HaCaT šūnas – ādas bioloģijas un slimību izpēte
HaCaT šūnas ir iegūtas no cilvēka epidermas keratinocītiem un tiek plaši izmantotas, lai pētītu epidermas homeostāzi un ar to saistītās patoloģijas. Šīs šūnas tiek uzskatītas par spontāni imortalizētiem cilvēka keratinocītiem, kas ir ievērojams fakts, jo tās ir iegūtas no normālas ādas keratinocītiem, neizraisot krīzi vai augšanas aizturi. Šī unikālā izcelsme piešķir HaCaT šūnām virkni ģenētisko un augšanas īpašību, kas atšķiras no citām šūnu līnijām. Neskatoties uz to, ka in vitro tās izrāda transformētu fenotipu ar klonogēnām īpašībām uz agara vai plastmasas, HaCaT šūnu līnija joprojām nav tumorogēna. Būdamas pirmā stabilā epitēlija šūnu līnija no pieauguša cilvēka ādas, kas parāda normālu diferenciāciju, HaCaT šūnas ir vērtīgs instruments cilvēka šūnu keratinizācijas regulācijas izpētei. Šīm šūnām ir plašs pielietojuma spektrs, pateicoties to spējai efektīvi vairoties un diferenciēties in vitro.
- Augšanas barotne
- Skatīt produkta lapu
- Dubultošanās laiks
- Skatīt produkta lapu
- Augšanas veids
- Adherents
- Bioloģiskās drošības līmenis
- BSL-1
- Pieejams
- Cytion — Pasūtīt HaCaT
- HaCaT šūnu raksturojums
- HaCaT šūnu ģenētiskās īpašības un izcelsme
- Kā ievākt HaCaT šūnas 5 vienkāršos soļos
- HaCaT šūnu pielietojumi
- Ieteicamie video: HaCaT šūnu pasaules izzināšana
HaCaT šūnu īpašības
HaCaT šūnas var kultivēt apstākļos ar zemu kalcija līmeni, un tām ir vārpstas forma bez ciešām šūnu savienojumiem, tāpat kā primārām šūnām, kas tiek uzturētas tādos pašos apstākļos. Normālā epidermā keratinocīti attīstās no cilmes šūnām bazālajā slānī un virzās caur smailveida un granulāro slāni, pirms sasniedz korneālo slāni un atdalās vidē. Šis stingri regulētais līdzsvars starp proliferāciju un atdalīšanos izraisa pilnīgu atjaunošanos vai maiņu ik pēc 28 dienām — sarežģītu procesu, kas pazīstams kā keratinizācija. Šis process ir stingri regulēts un ietver ievērojamas izmaiņas gēnu ekspresijā, struktūras uzbūvē un fermentatīvajā aktivitātē. In vitro un in vivo analīzēm HaCaT šūnām ir jāuztur epidermas keratīni, kas raksturīgi diferencētiem cilvēka epidermas šūnu slāņiem un ir būtiski ādas strukturālās integritātes un elastības uzturēšanai. Lai gan HaCaT šūnās var notikt secīgas hromosomu izmaiņas, tās var nebūt saistītas ar nozīmīgām diferenciācijas problēmām, bet gan liecināt par cilvēka pieaugušo keratinocītu spontānu transformāciju in vitro.
HaCaT šūnu ģenētiskās īpašības un izcelsme
HaCaT šūnas ir spontāni imortalizēta cilvēka keratinocītu šūnu līnija, kas cēlusies no pieaugušā ādas un pārstāv unikālu evolūcijas ceļu. Šīm šūnām ir mutācijas abos p53 gēna alēlos, kas ir tipiski UV starojuma izraisītām mutācijām [3,4]. Turklāt tiek pieņemts, ka HaCaT šūnas ir radušās p53 audzēja supresoru gēna mutāciju rezultātā, kam sekoja senescences gēnu zudums [5].
Tumoru supresoru gēns p53, kas pazīstams ar savu lomu DNS reparācijā un kā genoma sargātājs, izraisa cilvēka ādas reakciju uz DNS bojājumiem [4]. Ir novērots, ka HaCaT šūnas ir daļēji zaudējušas savu aizsardzības mehānismu pret DNS bojājumiem p53 gēna in vivo mutācijas dēļ, padarot tās uzņēmīgas pret citogēnisko izmaiņu uzkrāšanos, reaģējot uz paaugstinātu kultivēšanas temperatūru. Cits HaCaT šūnu nemirstības mehānisms saistīts ar paaugstinātu telomerāzes fermenta aktivitāti [7]. Normālās šūnās telomēri nepārtraukti saīsinās ar katru šūnu dalīšanos, līdz tiek sasniegta šūnu novecošanās. Telomerāze ir specializēts šūnu enzīmu komplekss ar reversās transkriptāzes aktivitāti, kas uztur stabilu telomēru garumu. Pretstatā tam HaCaT šūnās novēro ievērojami paaugstinātu telomerāzes aktivitāti, kā rezultātā tiek labi uzturēts telomēru garums. Šie novērojumi apstiprina telomerāzes lomu HaCaT šūnu nemirstības procesā.
Ir identificētas trīs specifiskas hromosomu translokācijas, kas izraisa vienas hromosomu 3p, 4p un 9p atzaru kopijas zaudējumu, 9q iegūšanu un izohromosomu veidošanos. 3p hromosomas īsā atzara zudums var izraisīt senescences gēnu zudumu un HaCaT šūnu nemirstības iegūšanu [8]. HaCaT šūnas ir hipodiploīdas un tām piemīt izteikti un stabili marķierhromosomi, kas liecina par to monoklonālo izcelsmi. HaCaT šūnu līnijas raksturlielumi un galva tika apstiprināti, izmantojot DNS pirkstu nospiedumu analīzi ar hipervariabliem minisatelītu marķieriem [3-6].
Kā ievākt HaCaT šūnas 5 vienkāršos soļos
- Noņemiet kultūras barotni un noskalojiet piekļāvušās šūnas, izmantojot 3–5 ml PBS bez kalcija un magnija T25 kolbām vai 5–10 ml T75 kolbām.
- Pievienojiet 1–2 ml svaigi pagatavota 0,05 % EDTA šķīduma uz katru T25 kolbu vai 2,5 ml uz katru T75 kolbu, nodrošinot, ka tiek pārklāts viss šūnu slānis, un inkubējiet 37 °C temperatūrā 10 minūtes.
- Pievienojiet 1 ml svaigi pagatavota tripsīna/EDTA (0,05 %/0,025 %) šķīduma uz katru T25 kolbu vai 2,5 ml uz katru T75 kolbu, atkal nodrošinot šūnu slāņa pilnīgu pārklājumu. Šūnām jāatdalās 1–2 minūšu laikā.
- Pārtrauciet tripsīna darbību, pievienojot FBS saturošu šūnu kultūras barotni.
- Pārlejiet šūnas jaunās kolbās, kurās ir svaigs šūnu kultūras barotne.
HaCaT šūnu pielietojumi
HaCaT šūnas ir vērtīgs instruments keratinocītu pētīšanai [9]. Šīs nemirstīgās šūnas darbojas kā preneoplastiskas šūnas un var sniegt ieskatu izmaiņās, kas saistītas ar ļaundabīgu un neoplastisku transformāciju [10]. HaCaT šūnu monoslāņa kultūras ir būtiskas šūnu toksicitātes un in vitro brūču sadzīšanas analīzes lietojumiem. HaCaT šūnas var izmantot arī, lai novērtētu dažādu vielu izraisītu ādas toksicitāti un neoplastiskos vai iekaisuma procesus. Tās var izmantot, lai analizētu dažādus ādas alerģisko reakciju mehānismus, reaktīvo skābekļa savienojumu ietekmi un UV starojuma iedarbību. Pēc stimulācijas HaCaT šūnas var diferencēties un izteikt specifiskus diferenciācijas marķierus, piemēram, involucrīnu, K14 un K10. HaCaT šūnas bieži izmanto arī kā modeli epidermas homeostāzes patofizioloģijas pētīšanai [6].
HaCaT šūnas pēc transplantācijas in vivo saglabā spēju atjaunot strukturētu epidermu, veidojot slāņveida epidermas struktūru, kuru var pārveidot no bazālā stāvokļa uz diferencētu stāvokli, mainot kalcija koncentrāciju barotnē. Šīs šūnas ļauj arī raksturot vairākus bioloģiskos procesus, piemēram, tās var izmantot kā D vitamīna modelisistēmu un pētīt vielmaiņu ādā. Tā kā HaCaT šūnas nav ģenētiski modificētas, tās sniedz objektīvu ieskatu plašajā sākotnējo ģenētisko notikumu spektrā cilvēka ādā.
Ieteicamie video: HaCaT šūnu pasaules izzināšana
"HaCaT šūnu migrācija": Šis video parāda šūnu migrācijas procesu HaCaT šūnās. Šūnu migrācija ir būtisks process dažādos bioloģiskajos procesos, piemēram, brūču sadzīšanā un vēža metastāzēs. Video parāda HaCaT šūnu kustību zem mikroskopa, sniedzot vizuālu priekšstatu par to, kā šīs šūnas migrē. Šūnu aktivitāte tiek novērota, tām pārvietojoties no vienas vietas uz citu, un video sniedz skaidru ilustrāciju par izmaiņām, kas šajā procesā notiek šūnās.
"HaCaT šūnu skrāpējuma tests": Šis video parāda HaCaT šūnu skrāpējuma testu. „Scratch Assay” ir plaši izmantota metode šūnu migrācijas pētīšanai, un šajā gadījumā tā tiek izmantota, lai analizētu HaCaT šūnu migrāciju. Video parāda, kā tiek radīts skrāpējums uz šūnu kultūras trauka virsmas, ko pēc tam novēro zem mikroskopa, kamēr HaCaT šūnas migrē un ar laiku aizpilda atstarpi.
"HaCaT keratinocītu šūnu augšana brūču sadzīšanas eksperimentiem": Šis video parāda HaCaT keratinocītu šūnu augšanas procesu brūču sadzīšanas eksperimentiem. HaCaT keratinocīti ir plaši izmantota šūnu līnija brūču sadzīšanas pētījumos.
"HaCaT šūnu diferenciācija": Šis video parāda nepieciešamos soļus, lai diferencētu HaCaT šūnas. HaCaT šūnas var diferencēties dažādos ādas šūnu tipos. Video parāda izmaiņas HaCaT šūnās to diferenciācijas laikā, vizuāli attēlojot dažādus diferenciācijas marķierus un raksturlielumus. Diferencēšanās process ir ļoti svarīgs normālai ādas darbībai, un video uzsver dažādus HaCaT šūnu diferenciācijas posmus.
Atsauces
- Angel P un Karin M: Jun, Fos un AP-1 kompleksa loma šūnu proliferācijā un transformācijā. Biochim Biophys Acta 1072:129-157, 1991 Argyris TS: Epidermas hiperplastiskās augšanas regulācija. Crit Rev Toxicol 9:151-200, 1981
- Baden HP, Kubilus J, Kvedar JC, Steinberg ML, Wolman SR: Spontāni radušās ilgdzīvojošas cilvēka keratinocītu līnijas (NM-1) izdalīšana un raksturošana. In Vitro Cell Dev Biol 23(3):205-13, 1987
- Lehmann TA, Modali R, Boukamp P, Stanek J, Bennett WP, Welsh JA, Metcalf RA, Stampfer MR, Fusenig NE, Rogan EM, Harriss CC: p53 mutācijas cilvēka nemirstīgajās epitēlija šūnu līnijās. Carcinogenesis 14:833-839, 1993
- Ziegler A-M, Leffell DJ, Kunala S, Sharma HW, Gailani M, Simon JA, Halperin AJ, Baden HP, Shapiro PE, Bale AE, Brash DE: Mutāciju karstie punkti, kas saistīti ar saules gaismu, p53 gēnā nemelanoomas ādas vēža gadījumā. Proc Natl Acad Sci USA 90:4216-4220, 1993
- Fusenig NE, Boukamp P. Daudzi posmi un ģenētiskas izmaiņas cilvēka ādas keratinocītu nemirstības iegūšanā, ļaundabīgā transformācijā un audzēja progresēšanā. Mol Carcinog. 1998;23(3):144-158.
- Harle-Bachor C, Boukamp P: Telomerāzes aktivitāte cilvēka ādas epidermas reģeneratīvajā bazālajā slānī un nemirstīgajos un no karcinomas atvasinātajos ādas keratinocītos. Proc Natl Acad Sci USA 93:6476-81, 1996
- Colombo I, Sangiovanni E, Maggio R, et al. HaCaT šūnas kā uzticams in vitro diferenciācijas modelis cilvēka keratinocītu iekaisuma/reģenerācijas reakcijas izpētei. Mediators Inflamm. 2017;2017:7435621.
- Boukamp, P. et al. Normāla keratinizācija spontāni imortalizētā aneuploīdā cilvēka keratinocītu šūnu līnijā. J. Cell Biol. 106, 1996, 761–771.
- Gibbs, Graham: Kvalitatīvo datu analīze. Sage kvalitatīvās pētniecības komplekts. Londona: Sage 978-0-7619-4980-0.
- Hedrick TE, Bickman L, Rog DJ. 1993. Lietišķā pētījumu plānošana: praktisks ceļvedis. Sage: Londona
- Boukamp P. Petrussevska R. T. Breitkreutz D. Hornung J. Markham A. Fusenig N. E. Normāla keratinizācija spontāni imortalizētā aneuploīdā cilvēka keratinocītu šūnu līnijā. Cell Biol. (1988); 106: 761–771.