Šūnu kultūru disociācijas metodes

Šūnu kultūru disociācija ir svarīgs šūnu kultūru uzturēšanas posms. Tā ietver šūnu atdalīšanu no to augšanas virsmas, lai varētu veikt subkulturēšanu vai novākšanu. Šajā iedaļā aprakstītas divas galvenās metodes: bez fermentu disociācijas buferšķīdumu izmantošana un fermentu reaģentu izmantošana.

1.bez fermentu buferu izmantošana šūnu disociācijai

Šī metode ir saudzīga un saglabā šūnu integritāti, neizmantojot fermentus:

1. Sagatavošana
   • Pirms lietošanas pārliecinieties, ka visi reaģenti ir sasildīti līdz 37 °C, lai izvairītos no šoka šūnām.
2. Augšanas barotnes noņemšana
   • Izmest veco barotni no kultivēšanas trauka.
3. Skalošana
   • Izskalojiet šūnu monoslāņus ar 5 ml PBS bez kalcija un magnija uz T75 kolbu vai 100 mm šķīvi.
   • Uzmanīgi kratīt trauku 30 līdz 60 sekundes istabas temperatūrā.
   • Noskalošanas šķīdumu aspirē un izmet.
   • Vēl vienu reizi atkārtojiet skalošanas darbību.
4. Disociācija
   • Pievieno traukā apmēram 5 ml šūnu disociācijas buferšķīduma, kas nesatur fermentus.
   • 1 līdz 2 minūtes istabas temperatūrā uzmanīgi šūpojiet un mikroskopā pārbaudiet, vai notiek disociācija.
   • Vajadzības gadījumā paklauvējiet kolbu vai trauku pret roku, lai izkustinātu šūnas.
   • Ja šūnas ir saķērušās, ļaujiet tām vēl 2 līdz 5 minūtes nostāvēties istabas temperatūrā un, ja nepieciešams, vēlreiz piesitiet, izmantojot vairāk disociācijas bufera.
   • Kad šūnas ir atdalītas, pievieno vismaz 5 ml pilnvērtīgas barotnes, lai neitralizētu disociācijas buferšķīdumu, un atkārtoti suspendē šūnas.
5. Dzīvotspējas pārbaude
   • Subkultivēšanas laikā kontrolējiet šūnu dzīvotspēju, nodrošinot, ka tā saglabājas virs 90 %.

2.citu reaģentu izmantošana disociācijai

Šī metode ļauj izmantot dažādus disociācijas reaģentus:

1. Izmantotās barotnes noņemšana
   • Izmetiet veco barotni no kultivēšanas trauka.
2. Šūnu mazgāšana
   • Izskalojiet šūnas ar sabalansētu sāls šķīdumu, kas nesatur kalciju un magniju, vai izmantojiet EDTA.
   • Pirms mazgāšanas šķīduma izliešanas uzmanīgi pievienojiet to pusei, kas atrodas pretī šūnām, un 1 līdz 2 minūtes kratiet trauku, pirms mazgāšanas šķīdumu izmetat.
3. Disociācija
   • Uz 25 cm² augšanas virsmas uzklājiet 2 līdz 3 ml izvēlētā disociācijas šķīduma uz 25 cm² augšanas virsmas, nodrošinot, ka tas pārklāj šūnu slāni.
   • Inkubējiet trauku 37 °C temperatūrā un viegli pakratiet. Disociācija parasti notiek 5 līdz 15 minūšu laikā atkarībā no šūnu līnijas.
   • Stingrām šūnām procesu var paātrināt, pieskaroties traukam.
   • Uzmanīgi novērojiet šūnas, lai novērstu pārmērīgu iedarbību un iespējamus bojājumus.
4. Šūnu ievākšana
   • Kad šūnas ir pilnībā atdalījušās, ļaujiet tām savākties trauka apakšā, novietojot to vertikāli.
   • Pievienojiet pilnvērtīgu barotni, pēc tam izkliedējiet un savāciet šūnas, ar pipeti pārberot pāri šūnu slānim.
   • Saskaitīt un turpināt subkultivēšanu.

Izmantojot abas metodes, ir svarīgi noteikt optimālos apstākļus katrai šūnu līnijai, veicot empīriskus novērojumus. Šajā procesā jāsaglabā šūnu dzīvotspēja, kas subkultivēšanas laikā regulāri jāpārbauda, lai tā pārsniegtu 90 %. Šīs procedūras ir pamats, ko pētnieki var pielāgot, pamatojoties uz savām specifiskajām prasībām un šūnu līniju īpašībām.

3.adherento šūnu subkultivēšanas metožu pārskats

Lai efektīvi subkultivētu adherentās šūnas, tās jāatdala no kultūras trauka. Tiek izmantotas dažādas metodes, no kurām katra ir piemērota dažādiem šūnu tipiem un apstākļiem. Izvēloties atdalīšanas metodi, ir būtiski ņemt vērā šūnu līnijas specifiskās vajadzības un eksperimenta mērķus. Regulāra šūnu dzīvotspējas uzraudzība, cenšoties panākt, lai subkultivēšanas laikā šūnu dzīvotspēja būtu lielāka par 90 %, ir būtiska, lai nodrošinātu kultūras nepārtrauktu veselību un produktivitāti. Šeit ir sniegts šo procedūru pārskats: