Žmogaus pirminės ląstelės

Kas yra žmogaus pirminės ląstelės?

Pirminės ląstelės yra gryniausias atitinkamų audinių atspindys. Jos izoliuojamos iš audinio ir apdorojamos taip, kad galėtų įsitvirtinti kultūroje, kurioje vyrauja idealios sąlygos. Jos labiau atkuria in vivo būklę ir pasižymi normaliu fiziologiniu elgesiu, nes yra gautos iš audinio, o ne modifikuotos. Dėl to jos gali būti naudingi modeliai ląstelių farmakologijos, toksikologijos ir fiziologijos tyrimams (įskaitant metabolizmo, senėjimo ir signalų perdavimo tyrimus). Reikia nepamiršti, kad pirmines ląsteles auginti ir išlaikyti yra sudėtingiau nei nuolatinę ląstelių liniją, nes jų gyvenimo trukmė yra trumpesnė ir po tam tikro skaičiaus ląstelių dalijimųsi jos nustoja dalytis (arba sensta). Ląstelių signalizacijos kelių tyrimai yra sudėtingi dėl pirminių ląstelių, gautų iš donorų ir per subkultūravimo procesus, būdingo kintamumo. Prieš pradėdami signalizacijos tyrimus, mokslininkai dažnai atlieka atranką, siekdami nustatyti, ar ląstelės reaguoja į įprastai naudojamus dirgiklius. Siekiant išvengti laiko ir pinigų švaistymo, pirminės ląstelės prieš atranką gali būti stimuliuojamos, kad būtų aktyvuoti pagrindiniai signalizacijos keliai.

Kodėl verta naudoti žmogaus pirmines ląsteles?

Nemirtingos ląstelių linijos dažniausiai naudojamos ląstelių tyrimams. Nors mokslininkai pripažįsta, kad dėl ląstelių linijų atsirandantys biologiniai pokyčiai gali būti žalingi tiriant jų fiziologinę reikšmę, žmogaus pirminių ląstelių naudojimas padidina ląstelių kultūrose gautų duomenų fiziologinę vertę, ir jos vis dažniau laikomos svarbiomis tiriant biologinius procesus, ligų eigą ir kuriant vaistus.

Žmogaus pirminės ląstelės plačiai naudojamos in vitro tyrimuose, susijusiuose su tarpląsteliniais ir intraląsteliniais ryšiais, vystymosi biologija bei mechanizmais, lemiančiais vėžį, Parkinsono ligą ir diabetą, taip pat daugelyje kitų ikiklinikinių ir tiriamųjų biologinių mokslinių tyrimų sričių. Mokslininkai jau seniai naudoja nemirtingas ląstelių linijas audinių funkcijoms tirti; tačiau ląstelių linijos su akivaizdžiomis mutacijomis ir chromosomų anomalijomis gali būti netinkami normalių ląstelių ir ligos ankstyvųjų stadijų pakaitalai. Dabar galima sukurti tikslesnį konkretaus audinio ląstelių tipo modelį, naudojant žmogaus pirmines ląsteles, izoliuotas iš to audinio ir auginamas pirminių ląstelių kultūros terpėse bei prieduose.

Kas yra pirminių ląstelių kultūra?

Vietoj nemirtingų ląstelių linijų pirminėje ląstelių kultūroje ląstelės auginamos tiesiogiai iš daugialąsčio organizmo už kūno ribų. Kai kuriose šalyse, pavyzdžiui, Jungtinėje Karalystėje, teisiškai pripažįstama, kad pirminės ląstelių kultūros geriau atspindi in vivo audinius nei ląstelių linijos. Vis dėlto pirminėms ląstelėms augti reikalingas tinkamas substratas ir maistinės medžiagos, o po tam tikro skaičiaus dalijimųsi jos įgyja senėjimo fenotipą, dėl kurio jos visam laikui nustoja dalytis. Šie du veiksniai skatina kurti ląstelių linijas. Tiek natūraliai nemirtingos pirminės ląstelės (pvz., HeLa ląstelės), tiek dirbtinai nemirtingos pirminės ląstelės (pvz., HEK ląstelės) gali būti auginamos ląstelių kultūroje neribotą laiką.

Žmogaus pirminės ląstelės pagal audinių tipus

Epitelio ląstelės, fibroblastai, keratinocitai, melanocitai, endotelio ląstelės, raumenų ląstelės, imuninės ląstelės ir kamieninės ląstelės, pvz., mezenchiminės kamieninės ląstelės, yra vienos iš dažniausiai moksliniuose tyrimuose naudojamų žmogaus pirminių ląstelių. Pirmiausia, kultūros yra heterogeninės (atspindi audinyje esančių ląstelių tipų mišinį) ir jas galima išlaikyti gyvas in vitro tik tam tikrą laiką. Transformacija yra in vitro procesas, leidžiantis manipuliuoti žmogaus pirminėmis ląstelėmis, kad būtų galima gauti neribotą skaičių subkultūrų. Transformacija gali vykti natūraliai arba ją gali sukelti cheminės medžiagos ar virusai. Po genetinės transformacijos pirminė kultūra, jei jai suteikiama pakankamai maistinių medžiagų ir erdvės, gali dalytis neribotą skaičių kartų, virsdama nemirtinga antrine ląstelių linija.

Endotelio ląstelės

Vėžio gydymas, žaizdų gijimas, ląstelių signalizacijos tyrimai, didelio našumo ir didelio turinio atranka bei toksikologinė atranka – tai tik keletas sričių, kuriose pirminių endotelio ląstelių naudojimas kaip tyrimo priemonė gali būti naudingas.

Keratinocitai

Keratinocitai, gauti iš suaugusio žmogaus odos epidermio arba naujagimio apyvarpės, atlieka lemiamą vaidmenį odos ligų, tokių kaip psoriazė ir vėžys, tyrimuose.

Epitelio ląstelės

Nuo vėžio tyrimų iki toksikologinių tyrimų – pirminės epitelio ląstelės pasirodė esančios neįkainojamas išteklius, leidžiančias modeliuoti natūralią organizmo apsaugą.

Fibroblastai

Indukuotų pluripotentinių kamieninių (iPS) ląstelių kūrimas ir žaizdų gijimo tyrimai – tai tik keletas iš daugybės pirminių fibroblastų panaudojimo sričių.

Imuninės ląstelės

Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės, trumpai vadinamos PBMC, yra kraujo mononuklearinės ląstelės su apvaliu branduoliu. Jos daugiausia susideda iš limfocitų ir monocitų, kurie atlieka svarbias funkcijas imuninio atsako metu. Periferinio kraujo mononuklearinės ląstelės dažnai naudojamos infekcijoms diagnozuoti arba galimai vakcinacijos apsaugai nustatyti. Įžvalgos apie T ląstelių tarpininkaujamą ląstelinį imuninį atsaką dažnai yra lemiamos.

Melanocitai

Melanocitai – specializuotos odos ląstelės, gaminančios pigmentą melaniną, yra naudingi kaip modeliai tyrimams tokiomis temomis kaip žaizdų gijimas, toksiškumas, melanoma, odos reakcija į ultravioletinę (UV) spinduliuotę, odos ligos ir kosmetika.

Kamieninės ląstelės

Kamieninės ląstelės turi potencialą diferencijuotis į įvairiausių tipų ląsteles. Dėl savo gebėjimo diferencijuotis jos suteikia naujas galimybes modeliuoti žmogaus audinius ir sveikatos būklę.

Mezenchiminės kamieninės ląstelės

Mezenchiminės kamieninės ląstelės, taip pat žinomos kaip MSC, gali būti gaunamos iš įvairių žmogaus šaltinių, pavyzdžiui, kaulų čiulpų, riebalų (riebalinio audinio), virkštelės audinio (Vartono želė) ir amniono skysčio (skysčio, supančio vaisių), ir gali būti dauginamos in vitro. Šios suaugusiųjų stromos kamieninės ląstelės turi gebėjimą išsivystyti į įvairiausių tipų ląsteles. Kai kurie iš šių ląstelių tipų apima kaulų ląsteles, kremzlių ląsteles, raumenų ląsteles, nervines ląsteles, odos ląsteles ir ragenos ląsteles.

Lygiųjų raumenų ląstelės

Tuščiaviduriuose organuose pirminės lygiųjų raumenų ląstelės (SMC) išklijuoja vidų ir užtikrina susitraukiamumą. Be vėžio ir kitų ligų, SMC gali būti naudojamos hipertenzinės fibrozės modeliavimui.

Pirminės ląstelės ir ląstelių linijos

Dėl savaiminės mutacijos, kaip transformuotų vėžio ląstelių linijų atveju, arba dėl tyčinio pakeitimo, kaip dirbtinio vėžio genų sukūrimo atveju, nuolatinės ląstelių linijos įgijo galimybę daugintis be galo (tapo nemirtingos). Paprastai nuolatinės ląstelių linijos yra patikimesnės ir patogesnės naudoti nei pirminės ląstelės. Jos gali daugintis neribotą laiką ir suteikia greitą prieigą prie būtinų duomenų. Nuolatinės ląstelių linijos naudojimas turi tam tikrų apribojimų, įskaitant tai, kad jos yra genetiškai modifikuotos/transformuotos, o tai gali pakeisti fiziologines savybes ir neatitikti in vivo sąlygų, be to, laikui bėgant ir daug kartų perauginant, šios savybės gali dar labiau pasikeisti.

Pažanga pirminių ląstelių kultūroje

Pirminės ląstelės turi blogą reputaciją dėl to, kad su jomis sunku dirbti. Tačiau šis procesas tampa lengvesnis nei bet kada anksčiau dėl pažangos pirminių ląstelių kultūroje, komercinių pirminių ląstelių su visiškai optimizuotais protokolais prieinamumo ir naujų analizės metodų, kuriems reikia mažiau pastangų.

Perėjimas nuo dvimatės prie trimatės ląstelių kultūros laikomas svarbiu šios srities pasiekimu. Dvimatėje kultūroje audiniui būdinga struktūra, ląstelių tarpusavio sąveika bei mechaniniai ir biocheminiai signalai gali būti susilpninti. Todėl šių kultūrų biologinė vertė yra ribota.

Kita vertus, trimatė ląstelių kultūra leidžia ląstelėms daugintis ir sąveikauti su trimačiu ekstraląsteliniu karkasu. Tai leidžia ląstelėms sąveikauti tarpusavyje ir su ekstraląsteliniu matriksu, todėl trimatės kultūros tampa fiziologiškai tinkamesnės. Šio metodo tikslumas prognozuojant in vivo reakcijas padarė jį revoliuciniu tokiose srityse kaip vaistų atradimas ir kūrimas. Dėl to naujausios technologijos, pavyzdžiui, iš pacientų gauti organoidai ir „organai ant mikroschemos“, suteikia labai kontekstualius modelius vaistų atrankai ir kūrimui.

Pirminių ląstelių generavimas yra pirminės kultūros kliūtis. Paprastai norint įveikti šią kliūtį reikia didesnio audinio kiekio, o tai gali būti sudėtinga pasiekti. Tačiau didesnis analitinis jautrumas atveria naujas galimybes. Pavyzdžiui, poreikį kultivuoti didelius pirminių ląstelių kiekius sumažina vienos ląstelės technologijos naudojimas, apimantis sekvenavimą, „Western blotting“ ir masinę citometriją.

Perspektyvios pirminių ląstelių kultūros perspektyvos

Bendras pirminių ląstelių kultūravimo sunkumas mažėja dėl technologinių pažangų. Savo ruožtu šis metodas sparčiai keičia kitus metodus ir tampa aukso standartu ląstelių ir molekulinės biologijos tyrimuose bei praktikoje. Vakcinos gamyba, organų pakeitimas, kamieninių ląstelių terapijos, vėžio tyrimai ir daugelis kitų sričių gali labai pasinaudoti nuolatiniais pirminių ląstelių kultūravimo pasiekimais.

Pirminių ląstelių kultivavimo patarimai ir gudrybės

Ląstelių dauginimo poreikiai

Du dažniausiai naudojami pirminių ląstelių auginimo metodai yra suspensijoje arba ant paviršiaus (2D). Kai kurios ląstelės gali laisvai plūduriuoti kraujotakoje, niekada neprisitvirtindamos prie paviršiaus (pavyzdžiui, iš periferinio kraujo gautos ląstelės). Yra sukurtos įvairios ląstelių linijos, kurios gerai auga suspensijos kultūrose, kur jos gali pasiekti tankį, neįmanomą 2D auginimo sąlygomis. Pirminės ląstelės, kurioms augti in vitro reikia prisitvirtinimo, vadinamos adhezyvinėmis ląstelėmis; prie jų priskiriamos ir kietuosiuose audiniuose esančios ląstelės. Siekiant pagerinti prisitvirtinimo savybes ir suteikti kitus augimui bei diferenciacijai reikalingus signalus, šios ląstelės paprastai auginamos plokščiuose, nepadengtuose plastikinėse talpyklose, tačiau kartais naudojami ir mikronešikliai. Pastarieji gali būti padengti ekstraląstelinių matricos baltymų sluoksniu (pavyzdžiui, kolageno ir laminino). Ląstelių kultūrai naudojama terpė susideda iš bazinės terpės, papildytos atitinkamais augimo faktoriais ir citokiniais. Ląstelių inkubatorius – tai specialus laboratorinis inkubatorius, skirtas ląstelėms auginti ir išlaikyti tam tikroje temperatūroje bei dujų mišinyje (paprastai 37 °C, 5 % CO₂ žinduolių ląstelėms). Priklausomai nuo kultivuojamų ląstelių tipo, optimalios sąlygos gali labai skirtis. Priklausomai nuo auginamų ląstelių tipų, optimali auginimo terpė turės unikalų veiksnių derinį, įskaitant, bet neapsiribojant, pH, gliukozės koncentraciją, augimo veiksnius ir kitų maistinių medžiagų buvimą.

Antibiotikai auginimo terpėje yra labai svarbūs pirminės kultūros sukūrimo metu, siekiant išvengti užteršimo iš šeimininko audinio. Kai kuriuose antibiotikų režimuose naudojamas gentamicino, penicilino, streptomicino ir amfotericino B derinys. Tačiau ilgalaikis antibiotikų vartojimas nerekomenduojamas, nes kai kurie reagentai (pavyzdžiui, amfotericinas B) ilgainiui gali būti toksiški ląstelėms.

Dauguma pirminių ląstelių sensta ir nustoja dalytis po tam tikro populiacijos padvigubėjimų skaičiaus, todėl labai svarbu išlaikyti jas gyvas po izoliavimo. Ilgalaikis ląstelių gyvybingumas reikalauja profesionalių ląstelių kultivavimo metodų ir idealių kultivavimo sąlygų (įskaitant tinkamą terpę, tinkamą temperatūrą, tinkamą dujų mišinį, tinkamą pH, tinkamą augimo veiksnių koncentraciją, maistinių medžiagų buvimą ir gliukozės buvimą). Kadangi daugelis augimo veiksnių, naudojamų terpėms papildyti, gaunami iš gyvūnų kraujo (iš kraujo gauti ingredientai gali būti užteršti), rekomenduojama jų naudojimą sumažinti iki minimumo arba visiškai jų vengti. Taip pat svarbu laikytis aseptikos reikalavimų.

Subkultūra ir palaikymas

Kai izoliuotos ląstelės prisitvirtina prie kultūrinio indelio paviršiaus, tai žymi išlaikymo etapo pradžią. Prisitvirtinimas paprastai įvyksta praėjus 24 valandoms po kultūros pradžios. Ląstelės turėtų būti perkeltos į naują kultūrą, kai pasiekia tam tikrą konfluencijos procentą ir aktyviai dauginasi. Kadangi po konfluencijos pasiekimo ląstelės gali diferencijuotis ir po perkelimo daugintis lėčiau, geriausia pirmines ląstelių kultūras perkelti į naują kultūrą, kol jos dar nepasiekė 100 % konfluencijos.

Pakartotinis kultivavimas šviežioje terpėje užtikrina eksponentinį prisitvirtinimo priklausomų ląstelių augimą. Pakartotinis monosluoksnių kultivavimas sutrikdo tarpląstelines ir intraląstelines sąveikas su ląstelių paviršiumi. Mažos koncentracijos proteolitiniai fermentai, tokie kaip tripsinas/EDTA, naudojami adhezyviosioms pirminėms ląstelėms išskirti iš monosluoksnių ar audinių. Po disociacijos ir praskiedimo į vienaląstelinį tirpalą ląstelės suskaičiuojamos ir perkeltos į šviežius kultūrininkus, kad vėl prisitvirtintų ir daugintųsi.

Krioprezervacija ir atgaivinimas

Krioprezervacija leidžia išsaugoti gyvas ląsteles, jas užšaldant žemoje temperatūroje. Žmogaus pirminių ląstelių krioprezervacija ir atšildymas užkerta kelią ląstelių mirčiai ir pažeidimams saugojimo bei naudojimo metu. Žmogaus pirminės ląstelės apsaugomos nuo užšalimo naudojant DMSO arba glicerolį (esant tinkamai temperatūrai ir kontroliuojant užšalimo greitį). Užšaldymo procesas turi vykti palaipsniui, kas minutę mažinant temperatūrą 1 °C, kad nesusidarytų ledo kristalai. Ilgalaikiam saugojimui reikalingas skystasis azotas (-196 °C) arba temperatūra žemiau -130 °C.

Norint atšildyti krioprezervuotas ląsteles, pakanka užmerkti užšaldytas ląsteles į 37 °C vandens vonią maždaug 1–2 minutėms. Žmogaus pirminės ląstelės neturėtų būti centrifuguojamos po atšildymo iš šaldiklio (nes jos yra ypač jautrios pažeidimams atsigavimo iš krioprezervacijos metu). Tai tinka ląstelėms pasėti iškart po atšildymo ir skatina jų prisitvirtinimą kultūrose per pirmąsias 24 valandas po pasėjimo. 1 Kai krioprezervuotos pirminės ląstelės prisitvirtina, panaudotas terpės mišinys turi būti pašalintas (nes DMSO yra žalingas pirminėms ląstelėms ir gali sumažinti gyvybingumą po atšildymo).