Inimese primaarrakud

Mis on inimese primaarrakud?

Esmased rakud on oma vastavate kudede kõige puhtam esindus. Need eraldatakse kudedest ja töödeldakse nii, et need saaksid juurduda ideaalsete tingimustega kultuurikeskkonnas. Need jäljendavad täpsemalt in vivo seisundit ja ilmutavad normaalset füsioloogiat, kuna need on saadud koest, mitte modifitseeritud. Seetõttu võivad need olla kasulikud mudelid rakufarmakoloogia, toksikoloogia ja füsioloogia uurimisel (sealhulgas ainevahetuse, vananemise ja signaaliülekande uuringutes). Tuleb meeles pidada, et primaarrakkude kasvatamine ja hooldamine on keerulisem kui pideva rakuliini puhul, kuna neil on lühem eluiga ja nad lõpetavad jagunemise (või vananevad) pärast teatud arvu rakkude jagunemisi. Rakusignaaliteede uuringuid raskendab doonoritelt saadud primaarrakkude loomulik varieeruvus ning subkultiveerimise protsessid. Enne signaaliteede uuringute alustamist viivad teadlased sageli läbi sõelumise, et teha kindlaks, kas rakud reageerivad tavaliselt kasutatavatele stiimulitele. Aja ja raha raiskamise vältimiseks võib primaarrakke enne sõelumist stimuleerida, et aktiveerida peamised signaaliteed.

Miks kasutada inimese primaarrakke?

Rakuanalüüsides kasutatakse tavaliselt immortalisatud rakuliine. Kuigi teadlased on tunnistanud, et rakuliinidest tingitud bioloogilised muutused võivad olla kahjulikud nende füsioloogilise tähtsuse uurimisel. Inimese primaarrakkude kasutamine parandab rakukultuuride kaudu saadud andmete füsioloogilist väärtust ning neid peetakse üha enam oluliseks bioloogiliste protsesside, haiguste kulgemise ja ravimite arendamise uurimisel.

Inimese primaarrakke kasutatakse laialdaselt rakkudevahelise ja rakusisese suhtluse, arengubioloogia ning vähi, Parkinsoni tõve ja diabeedi aluseks olevate mehhanismide in vitro uuringutes, samuti paljudes teistes prekliinilistes ja uurimuslikes bioloogilistes uurimisvaldkondades. Teadlased on kudede funktsiooni uurimiseks juba pikka aega kasutanud immortaliseeritud rakuliine; siiski ei pruugi ilmsete mutatsioonide ja kromosoomianomaaliatega rakuliinid olla head asendajad normaalrakkudele ega haiguse varajase staadiumi arengule. Konkreetset koerakkude tüüpi on nüüd võimalik täpsemalt modelleerida, kasutades sellest koest eraldatud inimese primaarrakke, mida kasvatatakse primaarrakkude kasvatuskeskkondades ja lisanditega.

Mis on primaarrakkude kultuur?

Immortaliseeritud rakuliinide asemel hõlmab primaarrakkude kultuur rakkude kasvatamist otse mitmerakulise organismi kehaväliselt. Mõnes riigis, näiteks Ühendkuningriigis, on juriidiliselt tunnustatud asjaolu, et primaarrakkude kultuurid esindavad in vivo kudesid paremini kui rakuliinid. Siiski vajavad primaarrakud kasvamiseks sobivat substraati ja toitaineid ning pärast teatud arvu jagunemisi tekib neil vananemisfenotüüp, mis põhjustab nende jagunemise lõpliku peatumise. Need kaks tegurit motiveerivad rakuliinide loomist. Nii looduslikult surematuks muudetud primaarrakke (nt HeLa-rakud) kui ka kunstlikult surematuks muudetud primaarrakke (nt HEK-rakud) saab rakukultuuris lõpmatult kasvatada.

Inimese primaarrakud koetüüpide kaupa

Epiteelirakud, fibroblastid, keratinotsüüdid, melanootsüüdid, endoteelirakud, lihasrakud, immuunrakud ja tüvirakud, nagu mesenküümse tüvirakud, kuuluvad teadusuuringutes kõige sagedamini kasutatavate inimese primaarrakkude hulka. Esiteks on kultuurid heterogeensed (esindades koes esinevate rakutüüpide segu) ning neid saab in vitro elus hoida vaid kindla aja jooksul. Transformatsioon on in vitro protsess, mis võimaldab inimese primaarrakke manipuleerida piiramatu arvu subkultuuride saamiseks. Transformatsioon võib toimuda loomulikult või seda võib esile kutsuda kemikaalide või viiruste abil. Pärast geneetilist transformatsiooni võib primaarkultuur jaguneda lõpmatult, moodustades surematu sekundaarse rakuliini, kui talle antakse piisavalt toitaineid ja ruumi.

Endoteelrakud

Vähiravi, haavade paranemine, rakkude signaalimise uuringud, suure läbilaskevõimega ja suure sisaldusega sõelumine ning toksikoloogiline sõelumine on vaid mõned valdkonnad, kus primaarsete endoteelrakkude kasutamine uurimisvahendina võib kasu tuua.

Keratinotsüüdid

Keratinotsüüdid, mis on saadud kas täiskasvanud inimese naha epidermisest või vastsündinu eesnahast, mängivad olulist rolli nahahaiguste, nagu psoriaasi ja vähi, uurimisel.

Epiteelrakud

Alates vähiuuringutest kuni toksikoloogiliste uuringuteni on primaarsed epiteelirakud osutunud hindamatuks ressursiks keha loomulike kaitsemehhanismide modelleerimisel.

Fibroblastid

Indutseeritud pluripotentsete tüvirakkude (iPS-rakkude) loomine ja haavade paranemise uurimine on vaid mõned paljudest primaarsete fibroblastide kasutusvõimalustest.

Immuunrakud

Perifeerse vere mononukleaarrakud, lühidalt PBMC, on vere mononukleaarrakud, millel on ümmargune rakutuum. Need koosnevad peamiselt lümfotsüütidest ja monotsüütidest, millel on immuunvastuse käigus olulised funktsioonid. Perifeerse vere mononukleaarrakke kasutatakse sageli infektsioonide diagnoosimiseks või võimaliku vaktsiinikaitse tuvastamiseks. T-rakkude vahendatud rakulise immuunvastuse mõistmine on sageli otsustava tähtsusega.

Melanotsüüdid

Melanotsüüdid, spetsialiseerunud naharakud, mis toodavad pigmenti melaniini, on kasulikud mudelitena selliste teemade uurimisel nagu haavade paranemine, toksilisus, melanoom, naha reaktsioon ultraviolettkiirgusele (UV), nahahaigused ja kosmeetika.

Tüvirakud

Tüvirakkudel on potentsiaal diferentseeruda mitmesugusteks rakutüüpideks. Tänu oma diferentseerumisvõimele pakuvad nad uusi võimalusi inimkoe ja terviseseisundite modelleerimiseks.

Mesenküümse tüvirakud

Mesenküümseid tüvirakke, mida tuntakse ka lühendina MSC, saab saada erinevatest inimese allikatest, nagu luuüdi, rasv (rasvkude), nabanööri kude (Whartoni geel) ja amnioni vedelik (lootet ümbritsev vedelik), ning neid on võimalik in vitro paljundada. Nendel täiskasvanud strooma tüvirakkudel on võime areneda mitmesugusteks rakutüüpideks. Nende hulka kuuluvad näiteks luurakkud, kõhrerakud, lihasrakud, närvirakud, naharakud ja sarvkesta rakud.

Silelihasrakud

Õõnsates organites katavad esmased silelihasrakud (SMC) organite sisepinda ja tagavad nende kokkutõmbumisvõime. Lisaks vähi ja muude haiguste uurimisele saab silelihasrakke kasutada ka hüpertensioonifibroosi modelleerimiseks.

Esmased rakud ja rakuliinid

Kas spontaanse mutatsiooni teel, nagu transformeeritud vähirakkude liinide puhul, või tahtliku muutmise kaudu, nagu vähigeenide kunstlikul tootmisel, on pidevad rakuliinid omandanud võime lõputult paljuneda (surematud). Reeglina on pidevad rakuliinid usaldusväärsemad ja nendega on mugavam töötada kui primaarrakkudega. Neid saab lõpmatult paljundada ja need võimaldavad kiiret juurdepääsu olulistele andmetele. Pidevate rakuliinide kasutamisel on teatud piirangud, sealhulgas asjaolu, et need on geneetiliselt muundatud/transformeeritud, mis võib muuta nende füsioloogilisi omadusi ja põhjustada mittevastavust in vivo tingimustele, ning et need omadused võivad aja jooksul märkimisväärse passaažimise tulemusel veelgi muutuda.

Edusammud primaarrakkude kultiveerimisel

Primaarrakkudel on kurikuulus maine, et nendega on raske töötada. Protsess on aga muutumas lihtsamaks kui kunagi varem tänu arengutele primaarrakkude kultiveerimises, täielikult optimeeritud protokollidega kaubanduslikult kättesaadavate primaarrakkude olemasolule ning uutele analüüsimeetoditele, mis nõuavad vähem panust.

Üleminek kahemõõtmeliselt rakukultuurilt kolmemõõtmelisele peetakse selles valdkonnas oluliseks verstapostiks. Koespetsiifiline arhitektuur, rakkudevahelised interaktsioonid ning mehaanilised ja biokeemilised signaalid võivad kahemõõtmelises kultuuris nõrgeneda. Seega on nende kultuuride bioloogilisel väärtusel piirid.

Teisalt võimaldab kolmemõõtmeline rakukultuur rakkudel paljuneda ja suhelda kolmemõõtmelise ekstratsellulaarse raamistikuga. See võimaldab rakkudel suhelda nii omavahel kui ka ekstratsellulaarse maatriksiga, muutes kolmemõõtmelised kultuurid füsioloogiliselt asjakohasemaks. Selle meetodi täpsus in vivo reaktsioonide ennustamisel on muutnud selle revolutsiooniliseks sellistes valdkondades nagu ravimite avastamine ja arendamine. Seetõttu pakuvad tipptehnoloogiad, nagu patsientidelt saadud organoidid ja „organ-on-a-chip” (organ-kiibil), ravimite sõelumiseks ja arendamiseks väga kontekstuaalseid mudeleid.

Esmaste rakkude saamine on esmase kultuuri puhul kitsaskoht. Selle ületamiseks on tavaliselt vaja suuremat kudede kogust, mida võib olla keeruline saavutada. Siiski pakub paranenud analüütiline tundlikkus väljapääsu. Näiteks vähendab vajadust kasvatada suuri koguseid primaarrakke üherakulise tehnoloogia kasutamine, mis hõlmab sekveneerimist, Western blottingut ja masstsütomeetriat.

Esmaste rakkude kultiveerimise paljulubavad väljavaated

Tehnoloogia areng leevendab primaarrakkude kultiveerimisega seotud üldisi raskusi. Seetõttu asendab see meetod kiiresti teisi meetodeid kui kuldstandard rakubioloogia ja molekulaarbioloogia uuringutes ja praktikas. Vaktsiinide tootmine, elundite asendamine, tüvirakuravi, vähiuuringud ja palju muud saavad primaarrakkude kultiveerimise jätkuvast arengust suurt kasu.

Esmasrakkude kultiveerimise näpunäited ja nipid

Rakkude paljundamise vajadused

Kaks kõige levinumat primaarrakkude kasvatamise meetodit on suspensioonis või pinnal (2D). Mõned rakud suudavad vereringes vabalt hõljuda, ilma et nad kunagi pinnale kinnituksid (näiteks perifeersest verest saadud rakud). On loodud erinevaid rakuliine, mis arenevad hästi suspensioonikultuurides, kus nad võivad saavutada tihedusi, mis on 2D kasvu tingimustes saavutamatud. Primaarrakke, mis vajavad in vitro kasvamiseks kinnitumist, nimetatakse adhereeruvateks rakkudeks ja nende hulka kuuluvad ka tahkete kudede rakud. Adhesiivsusomaduste parandamiseks ning kasvu ja diferentseerumiseks vajalike muude signaalide tagamiseks kasvatatakse neid rakke tavaliselt siledal, katmata plastanumas, kuid mõnikord ka mikro-kandjal. Viimane variant võib olla kaetud ekstratsellulaarsete maatriksvalkudega (nagu kollageen ja laminiin). Rakukultuuris kasutatav kasvukeskkond koosneb põhikeskkonnast, millele on lisatud sobivad kasvufaktorid ja tsütokiinid. Rakukultivaator on spetsiaalne laboratoorne inkubaator, mida kasutatakse rakkude kasvatamiseks ja hoidmiseks kindlal temperatuuril ja gaaside segus (tavaliselt 37 °C, 5% CO₂ imetajate rakkude puhul). Sõltuvalt kasvatatava raku tüübist võivad optimaalsed tingimused olla väga erinevad. Kasvatatavate rakkude tüüpidest sõltuvalt sisaldab optimaalne kasvukeskkond ainulaadset tegurite kombinatsiooni, sealhulgas, kuid mitte ainult, pH-väärtust, glükoosikontsentratsiooni, kasvufaktoreid ja muude toitainete olemasolu.

Kasvukeskkonnas olevad antibiootikumid on esmase kultuuri loomisel üliolulised, et vältida saastumist peremeeskudest. Mõned antibiootikumiraviskeemid hõlmavad gentamütsiini, penitsilliini, streptomütsiini ja amfoteritsiin B kombinatsiooni. Antibiootikumide pikaajalist kasutamist ei soovitata, kuna mõned ravimid (nagu amfoteritsiin B) võivad pikemas perspektiivis rakkudele toksilised olla.

Enamik primaarrakke läbib vananemise ja lõpetab jagunemise pärast teatud arvu populatsiooni kahekordistumisi, mistõttu on äärmiselt oluline hoida neid pärast eraldamist elus. Rakkude pikaajaline eluvõime eeldab asjatundlikke rakukultiveerimistehnikaid ja ideaalseid kultiveerimistingimusi (sealhulgas õiget kasvukeskkonda, õiget temperatuuri, õiget gaaside segu, õiget pH-väärtust, kasvufaktorite õiget kontsentratsiooni, toitainete olemasolu ja glükoosi olemasolu). Kuna paljud kasvufaktorid, mida kasutatakse kasvukeskkonna täiendamiseks, saadakse loomade verest (verest saadud koostisosadel on saastumise oht), soovitatakse nende kasutamist vähendada või neist üldse loobuda. Samuti on oluline kasutada aseptilisi meetodeid.

Subkultuur ja hooldus

Kui isoleeritud rakud kinnituvad kultuurikausi pinnale, tähistab see säilitamisetapi algust. Kinnitumine toimub tavaliselt 24 tundi pärast kultuuri algust. Rakke tuleks subkultiveerida, kui need on saavutanud teatud konfluentsusprotsendi ja paljunevad aktiivselt. Kuna konfluentsuse saavutanud rakud võivad läbida diferentseerumise ja näidata pärast passaaži aeglasemat proliferatsiooni, on parim subkultiveerida esmaseid rakukultuure enne, kui need saavutavad 100% konfluentsuse.

Subkultiveerimine värskes kasvukeskkonnas säilitab kinnitumisest sõltuvate rakkude eksponentsiaalse kasvu. Monokihkide subkultiveerimine katkestab rakkudevahelised ja rakusiseseid rakupinna interaktsioone. Adheersiooniga primaarrakkude eraldamiseks monokihist või kudedest kasutatakse madala kontsentratsiooniga proteolüütilisi ensüüme, nagu trüpsiin/EDTA. Pärast dissotsieerimist ja lahjendamist üherakulisse lahusesse loendatakse rakud ja viiakse üle värsketesse kultuurinõudesse, et need uuesti kinnituksid ja paljuneksid.

Krüokonserveerimine ja taastamine

Krüokonserveerimine säilitab elusrakke, külmutades neid madalatel temperatuuridel. Inimese primaarrakkude krüokonserveerimine ja sulatamine hoiab ära rakkude surma ja kahjustumise säilitamise ja kasutamise ajal. Inimese primaarrakke kaitstakse külmumise eest DMSO või glütserooliga (õigel temperatuuril ja kontrollitud külmutamiskiirusega). Külmutamine peab toimuma järk-järgult, langedes iga minuti jooksul 1 °C võrra, et vältida jääkristallide teket. Pikaajaliseks säilitamiseks on vaja vedelat lämmastikku (-196 °C) või temperatuure alla -130 °C.

Krüokonserveeritud rakkude sulatamiseks piisab külmutatud rakkude umbes 1–2-minutilisest hoidmisest 37 °C veevannis. Inimese primaarrakke ei tohi pärast külmikust väljavõtmist tsentrifuugida (kuna need on krüokonserveerimisest taastumise ajal kahjustuste suhtes äärmiselt tundlikud). See sobib rakkude plaadile külvamiseks kohe pärast sulatamist ning soodustab rakkude kinnitumist kultuuris esimese 24 tunni jooksul pärast külvamist. 1 Pärast krüokonserveeritud primaarrakkude kinnitumist tuleb kasutatud kasvukeskkond eemaldada (kuna DMSO on primaarrakkudele kahjulik ja võib põhjustada eluvõimelisuse langust pärast sulatamist).