Cellekultur hos pattedyr: Grunnleggende prinsipper og teknikker
Pattedyrcellekultur er en hjørnesteinsteknikk i biologisk forskning, som gjør det mulig for forskere å studere celler i et kontrollert miljø utenfor levende organismer. Denne prosessen innebærer å isolere celler fra vev, holde dem under nøye kontrollerte forhold og oppformere dem til ulike eksperimentelle formål. Cellekulturer fra pattedyr er avgjørende for å forstå cellulære prosesser og sykdomsmekanismer og for å utvikle nye behandlingsformer, blant annet ved hjelp av udødelige cellelinjer
Nøkkelinformasjon:
- Celler kan isoleres fra vev ved hjelp av enzymatisk fordøyelse eller explantatkulturmetoder
- Primære celler har begrenset levetid, mens udødelige cellelinjer kan formere seg i det uendelige
- Kulturforholdene, inkludert sammensetningen av vekstmediet, er avgjørende for cellenes overlevelse og spredning
- Celler kan dyrkes i suspensjon eller som adherente kulturer, avhengig av celletype og forskningsbehov
- Vanlige dyrkingsmedier omfatter MEM, DMEM og RPMI 1640, som alle er skreddersydd for spesifikke celletyper
- Typiske vekstbetingelser er 37 °C, 5 % CO2 og 95 % relativ luftfuktighet
- Serumalternativer som humant blodplatelysat (hPL) brukes i økende grad for å unngå potensielle kontamineringsproblemer
Teknikker for celleisolering
Prosessen med å etablere en cellekultur begynner med å isolere celler fra vev. Det finnes flere metoder for å oppnå dette, og hver av dem passer til ulike vevstyper og forskningsmål. For blodprøver er det relativt enkelt å isolere celler, og det er først og fremst de hvite blodcellene som skal dyrkes på grunn av deres vekstegenskaper. Fast vev krever mer komplekse isolasjonsteknikker. En vanlig metode er enzymatisk fordøyelse, der enzymer som kollagenase, trypsin eller pronase brukes til å bryte ned den ekstracellulære matriksen og frigjøre individuelle celler i suspensjon. Alternativt kan forskerne bruke explantatkulturmetoden, der små vevsbiter plasseres direkte i vekstmedier, slik at cellene kan vandre ut og formere seg. Valget mellom disse metodene avhenger ofte av den spesifikke vevstypen, den ønskede cellepopulasjonen og den tiltenkte eksperimentelle bruken. Det er viktig å merke seg at celler som isoleres direkte fra en organisme, kalles primærceller, og med noen unntak, som celler fra svulster, har de vanligvis en begrenset levetid i kultur før de gjennomgår senescens
Viktige produkter for dyrking av pattedyrceller
| Produktnavn | Produktnummer | Kategori | Anvendelse |
|---|---|---|---|
| DMEM, m: 4,5 g/L glukose, m: 4 mM L-glutamin, m: 1,5 g/L NaHCO3, m: 1,0 mM natriumpyruvat | 820300a | Kulturmedier | Universalmedium for ulike celletyper fra pattedyr |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), m: 3,1 g/L glukose, m: 1,6 mM L-glutamin, m: 15 mM HEPES, m: 1,0 mM natriumpyruvat, m: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Kulturmedier | Egnet for et bredt spekter av pattedyrceller, spesielt epitelceller |
| RPMI 1640, m: 2,1 mM stabil glutamin, m: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kulturmedier | Vanligvis brukt til lymfoide celler og hybridcellelinjer |
| Accutase | 830100 | Celledissosiasjon | Skånsom celledissosiasjonsløsning for adherente celler |
| Frysemedium CM-1 | 800150 | Kryopreservering | For frysing og langtidslagring av pattedyrceller |
| Frysemedium CM-ACF, serumfritt | 800650 | Kryopreservering | Animalsk komponentfritt medium for nedfrysing av celler |
| PBS | 860015 | Bufferløsning | For vasking av celler og opprettholdelse av pH-balanse |
| Vekstmedium for endotelceller | 820731 | Spesialisert medium | Optimalisert for dyrking av endotelceller |
| Mykoplasma-testing | 900159 | Kvalitetskontroll | Nødvendig for å påvise mykoplasmaforurensning i kulturer |
| Autentisering av cellelinjer - human | 900154 | Kvalitetskontroll | Verifiserer identiteten til humane cellelinjer |
Denne tabellen viser et utvalg av viktige produkter for dyrking av pattedyrceller. For vårt komplette utvalg av celledyrkingsprodukter, inkludert spesialiserte medier og reagenser, kan du gå til vår kategoriside for medier og reagenser.
- et skånsomt alternativ til Trypsin
Accutase er en celledissosiasjonsløsning som revolusjonerer cellekulturindustrien. Det er en blanding av proteolytiske og kollagenolytiske enzymer som etterligner virkningen av trypsin og kollagenase. I motsetning til trypsin inneholder Accutase ingen pattedyr
- eller bakteriekomponenter og er mye mer skånsom mot cellene, noe som gjør den til en ideell løsning for rutinemessig løsgjøring av celler fra standard vevskulturplast og adhesjonsbelagt plast. I dette blogginnlegget skal vi se nærmere på fordelene og bruksområdene til Accutase, og hvordan det endrer spillet innen cellekultur.
Fordeler med Accutase
Accutase har flere fordeler sammenlignet med tradisjonelle trypsinløsninger. For det første kan den brukes når det er behov for skånsom og effektiv løsgjøring av en hvilken som helst adherente cellelinje, noe som gjør den til en direkte erstatning for trypsin. For det andre fungerer Accutase svært godt på embryonale og nevronale stamceller, og det har vist seg at den opprettholder levedyktigheten til disse cellene etter passering. For det tredje bevarer Accutase de fleste epitoper for påfølgende flowcytometrianalyse, noe som gjør den ideell for analyse av celleoverflatemarkører.
I tillegg trenger ikke Accutase å nøytraliseres ved passering av adherente celler. Ved å tilsette mer media etter at cellene er delt, fortynnes Accutase slik at den ikke lenger er i stand til å løsrive celler. Dette eliminerer behovet for et inaktiveringstrinn og sparer tid for cellekulturteknikerne. Accutase trenger heller ikke å alikvoteres, og en flaske er stabil i kjøleskapet i to måneder.
Bruksområder for Accutase
Accutase er en direkte erstatning for trypsinløsning og kan brukes til passering av cellelinjer. I tillegg fungerer Accutase godt når celler skal løsnes for analyse av mange celleoverflatemarkører ved hjelp av flowcytometri og for cellesortering. Andre nedstrøms bruksområder for Accutase-behandling omfatter analyse av celleoverflatemarkører, virusvekstanalyse, celleproliferasjon, tumorcellemigrasjonsanalyser, rutinemessig cellepassasje, produksjonsoppskalering (bioreaktor) og strømningscytometri.
Sammensetning av Accutase
Accutase inneholder ingen pattedyr
- eller bakteriekomponenter og er en naturlig enzymblanding med proteolytisk og kollagenolytisk enzymaktivitet. Den er formulert i en mye lavere konsentrasjon enn trypsin og kollagenase, noe som gjør den mindre giftig og mer skånsom, men like effektiv.
Effektiviteten til Accutase
Accutase har vist seg å være effektivt når det gjelder å løsrive primær
- og stamceller og opprettholde høy cellelevedyktighet sammenlignet med enzymer av animalsk opprinnelse, som trypsin. 100 % av cellene gjenvinnes etter 10 minutter, og det er ikke farlig å la cellene ligge i Accutase i opptil 45 minutter, takket være Accutases autodigestion.
Oppsummering
Konklusjonen er at Accutase er en kraftfull løsning som er i ferd med å endre spillereglene for cellekultur. Med sin skånsomme natur, effektivitet og allsidighet er Accutase det ideelle alternativet til trypsin. Hvis du er på utkikk etter en pålitelig og effektiv løsning for celledelingen, er Accutase løsningen for deg.
Fosfatbufret saltvann (PBS) er en mye brukt bufferløsning i biologisk og kjemisk forskning. Den spiller en avgjørende rolle når det gjelder å opprettholde pH-balansen og osmolariteten under ulike eksperimentelle prosedyrer, inkludert vevsprosessering og cellekultur. Vår PBS-løsning er omhyggelig formulert med ingredienser av høy renhet for å sikre stabilitet og pålitelighet i hvert eneste eksperiment. Osmolariteten og ionekonsentrasjonene i PBS-løsningen vår etterligner i stor grad de som finnes i menneskekroppen, noe som gjør den isotonisk og ugiftig for de fleste celler.
Sammensetningen av vår PBS-løsning
Vår PBS-løsning er en pH-justert blanding av ultrarene fosfatbuffere og saltvannsløsninger. Ved en 1X arbeidskonsentrasjon inneholder den
8000 mg/L natriumklorid (NaCl)
200 mg/L kaliumklorid (KCl)
1150 mg/L vannfritt dibasisk natriumfosfat (Na2HPO4)
200 mg/L Vannfritt kaliumfosfat monobasisk (KH2PO4)
Denne sammensetningen sikrer en optimal pH
- og ionebalanse, og er egnet for et bredt spekter av biologiske anvendelser.
Bruksområder for vår PBS-løsning
Vår PBS-løsning er ideell for ulike bruksområder innen biologisk forskning. De isotone og giftfrie egenskapene gjør den egnet til fortynning av substanser og skylling av cellebeholdere. PBS-løsninger som inneholder EDTA, er effektive for å løsne celler som sitter fast og klumper seg sammen. PBS bør imidlertid ikke tilsettes toverdige metaller som sink, da dette kan føre til utfelling. I slike tilfeller anbefales Good's buffere. I tillegg er vår PBS-løsning et akseptabelt alternativ til viralt transportmedium for transport og lagring av RNA-virus, inkludert SARS-CoV-2.
Kvalitetskontroll
Sterilfiltrert
Oppbevaring og holdbarhet
Oppbevares ved +2 °C til +25 °C, beskyttet mot lys.
Etter åpning, oppbevares ved 2 °C til 25 °C og brukes innen 24 måneder.
Transportforhold
Omgivelsestemperatur
Vedlikehold
Oppbevares i kjøleskap ved +2 °C til +8 °C i mørke. Unngå frysing og hyppig oppvarming til +37 °C, da det reduserer produktkvaliteten.
Ikke varm opp mediet til mer enn 37 °C eller bruk ukontrollerte varmekilder som mikrobølgeovner.
Hvis bare en del av mediet skal brukes, ta ut den nødvendige mengden og varm den opp til romtemperatur før bruk.
Sammensetning
Kategori
Komponenter
Konsentrasjon (mg/L)
Salter
Kaliumklorid
200
Kaliumfosfat, vannfritt, monobasisk
200
Natriumklorid
8000
Natriumfosfat, vannfritt, dibasisk
1150
Analysemetode
CLS tilbyr både korttids
- og langtidstesting for påvisning av mykoplasma. I førstnevnte testes prøvene umiddelbart etter ankomst, mens i sistnevnte testes cellene etter 14 dagers antibiotikafri dyrking. Mykoplasma-testing utføres ved hjelp av et to-punkts deteksjonssystem med både PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) og Certus QC
- mycoADVANCED deteksjonssett (Certus).
Prøver
For hurtigtesten må du levere minst 50 µl cellesuspensjon som inneholder 50 000 celler. Cellesuspensjonen kan sendes ved omgivelsestemperatur.
For premiumtesten må du levere minst 1 million celler i et egnet frysemedium for å sikre en robust og sunn kultur for dyrking og påfølgende testing av cellene. Vennligst send prøvene på tørris.
Fyll ut Mycoplasma Testing Sample Form og legg det ved prøveforsendelsen.
Kolorimetrisk reporteranalyse
Denne testen er et cellebasert kolorimetrisk assay. I nærvær av mykoplasma induserer en reportercellelinje en signalkaskade som utløser en fargeendring i mediet fra rødt til blått. Analysen utføres i 96-brønners flerbrønnsplater. Signalene detekteres i et mikroplatespektrofotometer ved 620-655 nm. Alle mykoplasma
- og acholeplasma-arter, men også andre kontaminanter i cellekulturer, for eksempel bakterier, detekteres.
Isotermisk amplifikasjon
Isotermisk amplifikasjon er en rask og pålitelig test basert på isotermisk amplifikasjon av mykoplasmaspesifikt DNA kombinert med sanntidsdeteksjon ved hjelp av et DNA-interkalerende fargestoff. Testen er i stand til å påvise seks av de vanligste artene som står for mer enn 95 % av kontamineringene: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis og A.laidlawii. På grunn av sekvenshomologi vil også andre mykoplasmaarter bli påvist (M.pneumoniae, M.gallisepticum og M.synoviae). For å identifisere om prøven er mykoplasmapositiv eller negativ, studeres smeltetemperaturen (Tm).
Konklusjon: Den sentrale rollen som pattedyrcellekultur spiller i moderne forskning
Cellekulturer fra pattedyr har revolusjonert den biologiske og medisinske forskningen, og har gitt forskerne kraftfulle verktøy for å studere komplekse cellulære prosesser, sykdomsmekanismer og potensielle terapeutiske intervensjoner. Fra isolering av primærceller til utvikling av udødeliggjorte cellelinjer har denne teknikken blitt en uunnværlig del av den moderne vitenskapens verktøykasse
Reisen med pattedyrcelledyrking begynner med omhyggelige isoleringsteknikker, går videre til omhyggelig vedlikehold av celler i spesialiserte medier, og kulminerer i et bredt spekter av bruksområder på tvers av ulike fagfelt. Enten det dreier seg om kreftforskning, legemiddelforskning eller grunnleggende cellebiologi, har muligheten til å dyrke og manipulere pattedyrceller in vitro åpnet helt nye muligheter for vitenskapelig utforskning
Nøkkelen til suksessen med dyrking av pattedyrceller er de nøye kontrollerte forholdene som cellene holdes under. Alt fra sammensetningen av vekstmedier til de nøyaktige miljøparametrene i inkubatorene er optimalisert for å etterligne cellenes naturlige forhold så godt som mulig. Denne detaljfokuseringen sikrer påliteligheten og reproduserbarheten til eksperimentene, noe som er en hjørnestein i god vitenskapelig praksis
Utviklingen av udødeliggjorte cellelinjer, som for eksempel de mye brukte HeLa-cellene, har utvidet mulighetene for cellekultur ytterligere. Disse cellelinjene gir konsistente, lett tilgjengelige cellemodeller som har satt fart i forskningen på tvers av en rekke fagfelt
Når vi ser inn i fremtiden, fortsetter utviklingen av pattedyrscelledyrking. Fremskritt innen 3D-kulturteknikker, organoidutvikling og bruk av kjemisk definerte medier flytter grensene for hva som er mulig i cellekultur. Denne utviklingen vil bringe in vitro-modeller enda nærmere kompleksiteten i in vivo-systemer, noe som potensielt kan revolusjonere oppdagelsen av nye legemidler, persontilpasset medisin og vår forståelse av menneskets biologi
For å oppsummere er pattedyrcellekultur fortsatt en dynamisk og viktig teknikk innen biovitenskapelig forskning. Den vil utvilsomt spille en avgjørende rolle når det gjelder å finne svar på noen av de mest presserende spørsmålene innen biologi og medisin, og vil være en pådriver for vitenskapelige fremskritt i årene som kommer