Žmogaus pirminės ląstelės

Kas yra pirminės žmogaus ląstelės?

Pirminės ląstelės yra gryniausia atitinkamų audinių atmaina. Jos išskiriamos iš audinio ir apdorojamos taip, kad galėtų įsitvirtinti idealiomis sąlygomis auginamoje kultūroje. Jos labiau atkartoja in vivo būseną ir pasižymi normalia fiziologija, nes yra gautos iš audinio, o ne modifikuotos. Dėl šios priežasties jie gali būti naudingi kaip modeliai ląstelių farmakologijos, toksikologijos ir fiziologijos tyrimams (įskaitant medžiagų apykaitos, senėjimo ir signalų perdavimo tyrimus). Atminkite, kad pirmines ląsteles auginti ir prižiūrėti yra sudėtingiau nei nuolatines ląstelių linijas, nes jų gyvavimo trukmė trumpesnė ir po tam tikro ląstelių dalijimųsi skaičiaus jos nustoja dalytis (arba pasensta). Ląstelių signalinių kelių tyrimus apsunkina pirminių ląstelių, gautų iš donorų ir taikant subkultūrų metodus, kintamumas. Prieš pradėdami signalų tyrimus, tyrėjai dažnai atlieka atranką, kad nustatytų, ar ląstelės reaguoja į dažniausiai naudojamus dirgiklius. Siekiant išvengti laiko ir pinigų švaistymo, pirminės ląstelės gali būti stimuliuojamos taip, kad aktyvuotų pagrindinius signalinius kelius prieš atliekant atranką.

Kodėl verta naudoti žmogaus pirmines ląsteles?

Ląstelių tyrimams dažniausiai naudojamos nemortizuotos ląstelių linijos. Nors mokslininkai pripažino, kad biologiniai pokyčiai dėl ląstelių linijų gali būti žalingi tiriant jų fiziologinę reikšmę. Naudojant žmogaus pirmines ląsteles pagerėja ląstelių kultūromis gautų duomenų fiziologinė vertė, todėl jos vis dažniau laikomos svarbiomis tiriant biologinius procesus, ligų eigą ir vaistų kūrimą.

Žmogaus pirminės ląstelės plačiai naudojamos in vitro atliekant tarpląstelinės ir viduląstelinės komunikacijos, vystymosi biologijos, vėžio, Parkinsono ligos, diabeto ir daugelio kitų ikiklinikinių ir tiriamųjų biologinių tyrimų sričių in vitro tyrimus. Mokslininkai jau seniai naudoja nemortizuotų ląstelių linijas audinių funkcijoms tirti; tačiau ląstelių linijos su akivaizdžiomis mutacijomis ir chromosomų anomalijomis gali būti netinkami normalių ląstelių pakaitalai ir ligos vystymosi ankstyvosiose stadijose. Tikslesnį konkretaus audinio ląstelių tipo modelį dabar galima sukurti naudojant pirmines žmogaus ląsteles, išskirtas iš to audinio ir palaikomas pirminėse ląstelių kultūrų terpėse bei papilduose.

Kas yra pirminė ląstelių kultūra?

Vietoj nemortizuotų ląstelių linijų naudojimo, pirminės ląstelių kultūros apima ląstelių auginimą tiesiogiai iš daugialąsčio organizmo už kūno ribų. Kai kuriose šalyse, pavyzdžiui, Jungtinėje Karalystėje, teisiškai pripažįstama, kad pirminės ląstelių kultūros labiau atspindi in vivo audinius nei ląstelių linijos. Nepaisant to, pirminėms ląstelėms augti reikia tinkamo substrato ir maistinių medžiagų, o po tam tikro skaičiaus dalijimųsi joms išsivysto senatvinis fenotipas, dėl kurio jos visam laikui nustoja dalytis. Šie du veiksniai skatina kurti ląstelių linijas. Tiek natūraliai imortalizuotos pirminės ląstelės (pvz., HeLa ląstelės), tiek dirbtinai imortalizuotos pirminės ląstelės (pvz., HEK ląstelės) gali būti neribotą laiką auginamos ląstelių kultūroje.

Žmogaus pirminės ląstelės pagal audinių tipus

Epitelinės ląstelės, fibroblastai, keratinocitai, melanocitai, endotelio ląstelės, raumenų ląstelės, imuninės ląstelės ir kamieninės ląstelės, pavyzdžiui, mezenchiminės kamieninės ląstelės, yra vienos iš dažniausiai moksliniuose tyrimuose naudojamų žmogaus pirminių ląstelių. Pirmiausia šios kultūros yra heterogeninės (atspindi audinyje esančių ląstelių tipų mišinį) ir jas galima išlaikyti gyvas in vitro tik tam tikrą laiką. Transformacija yra in vitro procesas, leidžiantis manipuliuoti žmogaus pirminėmis ląstelėmis neribotam subkultūrų skaičiui. Transformacija gali vykti natūraliai arba gali būti sukelta cheminėmis medžiagomis ar virusais. Po genetinės transformacijos pirminė kultūra gali dalytis neribotą laiką į nemoralizuotą antrinę ląstelių liniją, jei jai suteikiama pakankamai maistinių medžiagų ir vietos.

Endotelio ląstelės

Vėžio gydymas, žaizdų gijimas, ląstelių signalų tyrimai, didelio našumo ir didelio turinio atrankiniai tyrimai ir toksikologiniai tyrimai - tai tik kelios sritys, kuriose pirminės endotelio ląstelės gali būti naudingos kaip mokslinių tyrimų priemonė.

Keratinocitai

Keratinocitai, gaunami iš suaugusio žmogaus odos epidermio arba naujagimio apyvarpės, atlieka svarbų vaidmenį tiriant tokias odos ligas kaip psoriazė ir vėžys.

Epitelinės ląstelės

Pirminės epitelio ląstelės pasirodė esančios neįkainojamas šaltinis modeliuojant natūralią organizmo apsaugą - nuo vėžio tyrimų iki toksikologinių tyrimų.

Fibroblastai

Pliuripotentinių kamieninių ląstelių (iPS) indukcija ir žaizdų gijimo tyrimai - tai tik keletas iš daugelio pirminių fibroblastų panaudojimo būdų.

Imuninės ląstelės

Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės, sutrumpintai PBMC, yra vienbranduolės kraujo ląstelės su apvaliu ląstelės branduoliu. Joms daugiausia priklauso limfocitai ir monocitai, kurie imuninio atsako metu atlieka svarbias funkcijas. Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės dažnai naudojamos infekcijoms diagnozuoti arba galimai apsaugai nuo skiepų nustatyti. Įžvalgos apie ląstelinį imuninį atsaką, kuriam tarpininkauja T ląstelės, dažnai yra labai svarbios.

Melanocitai

Melanocitai, specializuotos odos ląstelės, gaminančios pigmentą melaniną, yra naudingi kaip modeliai atliekant tyrimus tokiomis temomis kaip žaizdų gijimas, toksiškumas, melanoma, odos reakcija į ultravioletinę (UV) spinduliuotę, odos ligos ir kosmetika.

Kamieninės ląstelės

Kamieninės ląstelės gali diferencijuotis į įvairius ląstelių tipus. Dėl gebėjimo diferencijuotis jos suteikia naujų galimybių modeliuoti žmogaus audinius ir sveikatos būklę.

Mezenchiminės kamieninės ląstelės

Mezenchiminės kamieninės ląstelės, dar vadinamos MSC, gali būti gaunamos iš įvairių žmogaus šaltinių, pavyzdžiui, kaulų čiulpų, riebalų (riebalinio audinio), bambagyslės audinio (Whartono želė) ir amniono skysčio (skysčio, supančio vaisių), ir gali būti plečiamos in vitro. Šios suaugusiųjų stromos kamieninės ląstelės gali virsti įvairiausių tipų ląstelėmis. Kai kurie iš šių ląstelių tipų yra kaulų, kremzlių, raumenų, nervų, odos ir ragenos ląstelės.

Lygiųjų raumenų ląstelės

Tuščiaviduriuose organuose pirminės lygiųjų raumenų ląstelės (SMC) iškloja vidų ir tarpininkauja susitraukimui. Be vėžio ir kitų ligų, SMC gali būti naudojamos hipertenzinei fibrozei modeliuoti.

Pirminės ląstelės ir ląstelių linijos

Arba dėl savaiminės mutacijos, kaip transformuotose vėžio ląstelių linijose, arba dėl tyčinio pakeitimo, kaip dirbtinai gaminant vėžio genus, nuolatinės ląstelių linijos įgijo galimybę daugintis be galo (imortalizuotos). Paprastai nuolatinės ląstelių linijos yra patikimesnės ir patogesnės nei pirminės ląstelės. Jos gali neribotai plėstis ir suteikia greitą prieigą prie esminių duomenų. Nenutrūkstamų ląstelių linijų naudojimas turi tam tikrų apribojimų, įskaitant tai, kad jos yra genetiškai modifikuotos ir (arba) transformuotos, todėl gali pasikeisti fiziologinės savybės ir neatitikti in vivo būklės, be to, laikui bėgant tai gali dar labiau pasikeisti dėl didelio pasažavimo.

Pirminių ląstelių kultūrų pažanga

Pirminės ląstelės turi blogą reputaciją dėl to, kad su jomis sunku dirbti. Tačiau šis procesas tampa lengvesnis nei bet kada anksčiau dėl pirminių ląstelių kultūrų plėtros, komercinių pirminių ląstelių su visiškai optimizuotais protokolais prieinamumo ir naujų analizės metodų, kuriems reikia mažiau sąnaudų.

Perėjimas nuo dvimatės prie trimatės ląstelių kultūros laikomas svarbiu etapu šioje srityje. Dvimatėje kultūroje gali būti susilpninta audinių specifinė architektūra, ląstelių sąveika ir mechaniniai / biocheminiai signalai. Taigi šių kultūrų biologinė vertė yra ribota.

Kita vertus, 3D ląstelių kultūros leidžia ląstelėms plėstis ir sąveikauti su 3D ekstraląsteline struktūra. Tai leidžia ląstelėms sąveikauti tarpusavyje ir su ekstraląsteliniu matriksu, todėl 3D kultūros yra fiziologiškai tinkamesnės. Dėl šio metodo tikslumo prognozuojant in vivo reakcijas jis tapo revoliuciniu tokiose srityse kaip vaistų atradimas ir kūrimas. Dėl šios priežasties naujausios technologijos, tokios kaip iš pacientų gauti organoidai ir organai ant lusto, yra labai kontekstualūs modeliai vaistų atrankai ir kūrimui.

Pirminių ląstelių generavimas yra siauras pirminių kultūrų taškas. Norint tai įveikti, paprastai reikia didesnio audinio tūrio, o tai pasiekti gali būti sudėtinga. Tačiau geresnis analitinis jautrumas suteikia galimybę siekti pažangos. Pavyzdžiui, poreikis auginti didelį kiekį pirminių ląstelių sumažėja naudojant vienos ląstelės technologiją, kuri apima sekos nustatymą, Western blotting ir masinę citometriją.

Daug žadančios pirminių ląstelių kultūrų perspektyvos

Bendrus pirminių ląstelių auginimo sunkumus mažina technologinė pažanga. Savo ruožtu šis metodas sparčiai keičia kitus kaip auksinis standartas ląstelių ir molekulinės biologijos tyrimuose ir praktikoje. Vakcinų gamyba, organų keitimas, kamieninių ląstelių terapija, vėžio tyrimai ir dar daug kitų sričių gali gauti daug naudos iš nuolatinės pirminių ląstelių kultūrų pažangos.

Pirminės ląstelių kultūros patarimai ir gudrybės

Ląstelių plėtros poreikiai

Du labiausiai paplitę pirminių ląstelių auginimo būdai yra auginimas suspensijoje arba ant paviršiaus (2D). Kai kurios ląstelės gali laisvai plūduriuoti kraujotakoje ir niekada neprisitvirtinti prie paviršiaus (pavyzdžiui, ląstelės, gautos iš periferinio kraujo). Įvairios ląstelių linijos buvo sukurtos taip, kad galėtų gerai augti suspensijos kultūrose, kur jos gali pasiekti tankį, nepasiekiamą 2D auginimo sąlygomis. Pirminės ląstelės, kurioms, norint augti in vitro, reikia įtvirtinimo, vadinamos adherentinėmis ląstelėmis ir apima ląsteles, esančias kietuosiuose audiniuose. Siekiant pagerinti sukibimo savybes ir tiekti kitus augimui ir diferenciacijai reikalingus signalus, šios ląstelės paprastai auginamos plokščiame nepadengtame plastikiniame inde, bet kartais ir mikronosėjuose. Pastarasis variantas gali būti padengtas ekstraląstelinio matrikso baltymais (pvz., kolagenu ir lamininu). Ląstelių kultūrai naudojamą terpę sudaro pagrindinė terpė, papildyta tinkamais augimo veiksniais ir citokinais. Ląstelių inkubatorius - tai specialus laboratorinis inkubatorius, naudojamas ląstelėms auginti ir išlaikyti tam tikroje temperatūroje ir dujų mišinyje (paprastai 37 °C, 5 % CO2 žinduolių ląstelėms). Priklausomai nuo kultivuojamų ląstelių tipo, optimalios sąlygos gali būti labai skirtingos. Priklausomai nuo auginamų ląstelių tipų, optimali augimo terpė turės unikalų veiksnių derinį, įskaitant, bet neapsiribojant, pH, gliukozės koncentraciją, augimo veiksnius ir kitas maistines medžiagas.

Antibiotikai augimo terpėje yra labai svarbūs kuriant pirminę kultūrą, kad būtų išvengta užteršimo iš šeimininko audinio. Kai kurie antibiotikų režimai apima gentamicino, penicilino, streptomicino ir amfotericino B derinį. Tačiau nerekomenduojama antibiotikų naudoti ilgą laiką, nes kai kurie reagentai (pvz., amfotericinas B) ilgainiui gali būti toksiški ląstelėms.

Dauguma pirminių ląstelių sensta ir nustoja dalytis po tam tikro populiacijos padvigubėjimų skaičiaus, todėl labai svarbu jas išlaikyti gyvas po izoliavimo. Ilgalaikiam ląstelių gyvybingumui užtikrinti reikalingi kompetentingi ląstelių auginimo metodai ir idealios auginimo sąlygos (įskaitant tinkamą terpę, tinkamą temperatūrą, tinkamą dujų mišinį, tinkamą pH, tinkamą augimo veiksnių koncentraciją, maistines medžiagas ir gliukozę). Kadangi daugelis terpėms papildyti naudojamų augimo veiksnių yra gaunami iš gyvūnų kraujo (iš kraujo gaunamos sudedamosios dalys gali būti užterštos), rekomenduojama jų naudojimą sumažinti iki minimumo arba visiškai vengti. Taip pat svarbu naudoti aseptinę techniką.

Subkultūros ir priežiūra

Kai izoliuotos ląstelės prilimpa prie kultūros lėkštelės paviršiaus, prasideda palaikymo etapas. Prisitvirtinimas paprastai įvyksta praėjus 24 valandoms nuo kultūros pradžios. Ląstelės turėtų būti subkultūruojamos, kai pasiekia tam tikrą konfliuencinį procentą ir aktyviai replikuojasi. Kadangi po konfluencijos ląstelės gali diferencijuotis ir lėčiau daugintis, geriausia subkultūruoti pirmines ląstelių kultūras, kol jos nepasiekė 100 % konfluencijos.

Subkultūrinimas šviežioje terpėje palaiko nuo inkaravimo priklausomų ląstelių eksponentinį augimą. Subkultūrinant monosluoksnius, sutrinka tarpląstelinė ir viduląstelinė ląstelių paviršiaus sąveika. Iš monosluoksnių ar audinių išgaunant prigludusias pirmines ląsteles naudojamos mažos koncentracijos proteolitiniai fermentai, pavyzdžiui, tripsinas ir EDTA. Disocijuotos ir atskiestos į vienos ląstelės tirpalą, ląstelės suskaičiuojamos ir perkeliamos į šviežias kultūrų talpyklas, kad vėl prisitvirtintų ir daugintųsi.

Kriokonservavimas ir atkūrimas

Kriokonservavimas išsaugo gyvas ląsteles jas užšaldant žemoje temperatūroje. Kriokonservuojant ir atšildant žmogaus pirmines ląsteles, išvengiama ląstelių žūties ir pažeidimų jas laikant ir naudojant. Pirminės žmogaus ląstelės krioprotezuojamos naudojant DMSO arba glicerolį (esant tinkamai temperatūrai ir kontroliuojamam užšaldymo greičiui). Šaldymo procesas turi būti laipsniškas, po -1 °C kas minutę, kad nesusidarytų ledo kristalų. Ilgalaikiam saugojimui reikalingas skystas azotas (-196 °C) arba žemesnė nei -130 °C temperatūra.

Kriokonservuotoms ląstelėms atšildyti užtenka 1-2 minutes panardinti į 37 °C temperatūros vandens vonelę. Atšildytų iš šaldiklio žmogaus pirminių ląstelių nereikėtų centrifuguoti (nes jos yra labai jautrios pažeidimams atsigavimo po kriokonservavimo metu). Jis tinka ląstelėms dėti iš karto po atšildymo, o per pirmąsias 24 valandas po dėjimo skatina kultūrų prisitvirtinimą. 1 Prisitvirtinus kriokonservuotoms pirminėms ląstelėms, reikia pašalinti panaudotą terpę (nes DMSO yra kenksmingas pirminėms ląstelėms ir dėl jo gali sumažėti gyvybingumas po atšildymo).