Як отримати лентивірусні вектори з використанням клітин HEK293T

Лентивірусні вектори стали важливими інструментами в сучасній молекулярній біології, генній терапії та клітинній інженерії. У компанії Cytion ми оптимізували протоколи для виробництва лентивірусних векторів з високим титром, використовуючи наші клітини преміум-класу HEK293T, які спеціально розроблені для ефективної трансфекції та виробництва вірусів. Ця інструкція ознайомить вас з нашим перевіреним протоколом отримання високоякісних лентивірусних векторів для ваших дослідницьких потреб.

Вступ до лентивірусних векторів та клітин HEK293T

Лентивірусні вектори, отримані з ВІЛ-1, мають ряд переваг для доставки генів, включаючи здатність інтегруватися як в клітини, що діляться, так і в клітини, що не діляться, довготривалу стабільну експресію та відносно велику ємність упаковки. Виробництво цих векторів значною мірою залежить від клітин HEK293T, які експресують великий Т-антиген SV40, що дозволяє здійснювати епісомальну реплікацію плазмід, які містять SV40 походження реплікації. Для оптимального вірусного продукування ми рекомендуємо використовувати клітини HEK293T між пасажами 5-20, оскільки клітини за межами цього діапазону можуть демонструвати знижену ефективність трансфекції та зменшений вихід вірусів.

Злиття клітин: Критичний фактор для успішної трансфекції

Досягнення правильної щільності клітин під час трансфекції має вирішальне значення для успішного виробництва лентивірусів. Ми постійно виявляємо, що щільність злиття клітин HEK293T під час трансфекції повинна становити 70-80%. При такій щільності клітини знаходяться у фазі логарифмічного росту, що оптимізує як ефективність трансфекції, так і подальше вірусне виробництво. Нижчий рівень злиття може призвести до неоптимального виходу, тоді як надмірно злиті культури часто призводять до погіршення здоров'я клітин, зниження ефективності трансфекції та зниження вірусних титрів. Для стандартної чашки діаметром 10 см ми рекомендуємо висівати 5-6 × 10⁶ клітин за 24 години до трансфекції, щоб досягти цієї оптимальної щільності.

Вибір правильного методу трансфекції

Для введення лентивірусних плазмід у клітини HEK293T ми рекомендуємо використовувати метод осадження фосфатом кальцію або метод трансфекції поліетиленіміном (PEI). Обидва підходи довели свою високу ефективність у наших лабораторіях, причому фосфат кальцію є традиційним вибором, а ПЕІ є більш економічно вигідною альтернативою без втрати ефективності. Метод фосфату кальцію відрізняється м'яким впливом на життєздатність клітин, в той час як PEI, як правило, забезпечує дещо вищий рівень трансфекції в наших руках. Для користувачів-початківців ми рекомендуємо починати з методу ПЕІ у співвідношенні ДНК:ПЕІ 1:3, оскільки він, як правило, є більш терпимим до варіацій техніки, але при цьому забезпечує відмінний вихід вірусів.

Оптимальний час для збору векторів

Час збору лентивірусних векторів суттєво впливає як на врожайність, так і на якість. Наше обширне тестування з клітинами HEK293T показує, що підхід з двома зборами максимізує вірусну продукцію. Ми рекомендуємо проводити перший збір через 48 годин після трансфекції, коли вірусне виробництво досягло значного рівня, але до того, як відбудеться значна загибель клітин. Після ретельного збору та заміни середовища, другий збір через 72 години після трансфекції фіксує додаткові вірусні частинки, що утворилися в цей період. Така стратегія послідовного збору зазвичай збільшує загальний вихід на 30-50% порівняно з одноразовим збором, не погіршуючи при цьому якість векторів. Для чутливих до часу застосувань 48-годинний збір зазвичай забезпечує достатній титр для більшості експериментальних потреб.

Очікуваний діапазон титрів та оптимізація виходу

Згідно з нашим оптимізованим протоколом, неконцентровані препарати лентивірусів зазвичай дають титри в діапазоні від¹⁰⁶ до¹⁰⁸ трансдукуючих одиниць на мілілітр (TU/mL), залежно від конкретного вектора переносу і типу клітин-мішеней. Для застосувань, що вимагають більш високих концентрацій, ультрацентрифугування або осадження ПЕГ може збільшити титри в 100-1000 разів. Щоб максимізувати вихід, ми рекомендуємо після трансфекції додати до культурального середовища бутират натрію (10 мМ), який може посилити продукцію вірусу шляхом інгібування гістонових деацетилаз і стимулювання транскрипції з вірусних промоторів. Крім того, зниження температури інкубації до 32-34°C під час фази збору може додатково збільшити врожайність за рахунок уповільнення вірусної деградації при збереженні виробництва. Завдяки цим оптимізаціям наші клітини HEK293T стабільно забезпечують отримання високоякісних вірусних препаратів, придатних навіть для найвимогливіших застосувань.