Високопродуктивні платформи для скринінгу GPCR на основі клітин HEK

G-білок-зв'язані рецептори (GPCR) представляють найбільше сімейство мембранних білків в геномі людини і складають приблизно 34% всіх лікарських мішеней. У Cytion ми розуміємо, що розробка ефективних терапевтичних засобів, спрямованих на GPCR, вимагає надійних скринінгових платформ на основі клітин, здатних точно вимірювати активацію рецепторів у тисячах і мільйонах сполук. Клітини HEK293 виявилися найкращим варіантом для експресії GPCR та функціонального скринінгу, пропонуючи унікальне поєднання ефективної експресії рецепторів, низького ендогенного рецепторного фону та сумісності з різноманітними форматами аналізів.

Основні висновки

• Клітини HEK293 забезпечують ідеальний фон для гетерологічної експресії GPCR з мінімальним втручанням ендогенних рецепторів
• Різноманітні формати аналізів - потік кальцію, цАМФ, рекрутинг β-аррестину - дозволяють проводити всебічне дослідження шляхів експресії
• Автоматизована робота з рідиною та зчитувачі планшетів дозволяють проводити скринінг понад 100 000 сполук на день
• Стабільні стратегії розвитку клітинних ліній забезпечують баланс між вимогами до продуктивності та послідовністю аналізу
• Виявлення упередженого агонізму вимагає мультиплексного зчитування різних сигнальних каскадів

Чому клітини HEK293 ідеально підходять для GPCR-скринінгу

Клітини HEK293 стали де-факто стандартом для функціональних аналізів GPCR завдяки кільком внутрішнім перевагам. По-перше, їх відносно низька ендогенна експресія GPCR зводить до мінімуму фоновий сигнал, який може заплутати дослідження гетерологічних рецепторів. На відміну від деяких ракових клітинних ліній, які експресують численні GPCR на функціонально важливих рівнях, клітини HEK293 забезпечують чисте полотно для експресії рецепторів.

По-друге, клітини HEK293 експресують всі основні підкласи білків G (Gαs, Gαi, Gαq, Gα12/13) на рівнях, достатніх для підтримки різноманітних рецепторних зв'язків. Такий повний сигнальний репертуар дозволяє досліджувати взаємодію нативних рецепторів з G-білками без необхідності коекспресії специфічних субодиниць G-білків.

По-третє, клітини HEK293 ефективно трансформуються з використанням різних класів реагентів, досягаючи рівня трансфекції, що перевищує 90%. Така ефективність призводить до високих рівнів експресії рецепторів - зазвичай від 10⁵ до 10⁶ рецепторів на клітину, забезпечуючи надійні сигнальні вікна навіть для рецепторів зі скромною ефективністю зв'язування.

Наші клітини HEK293T (300189) забезпечують особливо високу ефективність трансфекції для транзиторної експресії GPCR, що робить їх ідеальними для початкової характеристики рецепторів і розробки аналізів перед тим, як перейти до створення стабільних клітинних ліній.

Вибір формату аналізу для скринінгу GPCR

Аналіз потоку кальцію: Gαq-рецептори активують фосфоліпазу С, запускаючи вивільнення кальцію з внутрішньоклітинних запасів. Кальцій-чутливі флуоресцентні барвники, такі як Fluo-4, Fura-2 або генетично закодовані індикатори кальцію, дозволяють вимірювати цю реакцію в режимі реального часу. Флуоресцентні зчитувачі на основі планшетів, такі як FLIPR, можуть одночасно вимірювати перехідні процеси кальцію у всіх 384- або 1536-лункових планшетах, досягаючи продуктивності, що перевищує 100 000 точок даних на день.

cAMP-аналізи: Gαs-рецептори стимулюють аденілілциклазу, збільшуючи внутрішньоклітинний цАМФ, в той час як Gαi-рецептори пригнічують вироблення цАМФ. Для виявлення змін цАМФ використовують різні технології аналізу, включаючи конкурентний імуноферментний аналіз (HTRF, AlphaScreen), біосенсорні підходи (GloSensor) та аналіз репортерних генів (CRE-люцифераза). Кожен з них має чіткі переваги в чутливості, кінетиці та продуктивності.

рекрутинг β-арестину: Активація GPCR запускає рекрутинг β-аррестину до рецептора - процес, який можна виміряти за допомогою аналізу комплементації білків. Такі технології, як PathHunter (комплементація ферментних фрагментів) і NanoBiT (розщеплена люцифераза), забезпечують чутливі, незалежні від шляху зчитування результати, застосовні до всіх класів рецепторів, незалежно від того, яким білкам G надається перевага в зв'язуванні.

Аналізи репортерних генів: Транскрипційні репортерні системи вимірюють наступні сигнальні події, пропонуючи ампліфікацію, що підвищує чутливість. Репортери CRE-люциферази виявляють активацію шляху цАМФ, NFAT-люцифераза реагує на кальцієву сигналізацію, а SRE-люцифераза контролює кілька шляхів. Хоча вони повільніші, ніж прямі вимірювання другого месенджера, репортерні аналізи забезпечують відмінне співвідношення сигналу до фону.

Стратегії створення стабільних клітинних ліній

Високопродуктивні скринінгові кампанії зазвичай вимагають стабільних клітинних ліній, що експресують цільовий GPCR на стабільних рівнях у мільярдах лунок. Розробка стабільних ліній починається з дизайну вектора, що включає як рецептор, так і селективний маркер, що дозволяє збагатити стабільно трансфіковані клітини.

Наші клітини HEK293 (300192 ) слугують стандартною батьківською лінією для створення стабільних клітинних ліній. Після трансфекції та підбору антибіотиків (зазвичай 2-4 тижні) клітини, що вижили, піддаються одноклітинному клонуванню шляхом граничного розведення або флуоресцентно-активованого клітинного сортування (FACS). Потім окремі клони розширюють і характеризують за рівнем експресії рецепторів, величиною функціональної відповіді та стійкістю до аналізу.

Критично важливими атрибутами якості для скринінгу клітинних ліній є стабільність експресії протягом тривалого пасажу, стабільна фармакологія порівняно з референтними стандартами та надійна продуктивність у мініатюрних форматах планшетів. Банки кваліфікованих клітин повинні бути створені на ранній стадії скринінгової кампанії, щоб забезпечити стабільну продуктивність протягом усього процесу.

Для прискорення термінів, наші клітини HEK293 EBNA (300264 ) забезпечують стабільну експресію з епісомних векторів, що потенційно скорочує терміни розробки, зберігаючи при цьому стабільність експресії.

Міркування щодо мініатюризації та автоматизації

Максимізація продуктивності скринінгу вимагає мініатюризації до форматів 384-лункових, 1536-лункових або навіть 3456-лункових планшетів. Клітини HEK293 добре адаптуються до високощільного покриття в зменшених обсягах, хоча для кожного переходу до іншого формату може знадобитися оптимізація щільності клітин, умов покриття та часу інкубації.

Адаптовані до суспензії клітини HEK293 пропонують переваги для автоматизованого скринінгу. Наші клітини HEK293, адаптовані до суспензій (300686), можна дозувати безпосередньо з культуральних посудин в аналітичні планшети без трипсинізації, що скорочує кількість етапів обробки і покращує консистенцію. Сумісність з автоматизованими пристроями для роботи з рідинами дозволяє проводити скринінгові кампанії в режимі "walkaway".

Вимоги до стабільності планшета залежать від формату. Аналізи потоку кальцію зазвичай вимагають вимірювання протягом декількох годин після завантаження барвника, в той час як аналізи цАМФ і β-аррестину можуть допускати інкубацію протягом ночі перед зчитуванням. Розуміння цих обмежень впливає на логістику скринінгу та планування роботи обладнання.

Аналіз даних та ідентифікація результатів

Скринінгові кампанії GPCR генерують масивні набори даних, що вимагають надійних аналітичних конвеєрів. Статистичні параметри, такі як Z'-фактор, відношення сигналу до фону і коефіцієнт варіації, оцінюють якість аналізу для кожної пластини окремо. Пластини, які не досягають порогових значень якості, слід повторювати, а не аналізувати.

Критерії ідентифікації влучень балансують між чутливістю та частотою хибнопозитивних результатів. Пороги активності в 50% активації або інгібування відносно референтних сполук забезпечують розумні відправні точки, хоча оптимальні відсікання залежать від складу бібліотеки і цілей програми. Підтвердження первинних знахідок методом "концентрація-відповідь" виключає артефакти і сполуки, що не відповідають ранжируванню, для подальших досліджень.

Сучасний пошук ліків на основі GPCR все частіше акцентує увагу на агоністичних сполуках, які переважно активують певні сигнальні шляхи порівняно з іншими. Виявлення сполук зі зміщеною агонією вимагає проведення паралельних аналізів, що вимірюють декілька шляхів (наприклад, активацію G-білка проти рекрутингу β-арестину), з ретельною увагою до чутливості та кінетики аналізу, щоб уникнути технічної похибки.

Рекомендовані продукти для скринінгу GPCR:

• Клітини HEK293T (300189 ) - високоефективна транзиторна експресія
• КлітиниHEK293 (300192 ) - стабільна генерація клітинних ліній
• HEK293, адаптовані до суспензії (300686 ) - автоматизовані робочі процеси скринінгу
• Клітини HEK293 EBNA (300264 ) - прискорений розвиток стабільних ліній
• DMEM з високим вмістом глюкози (820300a ) - стандартне живильне середовище