kreft.

Epitelceller

Primære epitelceller har vist seg å være uvurderlige ressurser for modellering av kroppens naturlige forsvar, fra kreftstudier til toksikologiske undersøkelser.

Fibroblaster

Indusering av pluripotente stamceller (iPS-celler) og studier av sårheling er bare noen få av de mange bruksområdene for primære fibroblaster.

Immunceller

Perifere mononukleære blodceller, forkortet PBMC, er mononukleære celler i blodet med en rund cellekjerne. De består hovedsakelig av lymfocytter og monocytter, som har viktige funksjoner i løpet av en immunrespons. Perifere mononukleære blodceller brukes ofte til å diagnostisere infeksjoner eller til å påvise mulig vaksinasjonsbeskyttelse. Innsikt i den cellulære immunresponsen som formidles av T-celler, er ofte avgjørende.

Melanocytter

Melanocytter, de spesialiserte hudcellene som produserer pigmentet melanin, er nyttige som modeller for forskning på temaer som sårheling, toksisitet, melanom, dermal respons på ultrafiolett (UV) stråling, hudsykdommer og kosmetikk.

Stamceller

Stamceller har potensial til å differensiere til en rekke ulike celletyper. På grunn av deres evne til å differensiere gir de nye muligheter for modellering av menneskelig vev og helsetilstander.

Mesenkymale stamceller

Mesenkymale stamceller, også kjent som MSC, kan utvinnes fra ulike humane kilder som benmarg, fett (fettvev), navlestrengsvev (Whartons gelé) og fostervann (væsken som omgir et foster), og kan ekspanderes in vitro. Disse voksne stromale stamcellene har evnen til å utvikle seg til en lang rekke ulike celletyper. Noen av disse celletypene omfatter benceller, bruskceller, muskelceller, nerveceller, hudceller og hornhinneceller.

Glatte muskelceller

I hule organer finnes det primære glatte muskelceller (SMC) som kler innsiden og sørger for kontraktilitet. I tillegg til kreft og andre sykdommer kan SMC brukes til å modellere hypertensjonsfibrose.

Primære celler og cellelinjer

Kontinuerlige cellelinjer har fått potensialet til å reprodusere seg i det uendelige (udødeliggjort), enten ved spontan mutasjon, som i transformerte kreftcellelinjer, eller ved tilsiktet endring, som i kunstig produksjon av kreftgener. Som regel er kontinuerlige cellelinjer mer pålitelige og praktiske å håndtere enn primærceller. De kan ekspandere i det uendelige og gir rask tilgang til viktige data. Bruken av kontinuerlige cellelinjer har visse begrensninger, blant annet det faktum at de er genetisk modifiserte/transformerte, noe som kan endre fysiologiske egenskaper og ikke samsvare med in vivo-tilstanden, og at dette kan endre seg ytterligere over tid med betydelig passering.

Fremskritt innen primærcellekultur

Primærceller har rykte på seg for å være vanskelige å arbeide med. Prosessen er imidlertid blitt enklere enn noensinne takket være utviklingen innen primærcellekultur, tilgjengeligheten av kommersielle primærceller med fullt optimaliserte protokoller og nye analyseteknikker som krever mindre innsats.

Overgangen fra todimensjonal til tredimensjonal celledyrking anses som en viktig milepæl på feltet. Vevsspesifikk arkitektur, celle-celle-interaksjoner og mekanisk/biokjemisk signalering kan bli dempet i en 2D-kultur. Dermed er det et tak for den biologiske verdien av disse kulturene.

På den annen side gjør 3D-cellekulturer det mulig for cellene å ekspandere og samhandle med et ekstracellulært 3D-rammeverk. Dette gjør at cellene kan samhandle med hverandre og den ekstracellulære matriksen, noe som gjør 3D-kulturer mer fysiologisk relevante. Metodens nøyaktighet når det gjelder å forutsi in vivo-responser, har gjort den revolusjonerende på felt som legemiddelutvikling og -oppdagelse. På grunn av dette gir moderne teknologi, som organoider avledet fra pasienter og organer på en chip, svært kontekstuelle modeller for screening og utvikling av legemidler.

Generering av primærceller er en flaskehals i primærkulturer. For å overvinne denne flaskehalsen kreves det vanligvis et større volum vev, noe som kan være utfordrende å få til. Forbedret analytisk sensitivitet er imidlertid en vei fremover. Behovet for å dyrke store mengder primærceller kan for eksempel reduseres ved hjelp av enkeltcelleteknologi, som omfatter sekvensering, western blotting og massecytometri.

Lovende fremtidsutsikter for primærcelledyrking

De generelle problemene med primærcelledyrking er i ferd med å bli redusert av teknologiske fremskritt. I sin tur er denne metoden i ferd med å erstatte andre metoder som gullstandarden i studier og praksis innen celle- og molekylærbiologi. Vaksineproduksjon, organerstatning, stamcelleterapi, kreftforskning og mye mer vil kunne dra stor nytte av de stadige fremskrittene innen primærcellekultur.

Tips og triks for primær celledyrking

Behovene for celleekspansjon

De to vanligste metodene for dyrking av primærceller er i suspensjon eller på en overflate (2D). Noen celler kan flyte fritt i blodbanen uten å feste seg til en overflate (for eksempel celler fra perifert blod). Ulike cellelinjer har blitt konstruert for å trives i suspensjonskulturer, der de kan nå tettheter som er uoppnåelige under 2D-vekstbetingelser. Primære celler som trenger forankring for å vokse in vitro, kalles adherente celler, og omfatter også celler som finnes i fast vev. For å forbedre adhesjonsegenskapene og tilføre andre signaler som er nødvendige for vekst og differensiering, dyrkes disse cellene vanligvis i en flat, ubelagt plastbeholder, men av og til også i en mikrobærer. Sistnevnte kan være belagt med ekstracellulære matriksproteiner (som kollagen og laminin). Mediet som brukes i cellekulturer, består av et basisk medium som er tilsatt de riktige vekstfaktorene og cytokinene. En celleinkubator er en spesiell type laboratorieinkubator som brukes til å dyrke og vedlikeholde celler ved en bestemt temperatur og gassblanding (vanligvis 37 °C, 5 % CO2 for pattedyrceller). De optimale forholdene kan være svært forskjellige, avhengig av hvilken celletype som dyrkes. Avhengig av hvilke celletyper som dyrkes, vil det optimale vekstmediet ha en unik kombinasjon av faktorer, inkludert, men ikke begrenset til, pH, glukosekonsentrasjon, vekstfaktorer og tilstedeværelsen av andre næringsstoffer.

Antibiotika i vekstmediet er avgjørende under etableringen av primærkulturen for å forhindre kontaminering fra vertsvevet. Noen antibiotikaregimer inneholder en kombinasjon av gentamicin, penicillin, streptomycin og amfotericin B. Bruk av antibiotika over lengre tid anbefales imidlertid ikke, fordi noen reagenser (for eksempel amfotericin B) kan være giftige for cellene på lang sikt.

De fleste primærceller går gjennom senescens og slutter å dele seg etter et visst antall populasjonsfordoblinger, noe som gjør det avgjørende å holde dem i live etter isolering. Langsiktig levedyktighet av cellene krever gode celledyrkingsteknikker og ideelle dyrkingsforhold (inkludert riktig medium, riktig temperatur, riktig gassblanding, riktig pH, riktig konsentrasjon av vekstfaktorer, tilstedeværelse av næringsstoffer og tilstedeværelse av glukose). Siden mange av vekstfaktorene som brukes til å supplere medier, er utvunnet fra dyreblod (de blodbaserte ingrediensene har potensial for kontaminering), anbefales det at bruken av dem minimeres eller unngås helt. Det er også viktig å bruke en aseptisk teknikk.

Subkultur og vedlikehold

Når isolerte celler fester seg til overflaten av dyrkningsskålen, begynner vedlikeholdsfasen. Tilheftingen skjer vanligvis 24 timer etter at dyrkingen er påbegynt. Cellene bør subkultiveres når de har nådd en viss konfluensprosent og replikerer seg aktivt. Ettersom celler som har nådd en viss konfluensprosent, kan gjennomgå differensiering og proliferere langsommere etter passering, er det best å subkultivere primære cellekulturer før de når 100 % konfluens.

Subkultur i ferske medier opprettholder den eksponentielle veksten av celler som er avhengig av forankring. Subkultur av monolag forstyrrer inter- og intracellulære celleoverflateinteraksjoner. Lave konsentrasjoner av proteolytiske enzymer, som trypsin/EDTA, brukes til å ekstrahere adherente primærceller fra monolag eller vev. Etter dissosiasjon og fortynning til en enkeltcelleløsning telles cellene og overføres til nye kulturbeholdere for å feste seg på nytt og formere seg.

Kryopreservering og utvinning

Kryopreservering bevarer levende celler ved å fryse dem ned ved lave temperaturer. Kryopreservering og tining av humane primærceller forhindrer celledød og skade under lagring og bruk. Humane primærceller kryopreserveres ved hjelp av DMSO eller glyserol (ved riktig temperatur og med en kontrollert frysehastighet). Fryseprosessen må være progressiv, med -1 °C hvert minutt, for å forhindre dannelse av iskrystaller. Langtidslagring krever flytende nitrogen (-196 °C) eller temperaturer under -130 °C.

Det er nok å senke frosne celler ned i et 37 °C varmt vannbad i ca. 1 til 2 minutter for å tine kryopreserverte celler. Humane primærceller bør ikke sentrifugeres etter at de er tint opp fra fryseren (da de er ekstremt følsomme for skader under gjenopprettingen fra kryopreservering). Det er egnet for utplating av celler umiddelbart etter tining, og det fremmer feste i kulturer i løpet av de første 24 timene etter utplating. 1 Etter at de kryopreserverte primærcellene har festet seg, må det brukte mediet fjernes (da DMSO er skadelig for primærceller og kan føre til redusert levedyktighet etter opptining).