Inimese esmased rakud

Mis on inimese primaarsed rakud?

Esmased rakud on vastavate kudede kõige puhtamad esindused. Nad isoleeritakse koest ja töödeldakse, et nad saaksid kinnistuda ideaalsetes tingimustes kultuuris. Nad jäljendavad paremini in vivo seisundit ja näitavad normaalset füsioloogiat, sest nad on saadud koest, mitte modifitseeritud. Seetõttu võivad nad olla kasulikud mudelid rakufarmakoloogia, toksikoloogia ja füsioloogia (sealhulgas ainevahetuse, vananemise ja signaaliülekande uuringud) uurimiseks. Pidage meeles, et primaarrakke on keerulisem kasvatada ja hooldada kui pidevaid rakuliine, sest nende eluiga on lühem ja nad lõpetavad jagunemise (või vananevad) pärast teatud arvu rakkude jagunemisi. Rakkude signaaliradade uuringuid raskendab doonoritelt ja subkultuuride abil saadud primaarsete rakkude omane varieeruvus. Enne signaaliuuringute alustamist viivad teadlased sageli läbi sõeluuringu, et teha kindlaks, kas rakud reageerivad üldkasutatavatele stiimulitele või mitte. Aja ja raha raiskamise vältimiseks saab primaarseid rakke stimuleerida, et aktiveerida peamisi signaaliradu enne sõelumist.

Miks kasutada inimese esmaseid rakke?

Immortaliseeritud rakuliine kasutatakse tavaliselt rakuanalüüsina. Kuigi teadlased on tunnistanud, et rakuliinidest tingitud bioloogilised muutused võivad nende füsioloogilise tähtsuse uurimisel olla kahjulikud. Inimese primaarsete rakkude kasutamine parandab rakukultuuride abil saadud andmete füsioloogilist väärtust ning neid peetakse üha enam oluliseks bioloogiliste protsesside, haiguste kulgemise ja ravimite väljatöötamise uurimisel.

Inimese primaarseid rakke kasutatakse laialdaselt in vitro uuringutes, mis käsitlevad rakkudevahelist ja rakusisest kommunikatsiooni, arengubioloogiat ning vähi, Parkinsoni tõve ja diabeedi ning paljude teiste prekliiniliste ja uurivate bioloogiliste uuringute valdkondade aluseks olevaid mehhanisme. Teadlased on pikka aega kasutanud kudede funktsiooni uurimiseks immortaliseeritud rakuliine; siiski ei pruugi ilmsete mutatsioonide ja kromosoomianomaaliatega rakuliinid olla head asendajad normaalsete rakkude ja haiguse arengu varajases staadiumis. Konkreetse koe rakutüübi täpsema mudeli saab nüüd saavutada, kasutades sellest koest isoleeritud ja primaarses rakukultuurikeskkonnas ja toidulisandites säilitatud inimese primaarseid rakke.

Mis on primaarne rakukultuur?

Immortaliseeritud rakuliinide kasutamise asemel hõlmab primaarne rakukultuur rakkude kasvatamist otse mitmerakulisest organismist väljaspool keha. Mõnes riigis, näiteks Ühendkuningriigis, on õiguslikult tunnustatud, et primaarsed rakukultuurid on in vivo kudede suhtes representatiivsemad kui rakuliinid. Sellest hoolimata vajavad primaarsed rakud kasvamiseks õiget substraati ja toitaineid ning pärast teatud arvu jagunemisi tekib neil vananev fenotüüp, mis põhjustab nende lõpliku jagunemise lõpetamise. Need kaks tegurit motiveerivad rakuliinide loomist. Nii looduslikult immortaliseeritud primaarseid rakke (nt HeLa rakud) kui ka kunstlikult immortaliseeritud primaarseid rakke (nt HEK rakud) saab rakukultuuris kasvatada piiramatult.

Inimese primaarsed rakud koetüüpide kaupa

Teaduslikes uuringutes kõige sagedamini kasutatavad inimese primaarsed rakud on epiteelirakud, fibroblastid, keratinotsüüdid, melanotsüüdid, endoteelirakud, lihasrakud, immuunrakud ja tüvirakud, nagu mesenhümaalsed tüvirakud. Alustuseks on kultuurid heterogeensed (esindavad koes esinevate rakutüüpide segu) ja neid saab in vitro elus hoida ainult teatud aja jooksul. Transformeerimine on in vitro protsess, mis võimaldab inimese primaarseid rakke manipuleerida piiramatute subkultuuride jaoks. Transformeerumine võib toimuda loomulikult või seda võib indutseerida kemikaalide või viiruste abil. Pärast geneetilise transformatsiooni läbimist võib primaarkultuur jaguneda määramata ajaks immortaliseeritud sekundaarseks rakuliiniks, kui talle antakse piisavalt toitaineid ja ruumi.

Endoteelirakud

Vähiravi, haavade paranemine, rakusignaalide uurimine, suure läbilaskevõimega ja suure sisuga sõeluuringud ning toksikoloogiline sõeluuring on vaid mõned valdkonnad, kus primaarsete endoteelirakkude kasutamine uurimisvahendina võib olla kasulik.

Keratinotsüüdid

Keratinotsüüdid, mis on saadud kas täiskasvanud inimese naha või vastsündinu eesnaha epidermisest, mängivad olulist rolli selliste nahahaiguste nagu psoriaas ja vähk uurimisel.

Epiteelrakud

Alates vähiuuringutest kuni toksikoloogiliste uuringuteni on primaarsed epiteelirakud osutunud hindamatuks ressursiks keha loomuliku kaitsevõime modelleerimisel.

Fibroblastid

Pluripotentsete tüvirakkude (iPS) indutseerimine ja haavade paranemise uurimine on vaid mõned primaarsete fibroblastide paljudest kasutusaladest.

Immuunirakud

Perifeerse vere mononukleaarsed rakud, lühendatult PBMC, on ümarrakulise tuumaga vere mononukleaarsed rakud. Nende hulka kuuluvad peamiselt lümfotsüüdid ja monotsüüdid, mis täidavad immuunvastuse käigus olulisi funktsioone. Perifeerse vere mononukleaarseid rakke kasutatakse sageli infektsioonide diagnoosimiseks või võimaliku vaktsineerimiskaitse tuvastamiseks. T-rakkude poolt vahendatud rakulise immuunvastuse tundmaõppimine on sageli otsustava tähtsusega.

Melanotsüüdid

Melanotsüüdid, spetsialiseerunud naharakud, mis toodavad pigmenti melaniini, on kasulikud mudelid selliste teemade uurimisel nagu haavade paranemine, toksilisus, melanoom, naha vastus ultraviolettkiirgusele (UV), nahahaigused ja kosmeetika.

Tüvirakud

Tüvirakkudel on võime diferentseeruda väga erinevateks rakutüüpideks. Tänu oma diferentseerumisvõimele pakuvad nad uusi võimalusi inimkudede ja terviseseisundite modelleerimiseks.

Mesenhüümilised tüvirakud

Mesenhümaalseid tüvirakke, mida nimetatakse ka MSC-deks, võib saada erinevatest inimallikatest, nagu luuüdi, rasvkude (rasvkoe), nabanööri kude (Whartoni tarretis) ja lootevesi (lootet ümbritsev vedelik), ning neid saab in vitro laiendada. Need täiskasvanud stromaalsed tüvirakud on võimelised arenema mitmesugusteks rakutüüpideks. Mõned neist rakutüüpidest on luurakud, kõhrrakud, lihasrakud, närvirakud, naharakud ja sarvkesta rakud.

Silelihasrakud

Õõnsates elundites on primaarsed silelihasrakud (SMC), mis vooderdavad sisemust ja vahendavad kontraktiilsust. Lisaks vähile ja muudele haigustele saab SMCsid kasutada ka hüpertensioonifibroosi modelleerimiseks.

Esmased rakud ja rakuliinid

Pidevad rakuliinid on kas spontaanse mutatsiooni teel, nagu transformeeritud vähirakuliinid, või tahtliku muutmise teel, nagu vähigeenide kunstlik tootmine, omandanud potentsiaali lõputult paljuneda (immortaliseeritud). Reeglina on pidevad rakuliinid usaldusväärsemad ja mugavamini käsitletavad kui primaarsed rakud. Nad võivad laieneda lõputult ja pakkuda kiiret juurdepääsu olulistele andmetele. Pidevate rakuliinide kasutamisel on teatavad piirangud, sealhulgas asjaolu, et need on geneetiliselt muundatud/transformeeritud, mis võib muuta füsioloogilisi omadusi ja mitte vastata in vivo seisundile, ning et see võib aja jooksul veelgi muutuda märkimisväärse passageerimise korral.

Edusammud primaarse rakukultuuri valdkonnas

Esmastel rakkudel on kurikuulus maine, et nendega on raske töötada. Protsess on siiski muutumas lihtsamaks kui kunagi varem tänu arengutele primaarse rakukultuuri alal, täielikult optimeeritud protokollidega kaubanduslikele primaarsetele rakkudele ja uutele analüüsimeetoditele, mis nõuavad vähem panust.

Kahemõõtmeliselt rakukultuurilt kolmemõõtmelisele rakukultuurile üleminekut peetakse oluliseks verstapostiks selles valdkonnas. Koespetsiifiline arhitektuur, rakkude ja rakkude vastastikmõju ning mehaaniline/biokeemiline signalisatsioon võivad olla 2D-kultuuris nõrgemad. Seega on nende kultuuride bioloogiline väärtus piiratud.

Teisest küljest võimaldab 3D-rakukultuur rakkude laienemist ja suhtlemist 3D-rakuvälise raamistikuga. See võimaldab rakkudel üksteisega ja rakuvälise maatriksiga suhelda, mis muudab 3D-kultuurid füsioloogiliselt asjakohasemaks. Selle meetodi täpsus in vivo reaktsioonide prognoosimisel on muutnud selle revolutsiooniliseks sellistes valdkondades nagu ravimite avastamine ja arendamine. Seetõttu pakuvad nüüdisaegsed tehnoloogiad, nagu patsientidest saadud organoidid ja organid kiibil, väga kontekstuaalseid mudeleid ravimite sõelumiseks ja arendamiseks.

Esmaste rakkude genereerimine on kitsaskoht primaarses kultuuris. Selle ületamiseks on tavaliselt vaja suuremat koemahtu, mille saavutamine võib olla keeruline. Parem analüütiline tundlikkus pakub siiski võimalust edasiliikumiseks. Näiteks vähendab vajadust kasvatada suures koguses primaarseid rakke üksikute rakkude tehnoloogia kasutamine, mis hõlmab sekveneerimist, Western blottingut ja masstsütomeetriat.

Paljutõotavad väljavaated primaarse rakukultuuri jaoks

Esmaste rakkude kasvatamise üldisi raskusi leevendavad tehnoloogilised edusammud. See meetod on omakorda kiiresti asendamas teisi meetodeid kui kuldstandardit raku- ja molekulaarbioloogilistes uuringutes ja praktikas. Vaktsiinide tootmine, elundite asendamine, tüvirakuteraapia, vähiuuringud ja palju muud saavad suurt kasu primaarse rakukultuuri jätkuvast arengust.

Esmase rakukultuuri nõuanded ja nipid

Rakkude laiendamise vajadused

Kaks kõige levinumat meetodit primaarsete rakkude kasvatamiseks on suspensioonis või pinnal (2D). Mõned rakud suudavad vabalt vereringes hõljuda, ilma et nad kunagi pinnale kinnituksid (näiteks perifeersest verest saadud rakud). Erinevad rakuliinid on konstrueeritud nii, et nad areneksid hästi suspensioonikultuurides, kus nad võivad saavutada tihedusi, mida 2D kasvutingimustes ei ole võimalik saavutada. Esmaseid rakke, mis vajavad in vitro kasvamiseks kinnistumist, nimetatakse adherentseteks rakkudeks ja nende hulka kuuluvad ka tahketes kudedes leiduvad rakud. Adhesiivsete omaduste parandamiseks ja muude kasvuks ja diferentseerumiseks vajalike signaalide andmiseks kasvatatakse neid rakke tavaliselt lamedas katmata plastanumbris, kuid mõnikord ka mikrokandjal. Viimane võib olla kaetud rakuvälise maatriksi valkudega (nt kollageen ja laminiine). Rakukultuuris kasutatav keskkond koosneb põhikeskkonnast, mida on täiendatud sobivate kasvufaktorite ja tsütokiinidega. Rakuinkubaator on spetsiaalne laboratoorne inkubaator, mida kasutatakse rakkude kasvatamiseks ja säilitamiseks teatud temperatuuril ja gaasisegul (imetajate rakkude puhul tavaliselt 37 °C, 5% CO2). Sõltuvalt kasvatatava raku tüübist võivad optimaalsed tingimused olla väga erinevad. Sõltuvalt kasvatatavatest rakuliikidest on optimaalsel kasvukeskkonnal ainulaadne kombinatsioon tegureid, sealhulgas, kuid mitte ainult, pH, glükoosisisaldus, kasvufaktorid ja muude toitainete olemasolu.

Antibiootikumid kasvukeskkonnas on esmane kultuuride rajamise ajal väga olulised, et vältida saastumist peremeeskoest. Mõne antibiootikumirežiimi puhul kasutatakse gentamütsiini, penitsilliini, streptomütsiini ja amfoteritsiini B kombinatsiooni. Antibiootikumide kasutamine pikema aja jooksul ei ole siiski soovitatav, sest mõned reagendid (nt amfoteritsiin B) võivad pikemas perspektiivis olla rakkudele toksilised.

Enamik primaarrakke vananeb ja lõpetab jagunemise pärast teatud arvu populatsiooni kahekordistumisi, mistõttu on oluline hoida neid pärast isoleerimist elus. Rakkude pikaajaline elujõulisus eeldab asjatundlikke rakukultuuride kasvatamistehnikaid ja ideaalseid kasvatustingimusi (sh õige keskkond, õige temperatuur, õige gaasisegu, õige pH, kasvufaktorite õige kontsentratsioon, toitainete ja glükoosi olemasolu). Kuna paljud kasvufaktorid, mida kasutatakse söötmete täiendamiseks, saadakse loomaverest (verest pärinevad koostisosad võivad olla saastunud), soovitatakse nende kasutamist minimeerida või üldse vältida. Samuti on oluline kasutada aseptilist tehnikat.

Subkultuur ja hooldus

Kui isoleeritud rakud kleepuvad kultuuranuma pinnale, tähistab see hooldusfaasi algust. Kinnitumine toimub tavaliselt 24 tundi pärast kultuuri alustamist. Rakke tuleks subkultuurida, kui nad on saavutanud teatud konfluentsusprotsendi ja paljunevad aktiivselt. Kuna pärast konfluentsuse saavutamist võivad rakud diferentseeruda ja proliferatsioon aeglustuda, on kõige parem subkultiveerida primaarseid rakukultuure enne, kui need saavutavad 100% konfluentsuse.

Subkultuurimine värskes keskkonnas säilitab ankurdumisest sõltuvate rakkude eksponentsiaalse kasvu. Monokultuuride subkultiveerimine häirib rakkude ja rakusiseseid rakupinna koostoimeid. Proteolüütiliste ensüümide, nagu trüpsiin/EDTA, madalaid kontsentratsioone kasutatakse adherentsete primaarsete rakkude eraldamiseks monokihist või kudedest. Pärast dissotsieerimist ja lahjendamist ühe raku lahuseks loetakse rakud ja viiakse uuesti kinnitumiseks ja paljunemiseks üle värsketesse kultuurikonteineritesse.

Krüosäilitamine ja taastamine

Krüokonserveerimine säilitab elusad rakud, külmutades neid madalal temperatuuril. Inimese primaarsete rakkude krüokonserveerimine ja sulatamine hoiab ära rakkude surma ja kahjustused säilitamise ja kasutamise ajal. Inimese primaarsed rakud krüokaitsetakse DMSO või glütserooli abil (õigel temperatuuril ja kontrollitud külmutamiskiirusega). Jääkristallide moodustumise vältimiseks peab külmutamine toimuma järk-järgult, -1 °C minutis. Pikaajaline säilitamine nõuab vedelat lämmastikku (-196 °C) või temperatuuri alla -130 °C.

Külmutatud rakkude sulatamiseks piisab külmutatud rakkude sukeldamisest 37 °C veevanni umbes 1-2 minutiks. Inimese esmaseid rakke ei tohiks pärast sügavkülmast välja sulatamist tsentrifuugida (kuna need on krüosäilitamisest taastamise ajal äärmiselt tundlikud kahjustuste suhtes). See sobib rakkude plaatimiseks kohe pärast sulatamist ja soodustab kultuuride kinnitumist esimese 24 tunni jooksul pärast plaatimist. 1 Pärast seda, kui krüokonserveeritud primaarsed rakud on kinnitunud, tuleb kasutatud keskkond eemaldada (kuna DMSO on primaarsetele rakkudele kahjulik ja võib põhjustada sulatamisjärgse elujõulisuse langust).