Tranzitinės transfekcijos efektyvumo optimizavimas HEK ląstelių linijose
HEK ląstelių linijų pereinamoji transfekcija tebėra vienas plačiausiai naudojamų molekulinės biologijos metodų, leidžiantis greitai išreikšti baltymus, atlikti genų funkcijos tyrimus ir gaminti virusinius vektorius be stabilios genomo integracijos. Norint pasiekti nuolatinį aukštą transfekcijos efektyvumą, reikia kruopščiai optimizuoti daugybę parametrų, pradedant ląstelių tankiu ir pasažų skaičiumi, baigiant reagentų parinkimu ir DNR kokybe. "Cytion" tiekia autentiškas HEK293 ląsteles ir specializuotus variantus, įskaitant HEK293T ląsteles, kurios mokslininkams suteikia patikimą pradinę medžiagą optimaliems transfekcijos rezultatams pasiekti įvairiose eksperimentinėse srityse.
| Pagrindinės išvados | |
|---|---|
| Ląstelių sveikata ir tankis | Norint maksimaliai padidinti DNR įsisavinimą ir ekspresiją, labai svarbu išlaikyti 70-80 % ląstelių susiliejimo lygį, jų gyvybingumą ir mažą išėjimo skaičių |
| Reagentų parinkimas | Lipidų pagrindo reagentų, kalcio fosfato ir polietilenimino (PEI) pasirinkimas priklauso nuo ląstelių varianto, apimties ir tolesnio naudojimo |
| DNR kokybė ir paruošimas | Plazmidžių preparatai be endotoksinų ir optimalus DNR ir reagentų santykis turi didelę įtaką transfekcijos sėkmės rodikliams |
| Medžiagos ir serumas | Serumo nebuvimo sąlygos transfekcijos komplekso formavimo metu ir atkūrimo terpės sudėtis turi įtakos įsisavinimo efektyvumui ir ląstelių išgyvenamumui |
| Ląstelių linijų variantų parinkimas | Tinkamo HEK293 varianto (tėvinės, 293T, 293F, 293A) parinkimas, atsižvelgiant į eksperimentinius tikslus, turi didelę įtaką rezultatams |
Ląstelių sveikata ir tankis siekiant didžiausios transfekcijos sėkmės
HEK ląstelių fiziologinė būklė transfekcijos metu iš esmės lemia DNR įsisavinimo ir vėlesnės transgeno raiškos efektyvumą. Optimalūs rezultatai paprastai pasiekiami, kai HEK293 ląstelės pasiekia 70-80 % susiliejimo lygį, todėl ląstelių skaičius yra pakankamas, kad būtų galima gauti reikšmingą baltymų kiekį, ir kartu išlaikomas pakankamas atstumas, kad transfekcijos kompleksai galėtų pasiekti atskiras ląsteles be konkurencijos. Kultūroms, kurios artėja prie visiško susiliejimo, pasireiškia kontakto slopinimas ir medžiagų apykaitos sulėtėjimas, dėl kurio labai sumažėja jų gebėjimas internalizuoti egzogeninę DNR, o pernelyg retos populiacijos eikvoja brangius reagentus ir nesuteikia pakankamai medžiagos tolesnei analizei. Ląstelių gyvybingumas prieš transfekciją turėtų viršyti 95 %, nes mirštančios arba stresą patiriančios ląstelės išskiria proteazes ir nukleazes, kurios ardo transfekcijos kompleksus prieš įsisavinant ląstelėms. Dar vienas svarbus kintamasis - HEK293T ląstelių skaičius, kuris paprastai būna optimalus tarp 5 ir 25 eigų, o vėliau genetinis dreifas ir susikaupusios mutacijos palaipsniui mažina transfekcijos kompetenciją. Išsamios perėjimų registracijos ir šviežių kultūrų kūrimas iš autentiškų atsargų, pavyzdžiui, HEK293T/17 ląstelių, užtikrina eksperimentų atkuriamumą per ilgesnes mokslinių tyrimų kampanijas. Taip pat reikėtų atsižvelgti į ląstelių sėjimo laiką, palyginti su transfekcija, nes daugumoje protokolų rekomenduojama po tripsinizavimo atsigauti 18-24 valandas, kad ląstelės galėtų atkurti sukibimą, tinkamai pasiskirstyti ir vėl pradėti aktyvų ląstelių ciklą prieš susiduriant su transfekcijos reagentais. Tyrėjai, dirbantys su HEK293 suspensijai pritaikytais variantais, turėtų siekti, kad ląstelių tankis būtų 1-2 × 10⁶ ląstelių mililitre, o gyvybingumas viršytų 98 %, kad transfekcija būtų panaši į transfekciją suspensijos kultūrų formatais.
Reagentų parinkimas optimaliam transfekcijos efektyvumui užtikrinti
Pasirenkant tinkamą transfekcijos reagentą reikia suderinti efektyvumą, kainą, mastelio keitimą ir suderinamumą su konkrečiais HEK ląstelių variantais bei tolesnėmis programomis. Lipidų pagrindo reagentai, tokie kaip "Lipofectamine", tebėra auksinis standartas nedidelės apimties HEK293 ląstelių transfekcijai, sudarantys liposominius kompleksus, kurie susilieja su ląstelių membranomis ir perduoda DNR krovinį su minimaliu citotoksiškumu, o efektyvumas paprastai viršija 90 %. Tačiau dėl didelės vieno mikrogramo DNR transfekcijos kainos lipidų pagrindu taikomi metodai yra ekonomiškai nenaudingi didelio masto virusinių vektorių gamybos ar baltymų gamybos kampanijoms. Kalcio fosfato nusodinimas yra ekonomiškai efektyvi alternatyva, kuri sėkmingai taikoma jau dešimtmečius, ypač HEK293T ląstelėms, kuriose šis metodas užtikrina puikų lentivirusų ir retrovirusinių vektorių gamybos efektyvumą, o jo kaina yra mažesnė už komercinių reagentų kainą. Šis metodas reikalauja tikslios pH kontrolės ir buferinio tirpalo paruošimo, tačiau jį reikia kruopščiai optimizuoti, o rezultatai atkuriami beveik neribotais mastais. Polietileniminas (PEI) tapo pageidaujamu reagentu pramoniniu mastu atliekant HEK293 suspensijos adaptuotų ląstelių transfekciją, pasižyminčiu išskirtiniu efektyvumo, sąnaudų ir pritaikomumo santykiu, kuris padeda bioreaktoriuose gaminti terapinius baltymus ir virusinius vektorius. Linijinis PEI, kurio molekulinė masė yra 25-40 kDa, optimaliai kompleksuojasi su plazmidžių DNR, kartu sumažindamas citotoksiškumą, susijusį su didesnės molekulinės masės ar šakotais variantais. Specializuotoms reikmėms, kai reikia gaminti adenovirusinius vektorius, AAV-293 ląstelės ypač gerai reaguoja į PEI tarpininkaujamą transfekciją, užtikrinančią didelį vektorių kiekį, būtiną genų terapijos gamybai. Nepriklausomai nuo pasirinkto reagento, DNR ir reagento santykio nustatymas atliekant sistemingus titravimo eksperimentus, būdingus kiekvienai ląstelių linijai ir plazmidžių deriniui, užtikrina didžiausią efektyvumą, kartu išsaugant ląstelių sveikatą, kad būtų užtikrinta optimali baltymų raiška.
DNR kokybė ir paruošimas patikimiems transfekcijos rezultatams pasiekti
Transfekcijai naudojamos plazmidinės DNR kokybė daro didelę įtaką ir įsisavinimo efektyvumui, ir tolesniam raiškos lygiui, tačiau planuojant eksperimentus šiam svarbiam parametrui dažnai skiriama nepakankamai dėmesio. Dažniausia nepaaiškinamų transfekcijos nesėkmių priežastis yra užterštumas endotoksinais, nes lipopolisacharidai, kartu išgryninti su plazmidine DNR, HEK293 ląstelėse sukelia uždegimines reakcijas, kurios mažina gyvybingumą ir nukreipia ląstelių mechanizmus nuo transgeno raiškos. Komerciniai endotoksinų neturintys gryninimo rinkiniai patikimai leidžia pasiekti mažesnį nei 0,1 ES vienam mikrogramui DNR kiekį, t. y. ribą, kuri paprastai laikoma saugia jautrioms žinduolių ląstelėms. Plazmidės topologija taip pat turi didelę įtaką transfekcijos efektyvumui, o supersuktieji preparatai dėl savo kompaktiškos struktūros, palengvinančios kompleksų susidarymą ir ląstelių įsisavinimą, nuolat pranoksta atsipalaidavusias žiedines ar linijines formas. Spektrofotometrinė analizė turėtų patvirtinti, kad A260/A280 santykis yra nuo 1,8 iki 2,0, o A260/A230 santykis viršija 2,0, o tai rodo, kad baltymų ir organinių tirpiklių užterštumas yra minimalus. Daugelio plazmidų transfekcijos atveju, kai virusų vektorių gamybai dažniausiai naudojamos HEK293T ląstelės, išlaikant lygiavertį santykį tarp perkėlimo, pakavimo ir apvalkalo konstruktų, optimizuojamas funkcinis titras ir kartu išvengiama konkurencijos dėl ląstelių raiškos mechanizmų. DNR ir reagentų santykį reikia empiriškai optimizuoti kiekvienam plazmidės ir ląstelės deriniui, o įprasti pradiniai svorio santykiai yra 1:2 - 1:3, kai naudojami PEI pagrindu sukurti protokolai, ir gamintojo rekomenduojami santykiai, kai naudojami komerciniai lipidų reagentai. Plazmidės dydis turi įtakos optimaliems santykiams, nes didesnėms konstrukcijoms, pavyzdžiui, toms, kurios koduoja pilno ilgio Cas9 kartu su kreipiančiosios RNR kasetėmis, naudinga šiek tiek didesnė reagento koncentracija, kad būtų užtikrintas visiškas kompleksavimas. Transfektuojant HEK293 suspensijos adaptuotas ląsteles apibrėžtoje terpėje be serumo, DNR kompleksų formavimasis be serumo baltymų vyksta efektyviau, todėl dažnai galima sumažinti reagentų kiekį, palyginti su serumo turinčiais protokolais, išlaikant tokį patį arba didesnį transfekcijos greitį.
Medžiagos ir serumai, skirti geresniam transfekcijos efektyvumui užtikrinti
Kultūros terpės sudėtis prieš transfekciją, jos metu ir po jos turi didelę įtaką DNR komplekso įsisavinimo efektyvumui ir vėlesniam ląstelių išlikimui transgeno raiškos metu. Kad rezultatai būtų optimalūs, transfekcijos komplekso formavimosi metu būtina užtikrinti sąlygas be serumo, nes serumo baltymai lengvai prisijungia prie katijoninių lipidų ir polimerų, neutralizuodami jų krūvį ir neleisdami efektyviai kondensuotis DNR. Ruošiant PEI arba lipidų pagrindu sukurtus kompleksus HEK293 ląstelėms, skiedžiant DNR ir reagentą DMEM arba "Opti-MEM" be serumo, užtikrinamas nekliudomas komplekso sudarymas ir išlaikomas pastovus dalelių dydžio pasiskirstymas, kuris palengvina ląstelių internalizaciją. Inkubacijos trukmė, per kurią susidaro kompleksas, paprastai svyruoja nuo 15 iki 30 minučių kambario temperatūroje, o ilgesnė inkubacijos trukmė lemia agregatų susidarymą, kuris mažina transfekcijos efektyvumą ir didina citotoksiškumą. Daugelyje protokolų rekomenduojama po komplekso pridėjimo į ląsteles 4-6 valandas inkubuoti terpėje su sumažintu serumo kiekiu arba terpėje be serumo, o po to ją pakeisti visaverte augimo terpe, kurioje yra 10 % fetalinio galvijų serumo, kad ląstelės atsigautų ir būtų palaikoma baltymų raiška. HEK293 suspensijos adaptuotoms ląstelėms, auginamoms chemiškai apibrėžtose sistemose be serumo, šis svarstymas tampa paprastesnis, nes šie variantai gerai vystosi be serumo papildymo per visą transfekcijos ir ekspresijos laiką. Taip pat reikėtų atkreipti dėmesį į bazinės terpės pasirinkimą: Ham's F12K terpė ir DMEM:Ham's F12 mišiniai pasižymi didesne buferine talpa ir maistinių medžiagų profiliais, kurie palaiko aukšto lygio rekombinantinių baltymų gamybos metabolinius poreikius. Atliekant transfekcijos procedūras reikėtų atsisakyti antibiotikų, nes dėl transfekcijos reagentų sukeltos membranų permeabilizacijos į ląsteles gali patekti toksiškos koncentracijos antibiotikų, o tai gali pakenkti gyvybingumui ir apsunkinti eksperimentų interpretaciją.
Ląstelių linijų variantų atranka siekiant tikslinių eksperimentinių rezultatų
HEK293 šeima apima daugybę išvestinių ląstelių linijų, kurių kiekviena sukurta arba atrinkta pagal tam tikras savybes, suteikiančias išskirtinių pranašumų konkrečioms transfekcijos programoms. Pirminės HEK293 ląstelės ir toliau plačiai naudojamos bendrosios paskirties transfekcijos eksperimentams, nes jos patikimai veikia įvairiuose protokoluose be papildomų genetinių modifikacijų, kurios taikomos išvestinėse linijose. HEK293T ląstelių variante ekspresuojamas didelis SV40 T antigenas, todėl galima epizominė plazmidžių, turinčių SV40 pradžią, replikacija ir žymiai padidėja pereinamojo laikotarpio ekspresijos lygiai, kai reikia maksimalios baltymų išeigos arba viruso titro. Dėl šios savybės HEK293T ląstelės yra tinkamiausias pasirinkimas gaminant lentiviirusus, retrovirusus ir adenoasocijuotus virusus, kai produkcijos kiekis tiesiogiai veikia tolesnių eksperimentų sėkmę. HEK293T/17 Cells subklonas pasižymi didesniu nuoseklumu, palyginti su tėvinėmis 293T populiacijomis, nes buvo atrinktas dėl geresnės transfekcijos kompetencijos ir stabilių augimo savybių, kurios yra būtinos atkuriamoms virusų gamybos darbo eigoms. Mokslininkams, kuriems reikia adenovirusinių vektorių sistemų, HEK293A ląstelės pasižymi plokščia morfologija ir geresnėmis lipnumo savybėmis, kurios palengvina plokštelių tyrimus ir daugybės duobučių konfigūracijose atliekamą atranką. HEK293 suspensijai pritaikytas variantas atitinka mastelio reikalavimus, todėl jį galima auginti kratomosiose kolbose ir maišomuosiuose bioreaktoriuose, kad būtų galima pramoniniu mastu gaminti terapinius baltymus ir virusinius vektorius. Taip pat HEK293-F ląstelės specialiai pritaikytos didelio tankio be serumo suspensijos kultūroms, todėl galima pateikti teisės aktų reikalavimus atitinkančius kilmės dokumentus, kurie palengvina gamybos procesų kūrimą klinikinėms reikmėms. Laboratorijoms, užsiimančioms specializuota baltymų raiška, gali būti naudingos HEK293 EBNA ląstelės, kurios stabiliai ekspresuoja Epšteino-Barro viruso branduolinį antigeną 1, kad palaikytų epizominį oriP turinčių raiškos vektorių palaikymą ir užtikrintų ilgalaikę aukšto lygio raišką per ilgesnį auginimo laikotarpį be genominės integracijos.