Imetajate rakukultuur: Põhitõed ja tehnikad
Imetaja rakukultuur on bioloogiliste uuringute nurgakivi, mis võimaldab teadlastel uurida rakke kontrollitud keskkonnas väljaspool elusorganisme. See protsess hõlmab rakkude isoleerimist kudedest, nende säilitamist hoolikalt kontrollitud tingimustes ja nende paljundamist erinevatel katse-eesmärkidel. Imetaja rakukultuurid on olulised rakuprotsesside ja haiguste mehhanismide mõistmiseks ning uute ravimeetodite, sealhulgas surematuid rakuliine kasutavate ravimeetodite väljatöötamiseks
Peamised järeldused:
- Rakke saab eraldada kudedest, kasutades ensümaatilist lagundamist või eksplantatsioonikultuuri meetodeid
- Esmaste rakkude eluiga on piiratud, samas kui immortaliseeritud rakuliinid võivad paljuneda lõputult
- Kultuuritingimused, sealhulgas kasvukeskkonna koostis, on rakkude ellujäämise ja paljunemise seisukohalt kriitilise tähtsusega
- Rakke võib kasvatada suspensioonis või adherentsete kultuuridena, sõltuvalt nende tüübist ja uurimisvajadustest
- Levinud kasvukeskkondade hulka kuuluvad MEM, DMEM ja RPMI 1640, mis on kohandatud konkreetsete rakutüüpide jaoks
- Tüüpilised kasvutingimused on 37°C temperatuur, 5% CO2 ja 95% suhteline õhuniiskus
- Võimalike saastumisprobleemide vältimiseks kasutatakse üha enam seerumi alternatiive, nagu inimese trombotsüütide lüsaat (hPL)
Rakkude isoleerimistehnikad
Rakukultuuri loomise protsess algab rakkude isoleerimisega kudedest. Selleks on mitmeid meetodeid, mis sobivad erinevatele koetüüpidele ja uurimisülesannetele. Vereproovide puhul on rakkude isoleerimine suhteliselt lihtne, kusjuures nende kasvuvõime tõttu keskendutakse kasvatamisel eelkõige vere valgelibledele. Tahkete kudede puhul on vaja keerulisemaid isolatsioonimeetodeid. Üks levinud meetod hõlmab ensümaatilist lagundamist, mille puhul kasutatakse ensüüme nagu kollügenaas, trüpsiin või pronaas, et lagundada rakuväline maatriks, vabastades üksikud rakud suspensiooni. Teise võimalusena võivad teadlased kasutada eksplantaadikultuuri meetodit, mille puhul väikesed koetükid asetatakse otse kasvukeskkonda, mis võimaldab rakkudel välja rännata ja paljuneda. Valik nende meetodite vahel sõltub sageli konkreetsest koetüübist, soovitud rakupopulatsioonist ja kavandatavast eksperimentaalsest kasutamisest. Oluline on märkida, et otse organismist isoleeritud rakke nimetatakse primaarseteks rakkudeks ja, välja arvatud mõned erandid, nagu kasvajast saadud rakud, on nende eluiga kultuuris tavaliselt piiratud, enne kui nad vananevad
Olulised tooted imetajarakkude kasvatamiseks
| Toote nimi | Toote number | Kategooria | Kasutamine |
|---|---|---|---|
| DMEM, w: 4,5 g/L glükoosi, w: 4 mM L-glutamiini, w: 1,5 g/L NaHCO3, w: 1,0 mM naatriumpüruvaat, w: 1,0 mM naatriumpüruvaat | 820300a | Kultuurikeskkond | Üldkeskkond erinevate imetajate rakutüüpide jaoks |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 g/L glükoosi, w: 1,6 mM L-glutamiini, w: 15 mM HEPES, w: 1,0 mM naatriumpüruvaati, w: 1,2 g/L NaHCO3 | 820400a | Kultuurikeskkond | Sobib paljude imetajarakkude, eriti epiteelirakkude jaoks |
| RPMI 1640, w: 2,1 mM stabiilne glutamiin, w: 2,0 g/L NaHCO3 | 820700a | Kultuurivahend | Kasutatakse tavaliselt lümfirakkude ja hübriidrakuliinide jaoks |
| Accutase | 830100 | Rakkude dissotsiatsioon | Õrn lahus rakkude eraldamiseks kleepuvatele rakkudele |
| Freeze Medium CM-1 | 800150 | Krüokonserveerimine | Imetajate rakkude külmutamiseks ja pikaajaliseks säilitamiseks |
| Külmutuskeskkond CM-ACF, seerumivaba | 800650 | Krüokonserveerimine | Loomsete komponentide vaba keskkond rakkude külmutamiseks |
| PBS | 860015 | Puhverlahus | Rakkude pesemiseks ja pH-tasakaalu säilitamiseks |
| Endoteelirakkude kasvukeskkond | 820731 | Spetsialiseeritud keskkond | Optimeeritud endoteelirakkude kasvatamiseks |
| Mükoplasma testimine | 900159 | Kvaliteedikontroll | Oluline mükoplasmakontaminatsiooni avastamiseks kultuurides |
| Rakuliinide autentimine - Inimese | 900154 | Kvaliteedikontroll | Kontrollib inimese rakuliinide identiteeti |
Selles tabelis on esitatud valik imetajate rakukultuuride jaoks olulisi tooteid. Meie täieliku rakukultuuritoodete valiku, sealhulgas spetsiaalsete söötmete ja reaktiivide jaoks külastage meie söötmete ja reaktiivide kategooria lehekülge.
- õrn alternatiiv trüpsiinile
Accutase on rakkude eralduslahus, mis on revolutsiooniliselt muutmas rakukultuuritööstust. See on proteolüütiliste ja kollagenolüütiliste ensüümide segu, mis jäljendab trüpsiini ja kollügenaasi toimet. Erinevalt trüpsiinist ei sisalda Accutase imetajate või bakterite komponente ja on rakkude suhtes palju leebem, mistõttu on see ideaalne lahendus rakkude rutiinseks eraldamiseks standardsetest koekultuuride plastmassidest ja adhesiooniga kaetud plastmassidest. Selles blogipostituses uurime Accutase'i eeliseid ja kasutusvõimalusi ning seda, kuidas see muudab rakukultuuride mängu.
Accutase'i eelised
Accutase'il on traditsiooniliste trüpsiinilahuste ees mitmeid eeliseid. Esiteks saab seda kasutada alati, kui on vaja õrnalt ja tõhusalt eraldada mis tahes kleepuvat rakuliini, mistõttu on see otsene asendaja trüpsiinile. Teiseks toimib Accutase väga hästi embrüonaalsete ja neuronaalsete tüvirakkude puhul ning on tõestatud, et see säilitab nende rakkude elujõulisuse pärast passageerimist. Kolmandaks säilitab Accutase enamiku epitoope hilisemaks voolutsütomeetriliseks analüüsiks, mistõttu on see ideaalne rakupinna markerite analüüsiks.
Lisaks ei ole Accutase'i vaja neutraliseerida adherentsete rakkude passageerimisel. Kui pärast rakkude jagamist lisatakse rohkem keskkonda, lahjendatakse Accutase, nii et see ei ole enam võimeline rakke eraldama. See välistab vajaduse inaktiveerimise etapi järele ja säästab rakukultuuritehnikute aega. Lõpuks ei ole vaja Accutase'i aliquotida ja pudel püsib külmkapis 2 kuud.
Accutase'i rakendused
Accutase on otsene trüpsiinilahuse asendaja ja seda saab kasutada rakuliinide passageerimiseks. Lisaks toimib Accutase hästi rakkude eraldamisel paljude rakupinna markerite analüüsiks voolutsütomeetria abil ja rakkude sorteerimiseks. Muud Accutase töötlemise rakendused hõlmavad rakupinna markerite analüüsi, viiruste kasvu analüüsi, rakkude proliferatsiooni, kasvajarakkude migratsiooni teste, rutiinset rakupassaaži, tootmise suurendamist (bioreaktor) ja voolutsütomeetriat.
Accutase koostis
Accutase ei sisalda imetajate või bakterite komponente ja on looduslik ensüümsegu, millel on proteolüütiline ja kollagenolüütiline ensüümiaktiivsus. See on formuleeritud palju madalamas kontsentratsioonis kui trüpsiin ja kollügenaas, mis muudab selle vähem toksiliseks ja õrnemaks, kuid sama tõhusaks.
Accutase tõhusus
Accutase on osutunud tõhusaks primaar
- ja tüvirakkude eraldamisel ja rakkude kõrge elujõulisuse säilitamisel võrreldes loomset päritolu ensüümidega, nagu trüpsiin. pärast 10 minutit on 100% rakkudest tagasi saadud ning tänu Accutase'i autodigestioonile ei ole kahjulik jätta rakke Accutase'ile kuni 45 minutiks.
Kokkuvõttes
Kokkuvõttes on Accutase võimas lahendus, mis muudab rakukultuuride mängu. Tänu oma õrnale olemusele, tõhususele ja mitmekülgsusele on Accutase ideaalne alternatiiv trüpsiinile. Kui otsite usaldusväärset ja tõhusat lahendust rakkude eraldamiseks, on Accutase teie jaoks õige lahendus.
Fosfaadiga puhverdatud soolalahus (PBS) on bioloogilistes ja keemilistes uuringutes laialdaselt kasutatav puhverlahus. See mängib olulist rolli pH-tasakaalu ja osmolaarsuse säilitamisel erinevate katsete, sealhulgas kudede töötlemise ja rakukultuuride käigus. Meie PBS-lahus on hoolikalt formuleeritud kõrge puhtusastmega koostisosadest, et tagada stabiilsus ja usaldusväärsus igas eksperimendis. Meie PBS-i osmolaarsus ja ioonide kontsentratsioonid jäljendavad täpselt inimkeha omast, mistõttu on see isotooniline ja enamikule rakkudele mittetoksiline.
Meie PBS-lahuse koostis
Meie PBS-lahus on ülipuhaste fosfaatpuhvrite ja soolalahuste pH-ga kohandatud segu. 1X töökontsentratsioonis sisaldab see järgmist:
8000 mg/l naatriumkloriidi (NaCl)
200 mg/l kaaliumkloriidi (KCl)
1150 mg/L naatriumfosfaat kahealuseline veevaba (Na2HPO4)
200 mg/L Kaaliumfosfaat monobaasiline veevaba (KH2PO4)
See koostis tagab optimaalse pH ja ioonitasakaalu, mis sobib mitmesuguste bioloogiliste rakenduste jaoks.
Meie PBS-lahuse rakendused
Meie PBS-lahus sobib ideaalselt mitmesugusteks rakendusteks bioloogilistes uuringutes. Selle isotoonilised ja mittetoksilised omadused muudavad selle sobivaks ainete lahjendamiseks ja rakukonteinerite loputamiseks. EDTA-d sisaldavad PBS-lahused on tõhusad kinnitunud ja klompunud rakkude eraldamiseks. PBS-i ei tohiks siiski lisada kahevalentseid metalle, nagu tsink, kuna see võib põhjustada sadestumist. Sellistel juhtudel soovitatakse kasutada Good's puhvreid. Lisaks on meie PBS-lahus vastuvõetav alternatiiv viiruste transpordikeskkonnale RNA-viiruste, sealhulgas SARS-CoV-2 transportimiseks ja säilitamiseks.
Kvaliteedikontroll
Steriilselt filtreeritud
Säilitamine ja säilivusaeg
Säilitada +2°C kuni +25°C juures, valguse eest kaitstult.
Pärast avamist säilitada temperatuuril 2°C kuni 25°C ja kasutada 24 kuu jooksul.
Veotingimused
Keskkonnatemperatuur
Hooldus
Hoida külmkapis +2°C kuni +8°C juures pimedas. Vältida külmutamist ja sagedast soojendamist kuni +37°C, kuna see vähendab toote kvaliteeti.
Ärge kuumutage keskkonda üle 37°C ega kasutage kontrollimatuid soojusallikaid, näiteks mikrolaineahjusid.
Kui kasutatakse ainult osa söötmest, võtke vajalik kogus välja ja soojendage see enne kasutamist toatemperatuurini.
Koostis
Kategooria
Komponendid
Kontsentratsioon (mg/l)
Soolad
Kaaliumkloriid
200
Kaaliumfosfaat monobaasiline veevaba
200
Naatriumkloriid
8000
Naatriumfosfaat kahealuseline veevaba
1150
Analüüsimeetod
CLS pakub mükoplasma tuvastamiseks nii lühi
- kui ka pikaajalisi teste. Esimese puhul testitakse proove kohe pärast nende saabumist, samas kui teise puhul alustatakse rakukultuuri ja rakke testitakse pärast 14 päeva kestnud antibiootikumivaba kasvatust. Mükoplasma testimine toimub kahepunktilise tuvastamissüsteemi abil, kasutades nii PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) kui ka Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Proovid
Pikatesti jaoks palume esitada vähemalt 50 µl rakususpensiooni, mis sisaldab 50 000 rakku. Rakususpensiooni võib saata ümbritseval temperatuuril.
Premium-testi jaoks palume esitada vähemalt 1 miljon rakku sobivas külmutussöötmes, et tagada tugev ja terve kultuur rakkude kasvatamiseks ja hilisemaks testimiseks. Proovid palume saata kuivjääl.
Palun täitke mükoplasma testimise proovi vorm ja lisage see oma proovisaadetisele.
Kolorimeetriline reporteranalüüs
See test on rakupõhine kolorimeetriline test. Mükoplasma juuresolekul indutseerib reporterrakkude rida signaalkaskaadi, mis kutsub esile keskmise värvuse muutumise punasest siniseks. Analüüs viiakse läbi 96-kujulises mitmekambrilises plaadis. Signaalid tuvastatakse mikroplaadi spektrofotomeetriga 620-655 nm juures. Avastatakse kõik mükoplasma
- ja akooleplasmaliigid, aga ka muud rakukultuuris olevad saasteained, näiteks bakterid.
Isotermiline amplifikatsioon
Isotermiline amplifikatsioon on kiire ja usaldusväärne test, mis põhineb mükoplasmaspetsiifilise DNA isotermilisel amplifikatsioonil koos reaalajas tuvastamisega, kasutades DNA-interkalatsioonivärvi. Testiga on võimalik tuvastada kuus kõige levinumat liiki, mis moodustavad >95% saastumistest: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis ja A.laidlawii. Järjestuse homoloogia tõttu tuvastatakse ka teisi mükoplasmaliike (M.pneumoniae, M.gallisepticum ja M.synoviae). Selleks, et teha kindlaks, kas proov on mükoplasmapositiivne või negatiivne, uuritakse sulamistemperatuuri (Tm).
Kokkuvõte: Imetajate rakukultuuride keskne roll kaasaegses teadustöös
Imetajate rakukultuurid on bioloogiliste ja meditsiiniliste uuringute jaoks revolutsiooni põhjustanud, pakkudes teadlastele võimsaid vahendeid keeruliste rakuprotsesside, haiguste mehhanismide ja võimalike terapeutiliste sekkumiste uurimiseks. Alates primaarsete rakkude isoleerimisest kuni immortaliseeritud rakuliinide väljatöötamiseni on see tehnika muutunud kaasaegse teadusliku tööriistakomplekti asendamatuks osaks
Imetaja rakukultuuri teekond algab hoolikatest isoleerimistehnikatest, kulgeb rakkude hoolika hooldamise kaudu spetsiaalsetes keskkondades ja kulmineerub mitmesuguste rakenduste kaudu erinevates uurimisvaldkondades. Olgu tegemist siis vähiuuringute, ravimite avastamise või põhilise rakubioloogiaga, võime kasvatada ja manipuleerida imetajarakke in vitro on avanud enneolematuid võimalusi teaduslikeks uuringuteks
Imetaja rakukultuuri edu võtmeks on hoolikalt kontrollitud tingimused, milles rakke hoitakse. Alates kasvukeskkonna koostisest kuni inkubaatorite täpsete keskkonnaparameetriteni optimeeritakse iga aspekti, et jäljendada võimalikult täpselt rakkude loomulikke tingimusi. Selline tähelepanu üksikasjadele tagab katsete usaldusväärsuse ja reprodutseeritavuse, mis on hea teadustava nurgakivi
Immortaliseeritud rakuliinide, näiteks laialdaselt kasutatavate HeLa rakkude väljatöötamine on rakukultuuri võimalusi veelgi laiendanud. Need rakuliinid pakuvad järjepidevaid, kergesti kättesaadavaid rakumudeleid, mis on kiirendanud teadusuuringuid paljudes teadusharudes
Tulevikku vaadates areneb imetajate rakukultuur jätkuvalt. Edusammud 3D-kultuuritehnikate, organoidide arendamise ja keemiliselt määratletud keskkondade kasutamise vallas laiendavad rakukultuuri võimaluste piire. Need arengud lubavad tuua in vitro mudelid veelgi lähemale in vivo süsteemide keerukusele, mis võib tuua revolutsiooni ravimite avastamisel, personaliseeritud meditsiinis ja meie arusaamises inimese bioloogiast
Kokkuvõtteks võib öelda, et imetajate rakukultuur on endiselt dünaamiline ja oluline meetod bioteaduste uurimisel. Selle jätkuv täiustamine ja kasutamine mängib kahtlemata olulist rolli bioloogias ja meditsiinis kõige pakilisemate küsimuste lahendamisel, mis aitab teaduslikku arengut edendada veel aastaid