Visaptverošs ceļvedis šūnu sasaldēšanā: Dzīvotspējas un sterilitātes nodrošināšana
Šūnu sasaldēšana ir svarīgs process šūnu kultūru pārvaldībā, kas nodrošina vērtīgu šūnu līniju ilgtermiņa uzglabāšanu un saglabāšanu. Neatkarīgi no tā, vai strādājat ar cilvēku vai dzīvnieku šūnām, precīzu protokolu ievērošana un stingru aseptisku metožu ievērošana ir ļoti svarīga, lai panāktu veiksmīgu kriokonservēšanu.
Šajā rokasgrāmatā sniegti detalizēti norādījumi par nepieciešamajiem materiāliem, reaģentiem un soli pa solim aprakstītām procedūrām, lai efektīvi sasaldētu šūnas, vienlaikus saglabājot to dzīvotspēju un sterilitāti. Ievērojot šīs vadlīnijas, pētnieki var droši uzglabāt un vēlāk atdzīvināt šūnu kultūras ar minimāliem šūnu dzīvotspējas zudumiem, saglabājot savu eksperimentu rezultātu integritāti un ticamību.
Vispirms ir svarīgi izveidot sterilu darba vidi. Lai novērstu piesārņojumu un nodrošinātu kultūru sterilitāti, būtiska nozīme ir pareizām aseptiskām metodēm.
Aseptiskā tehnika
Lai nodrošinātu kultūru sterilitāti, visā procesa gaitā jāievēro aseptiskas metodes.
Visaptverošs šūnu sasaldēšanas process
Šī shēma sniedz detalizētu vizuālu ceļvedi par būtiskākajiem soļiem, kas saistīti ar pareizu šūnu sasaldēšanu. Ievērojiet šīs procedūras, lai nodrošinātu augstu šūnu dzīvotspēju un integritāti kriokonservēšanas procesa laikā.
Saldēšanas barotnes sagatavošana
Sagatavojiet krioprotektīvo sasaldēšanas barotni atbilstoši šūnu tipam:
- FBS saturošas barotnes kultūras: fBS: 90 % FBS + 10 % DMSO vai 70 % barotne, 20 % FBS un 10 % DMSO
- Šūnas, kurām nepieciešams glicerīns: 90 % FBS + 10 % glicerīna
Apsveriet iespēju iegādāties mūsu iepriekš sagatavotu sasaldēšanas barotni:
- CM-1: protokoliem, kam nepieciešama barotne, kas satur Fetal Bovine Serum (FBS)
- Saldēšanas barotne CM-ACF - bez seruma: Alternatīvai bez FBS
Marķēšana un dokumentācija
Marķējiet krioviālus, norādot šādu informāciju:
- Datums
- Pētnieka vārds un uzvārds
- Šūnas numurs
- Pārejas numurs
- Šūnas tips
- Papildu informācija (piemēram, ģenētiskās modifikācijas)
Šūnu sagatavošana
Adherējošām šūnām:
- Šūnas novērot, līdz tās sasniedz 85-95 % saplūšanas pakāpi
- Aspirējiet veco barotni
- Izskalojiet šūnu monoslānīti ar PBS, kas nesatur kalciju un magniju
- Atdalīt šūnas ar Accutase, tripsīnu vai tripsīnu-EDTA un vajadzības gadījumā neitralizēt ar barotni
- Šūnu suspensiju pārnes 50 ml Falcon mēģenē
Suspensijas šūnām:
- Pārbaudīt šūnu blīvumu un veselību mikroskopā
- Šūnu suspensiju pārnest tieši 50 ml Falcon mēģenē
Šūnu skaitīšana un centrifugēšana
- Saskaitīt šūnas, izmantojot hemocitometru vai automātisko šūnu skaitītāju
- Centrifugēt istabas temperatūrā ar 300 g 300 g ātrumu 3-5 minūtes, lai atdalītu šūnas
- Uzmanīgi aspirēt supernatantu, izvairoties no šūnu granulām
- Pirms lietošanas uzsildīt sagatavoto sasaldēšanas barotni līdz 37 °C
Kriokonservēšana
- Resuspendējiet šūnu pelīti saldēšanas barotnē līdz blīvumam 2,0 miljoni šūnu/ml adhēzijas šūnām un 5 miljoni šūnu/ml suspensijas šūnām vai jūsu vēlamajai koncentrācijai
- 1,0 ml (vai vairāk pēc vajadzības) šūnu suspensijas iepildiet marķētās kriovietās
- Pirms šūnu pārvietošanas uz ilgtermiņa uzglabāšanu izmantojiet lēnas sasaldēšanas metodi
| ? Metode | ? Pasākumi |
|---|---|
|
❄️ Manuāla sasaldēšana |
1️⃣ Ievietojiet šūnas sasaldēšanas barotnē 4°C saldētavā uz 40 minūtēm. 2️⃣ Pārceliet uz -80°C saldētavā uz 24 stundām. 3️⃣ Ilgstošai uzglabāšanai glabāt šūnas šķidrā slāpeklī |
|
? Frosty kunga izmantošana |
1️⃣ Sagatavojiet šūnas krioviālos ar saldēšanas barotni. 2️⃣ Ievietojiet krioviālus konteinerā Mr. Frosty. 3️⃣ Pirms pārvietošanas uz šķidro slāpekli 24 stundas uzglabāt -80 °C temperatūrā |
|
? Kontrolēta ātruma saldētava |
1️⃣ Ierīci ieprogrammējiet tā, lai pakāpeniski pazeminātu temperatūru. 2️⃣ Ievietojiet sagatavotās šūnas saldētavā. 3️⃣ Pēc sasaldēšanas cikla šūnas pārceliet uz šķidro slāpekli |
- Glabājiet krioviālus temperatūrā, kas zemāka par -130 °C, vai šķidrā slāpeklī ilgstošai uzglabāšanai.
Materiāli un reaģenti
- 1-2 ml krioviāli
- CoolCell® saldēšanas iekārta vai kontrolētas ātruma pakāpes saldētava
- Krioprotektīvais sasaldēšanas barotne (piemēram, DIY krioprotektanta barotne, CM-1, CM-ACF vai specializēta barotne)
- Fetālais liellopu serums (FBS) vai kondicionēta barotne
- DMSO vai glicerīns
- PBS bez kalcija un magnija
- Akutāze, tripsīns vai tripsīns-EDTA (adhēzijas šūnām)
- 15 ml vai 50 ml Falcon mēģenes
- Hemocitometrs vai automātiskais šūnu skaitītājs
- Centrifūga