HaCaT šūnas - ādas bioloģijas un slimību izpēte

2.haCaT šūnu ģenētiskās īpašības un izcelsme

HaCaT šūnas ir spontāni imortizēta cilvēka keratinocītu šūnu līnija, kuras izcelsme ir pieaugušā ādā un kura pārstāv unikālu evolūcijas ceļu. Šīm šūnām ir p53 gēna abu alēļu mutācijas, kas ir tipiskas UV starojuma izraisītām mutācijām [3,4]. Turklāt tiek pieņemts, ka HaCaT šūnas ir radušās, pateicoties p53 audzēja supresora gēna mutācijām, kam sekoja senatnes gēnu zudums [5].

Audzēju nomācošais gēns p53, kas pazīstams ar savu lomu DNS labošanā un kā genoma sargs, izraisa cilvēka ādas reakciju uz DNS bojājumiem [4]. Ir novērots, ka HaCaT šūnas ir daļēji zaudējušas savu aizsardzības mehānismu pret DNS bojājumiem, jo in vivo ir mutējis p53 gēns, padarot tās uzņēmīgas pret citogenētisko izmaiņu uzkrāšanos, reaģējot uz paaugstinātu kultūras temperatūru. Cits HaCaT šūnu imortalizācijas mehānisms ietver palielinātu telomerāzes enzīma aktivitāti [7]. Normālās šūnās telomēri nepārtraukti saīsinās ar katru šūnu dalīšanos, līdz tiek sasniegta šūnu novecošanās. Telomerāze ir specializēts šūnu enzīmu komplekss ar reversās transkriptāzes aktivitāti, kas uztur stabilu telomēru garumu. Turpretī HaCaT šūnās ir ievērojami palielināta telomerāzes aktivitāte, kā rezultātā telomēru garums ir labi saglabājies. Šie novērojumi apstiprina telomerāzes lomu HaCaT šūnu imortalizācijas procesā.

Ir identificētas trīs specifiskas hromosomu translokācijas, kuru rezultātā tiek zaudēta viena hromosomu 3p, 4p un 9p atzaru kopija, tiek iegūts 9q atzars un veidojas izohromosomas. Hromosomas 3p īsā pleca zaudēšana var novest pie HaCaT šūnu novecošanās gēnu zuduma un imortalizācijas [8]. HaCaT šūnas ir hipodiploīdas un tām ir atšķirīgas un stabilas marķieru hromosomas, kas raksturo to monoklonālo izcelsmi. HaCaT šūnu līnijas īpašības un galva tika apstiprinātas, izmantojot DNS pirkstu nospiedumu noteikšanu ar hipervariabilajiem minisatelītu marķieriem [3-6].

3.kā iegūt HaCaT šūnas 5 vienkāršos soļos

4. Noņemiet barotni un izskalojiet pielipušās šūnas, izmantojot 3-5 ml PBS bez kalcija un magnija T25 kolbām vai 5-10 ml T75 kolbām.
5. Pievienojiet 1-2 ml svaigi sagatavota 0,05% EDTA šķīduma T25 kolbām vai 2,5 ml T75 kolbām, nodrošinot, ka viss šūnu slānis ir pārklāts, un 10 minūtes inkubējiet 37 °C temperatūrā.
6. Pievieno 1 ml svaigi sagatavota tripsīna/EDTA (0,05 %/0,025 %) šķīduma uz T25 kolbu vai 2,5 ml uz T75 kolbu, atkal nodrošinot, ka pilnībā pārklāj šūnu slāni. Šūnām jāatdalās 1-2 minūšu laikā.
7. Pārtrauciet tripsīna aktivitāti, pievienojot FBS saturošu šūnu barotni.
8. Šūnas izpludināt jaunās kolbās, kurās ir svaiga šūnu barotne.

4. HaCaT šūnu lietojumi

HaCaT šūnas ir vērtīgs līdzeklis keratinocītu izpētei [9]. Šīs nemirstīgās šūnas darbojas kā pirmeneoplastiskas šūnas un var sniegt ieskatu par izmaiņām, kas saistītas ar ļaundabīgu un neoplastisku transformāciju [10]. Vienslāņa HaCaT šūnu kultūras ir būtiskas šūnu toksicitātes un in vitro brūču dzīšanas analīzes lietojumiem. HaCaT šūnas var izmantot arī, lai novērtētu dažādu aģentu un neoplastisku vai iekaisuma procesu izraisītu ādas toksicitāti. Tās var izmantot, lai analizētu dažādus ādas alerģisko reakciju mehānismus, reaktīvo skābekļa sugu ietekmi un UV starojumu. Pēc stimulācijas HaCaT šūnas var diferencēties un ekspresēt specifiskus diferenciācijas marķierus, piemēram, involucrin, K14 un K10. HaCaT šūnas parasti izmanto arī kā modeli epidermas homeostāzes patofizioloģijas izpētei [6].

HaCaT šūnas pēc transplantācijas saglabā spēju atjaunot strukturētu epidermu in vivo, veidojot stratificētu epidermas struktūru, ko var mainīt starp bazālo un diferencēto stāvokli, mainot kalcija koncentrāciju vidē. Šīs šūnas ļauj arī raksturot vairākus bioloģiskos procesus, piemēram, izmantot tās kā D vitamīna modeļa sistēmu un metabolismu ādā. Tā kā HaCaT šūnas nav ģenētiski modificētas, tās sniedz objektīvu priekšstatu par plašu sākotnējo ģenētisko notikumu spektru cilvēka ādā.

5. Ieteicamie videoklipi: HaCaT šūnu pasaules izpēte

"HaCaT šūnu migrācija": Šajā videoklipā parādīts šūnu migrācijas process HaCaT šūnās. Šūnu migrācija ir būtisks process dažādos bioloģiskos procesos, piemēram, brūču dziedēšanā un vēža metastāžu veidošanā. Videoklipā HaCaT šūnu kustība tiek demonstrēta mikroskopā, vizuāli parādot, kā šīs šūnas migrē. Tiek novērota šūnu aktivitāte, tām pārvietojoties no vienas vietas uz citu, un videomateriālā ir skaidri parādītas izmaiņas, kas šūnās notiek šī procesa laikā.

"Ar HaCaT šūnām veiktais skrāpēšanas tests": Šajā videoklipā parādīts skrāpēšanas tests, kas veikts ar HaCaT šūnām. Scratch Assay ir plaši izmantota metode šūnu migrācijas izpētei, un šajā gadījumā to izmanto, lai analizētu HaCaT šūnu migrāciju. Videoklipā ir parādīts process, kurā uz šūnu kultūras trauka virsmas tiek izveidots skrāpējums, un pēc tam mikroskopā tiek novērots, kā HaCaT šūnas migrē un laika gaitā aizpilda spraugu.

"HaCaT keratinocītu šūnu augšana brūču dzīšanas eksperimentiem": Šajā videoklipā demonstrēts HaCaT keratinocītu šūnu augšanas process brūču dzīšanas eksperimentiem. HaCaT keratinocīti ir bieži izmantota šūnu līnija brūču dzīšanas pētījumos.

"HaCaT šūnu diferenciācija": Šajā videoklipā ir parādīti nepieciešamie soļi HaCaT šūnu diferenciācijai. HaCaT šūnas var diferencēties dažādos ādas šūnu veidos. Video demonstrē HaCaT šūnu izmaiņas to diferenciācijas gaitā, vizuāli parādot dažādus diferenciācijas marķierus un pazīmes. Diferenciācijas procesam ir izšķiroša nozīme normālai ādas funkcionēšanai, un videoklipā ir izcelti dažādie diferenciācijas posmi, kurus iziet HaCaT šūnas.

Atsauces

1. Angel P un Karin M: Jun, Fos un AP-1 kompleksa loma šūnu proliferācijā un transformācijā. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: The regulation of epidermal hyperplastic growth. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
2. Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Izolation and characterization of a spontaneous arising long-lived line of human keratinocytes (NM-1). In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
3. Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutācijas cilvēka imortalizēto epitēlija šūnu līnijās. Kancerogēze 14:833-839, 1993. g
4. Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutāciju karstie punkti saules gaismas ietekmē p53 gēnā nemelanomas ādas vēža gadījumā. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
5. Fusenig NE, Boukamp P. Multiple stages and genetic alterations in immortalization, malignant transformation, and tumor progression of human skin keratinocytes. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
6. Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerase activity in the regenerative basal layer of the epidermis in human skin and in immortal and carcinoma-derived skin keratinocytes. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
7. Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R et al. HaCaT cells as a reliable in vitro differentiation model to dissect the inflammatory/repair response of human keratinocytes. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
8. Boukamp, P. et al. Normal keratinization in a spontaneous immortalized aneuploid human keratinocyte cell line. J. Cell Biol. 106, 1996, 761-771.
9. Gibbs, Graham: Analysing qualitative data. The Sage qualitative research kit. London: Sage 978-0-7619-4980-0.
10. Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Applied research design: a practical guide. Sage: London
11. Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normāla keratinizācija spontāni imortizētā aneuploīdā cilvēka keratinocītu šūnu līnijā. Cell Biol.(1988);106:761-771.