Publicēts: 2023. gads | Pēdējā pārskatīšana: 2026. gada maijs
Izsmeļošs ceļvedis par šūnu sasaldēšanu: dzīvotspējas un sterilitātes nodrošināšana
Šūnu sasaldēšana ir būtisks process šūnu kultūru pārvaldībā, kas nodrošina vērtīgu šūnu līniju ilgtermiņa uzglabāšanu un saglabāšanu. Neatkarīgi no tā, vai strādājat ar cilvēka vai dzīvnieku šūnām, precīzu protokolu ievērošana un stingru aseptisko metožu ievērošana ir ārkārtīgi svarīga, lai panāktu veiksmīgu kriokonservāciju.
Šajā rokasgrāmatā sniegti detalizēti norādījumi par nepieciešamajiem materiāliem, reaģentiem un soli pa solim izklāstītām procedūrām, lai efektīvi sasaldētu šūnas, vienlaikus saglabājot to dzīvotspēju un sterilitāti. Ievērojot šos norādījumus, pētnieki var pārliecinoši uzglabāt un vēlāk atjaunot šūnu kultūras ar minimālu šūnu dzīvotspējas zudumu, saglabājot eksperimentālo rezultātu integritāti un uzticamību.
Lai sāktu, ir būtiski izveidot sterilu darba vidi. Pareizas aseptiskās metodes spēlē izšķirošu lomu kontaminācijas novēršanā un kultūru sterilitātes nodrošināšanā.
Aseptiskā tehnika
Visā procesā ievērojiet aseptiskās metodes, lai nodrošinātu kultūru sterilitāti.
Visaptverošs šūnu sasaldēšanas process
Šī plūsmas shēma sniedz detalizētu vizuālu ceļvedi par būtiskajiem soļiem, kas nepieciešami pareizai šūnu sasaldēšanai. Ievērojiet šīs procedūras, lai nodrošinātu augstu šūnu dzīvotspēju un integritāti kriokonservācijas procesa laikā.
Saldēšanas vides sagatavošana
Sagatavojiet krioprotektīvo sasaldēšanas vidi atbilstoši šūnu tipam:
- FBS saturošas kultūras: 90 % FBS + 10 % DMSO vai 70 % augšanas barotne, 20 % FBS un 10 % DMSO
- Šūnas, kam nepieciešams glicerīns: 90 % FBS + 10 % glicerīns
Apsveriet iespēju iegādāties mūsu iepriekš sagatavoto sasaldēšanas vidi:
- Saldēšanas vidē CM-1: Protokoliem, kuros nepieciešama vidē, kas satur embriju liellopu serumu (FBS)
- Saldēšanas barotne CM-ACF – bez seruma: FBS nesaturoša alternatīva
Marķēšana un dokumentācija
Marķējiet kriovialas ar šādu informāciju:
- Datums
- Pētnieka vārds
- Šūnu skaits
- Pārejas numurs
- Šūnu tips
- Jebkāda papildu informācija (piemēram, ģenētiskas modifikācijas)
Šūnu sagatavošana
Adherentajām šūnām:
- Novērojiet šūnas, līdz tās sasniedz 85–95 % konfluenci
- Aspirējiet veco kultūras vidi
- Noskalojiet šūnu monoslāni ar kalcija un magnija nesaturošu PBS
- Atdaliet šūnas ar Accutase, tripsīnu vai tripsīnu-EDTA un neitralizējiet ar kultūras barotni, ja nepieciešams
- Pārnesiet šūnu suspensiju 50 ml Falcon mēģenē
Suspensijas šūnām:
- Pārbaudiet šūnu blīvumu un veselības stāvokli zem mikroskopa
- Pārnesiet šūnu suspensiju tieši 50 ml Falcon mēģenē
Šūnu skaitīšana un centrifugēšana
- Saskaitiet šūnas, izmantojot hemocitometru vai automātisko šūnu skaitītāju
- Centrifugējiet 300 g 3–5 minūtes istabas temperatūrā, lai nogulsnētu šūnas
- Rūpīgi nosūciet supernatantu, izvairoties no šūnu nogulsnes izkliedēšanas
- Pirms lietošanas sagatavoto sasaldēšanas vidi uzsildiet līdz 37 °C
Kriokonservācija
- Atkārtoti suspendējiet šūnu nogulsnes sasaldēšanas vidē līdz blīvumam 2,0 miljoni šūnu/ml adhezīvajām šūnām un 5 miljoni šūnu/ml suspensijas šūnām vai vēlamajai koncentrācijai
- Ielejiet 1,0 ml (vai vairāk, ja nepieciešams) šūnu suspensijas marķētos kriovialos
- Pirms šūnu pārvietošanas uz ilgtermiņa uzglabāšanu izmantojiet lēnas sasaldēšanas metodi
- ? Metode
- ? Soļi
-
❄️
Manuāla sasaldēšana -
1️⃣ Ievietojiet šūnas sasaldēšanas vidē un turiet 4 °C temperatūras saldētavā 40 minūtes.
2️⃣ Pārvietojiet uz -80 °C temperatūras saldētavu uz 24 stundām.
3️⃣ Uzglabājiet šūnas šķidrā slāpeklī ilgtermiņa uzglabāšanai. -
?
Izmantojot Mr. Frosty -
1️⃣ Sagatavojiet šūnas kriovialās ar sasaldēšanas vidi.
2️⃣ Ievietojiet kriovialas Mr. Frosty konteinerā.
3️⃣ Uzglabājiet -80 °C temperatūrā 24 stundas, pirms pārvietojat uz šķidro slāpekli. -
?
Kontrolētas temperatūras saldētava -
1️⃣ Iestatiet ierīci, lai pakāpeniski pazeminātu temperatūru.
2️⃣ Ievietojiet sagatavotās šūnas saldētavā.
3️⃣ Pēc sasaldēšanas cikla pārvietojiet šūnas uz šķidro slāpekli.
- Uzglabājiet kriovialas temperatūrā zem -130 °C vai šķidrā slāpeklī ilgtermiņa uzglabāšanai.
Materiāli un reaģenti
- 1–2 ml kriovialas
- CoolCell® sasaldēšanas iekārta vai kontrolētas temperatūras sasaldētājs
- Krioprotektīvs sasaldēšanas šķidrums (piemēram, pašgatavots krioprotektīvs šķidrums, CM-1, CM-ACF vai specializēts šķidrums)
- Liellopu augļa serums (FBS) vai kondicionēta vide
- DMSO vai glicerīns
- Kalcija un magnija nesaturošs PBS
- Accutase, tripsīns vai tripsīns-EDTA (adhezīvām šūnām)
- 15 ml vai 50 ml Falcon mēģenes
- Hemocitometrs vai automātiskais šūnu skaitītājs
- Centrifūga