Культура клітин ссавців: Основи та методи
Культура клітин ссавців є наріжним каменем біологічних досліджень, що дозволяє вченим вивчати клітини в контрольованому середовищі поза живими організмами. Цей процес включає виділення клітин з тканин, підтримання їх у ретельно контрольованих умовах і розмноження для різних експериментальних цілей. Культура клітин ссавців має вирішальне значення для розуміння клітинних процесів, механізмів розвитку захворювань і розробки нових методів лікування, в тому числі з використанням безсмертних клітинних ліній
Основні висновки:
- Клітини можна виділити з тканин за допомогою ферментативного розщеплення або методів культури експлантатів
- Первинні клітини мають обмежену тривалість життя, в той час, як іморталізовані клітинні лінії можуть проліферувати нескінченно довго
- Умови культивування, включаючи склад живильного середовища, мають вирішальне значення для виживання та проліферації клітин
- Клітини можна вирощувати в суспензії або у вигляді адгезивних культур, залежно від їх типу та дослідницьких потреб
- Найпоширеніші живильні середовища включають MEM, DMEM і RPMI 1640, кожне з яких призначене для певних типів клітин
- Типові умови росту включають температуру 37°C, 5% CO2 і відносну вологість 95%
- Альтернативні сироватки, такі як лізат тромбоцитів людини (hPL), все частіше використовуються для уникнення потенційних проблем із забрудненням
Методи виділення клітин
Процес створення культури клітин починається з виділення клітин з тканин. Для цього існує кілька методів, кожен з яких підходить для різних типів тканин і цілей дослідження. Для зразків крові виділення клітин є відносно простим, причому лейкоцити є основним об'єктом для культивування через їхню здатність до росту. Тверді тканини вимагають більш складних методів виділення. Один з поширених методів включає ферментативне травлення, коли ферменти, такі як колагеназа, трипсин або проназа, використовуються для розщеплення позаклітинного матриксу, вивільняючи окремі клітини в суспензію. Крім того, дослідники можуть використовувати метод культури експлантатів, коли невеликі шматочки тканини поміщають безпосередньо в живильне середовище, що дозволяє клітинам мігрувати і проліферувати. Вибір між цими методами часто залежить від конкретного типу тканини, бажаної клітинної популяції та мети експерименту. Важливо зазначити, що клітини, виділені безпосередньо з організму, називаються первинними і, за деякими винятками, такими як клітини, отримані з пухлин, зазвичай мають обмежену тривалість життя в культурі, перш ніж зазнають старіння
Основні продукти для культивування клітин ссавців
| Назва продукту | Номер продукту | Категорія | Застосування |
|---|---|---|---|
| ДМЕМ, w: 4,5 г/л Глюкоза, w: 4 мМ L-глутамін, w: 1,5 г/л NaHCO3, w: 1,0 мМ Піруват натрію | 820300a | Поживні середовища | Універсальне середовище для різних типів клітин ссавців |
| DMEM:Ham's F12 (1:1), w: 3,1 г/л Глюкоза, w: 1,6 мМ L-глутамін, w: 15 мМ HEPES, w: 1,0 мМ Піруват натрію, w: 1,2 г/л NaHCO3 | 820400a | Поживні середовища | Підходить для широкого спектру клітин ссавців, особливо епітеліальних клітин |
| RPMI 1640, w: 2,1 мМ стабільного глутаміну, w: 2,0 г/л NaHCO3 | 820700a | Поживні середовища | Зазвичай використовується для лімфоїдних клітин та гібридних клітинних ліній |
| Аккутаза | 830100 | Дисоціація клітин | М'який розчин для відокремлення клітин, що прилипли до поверхні |
| Заморожувальне середовище CM-1 | 800150 | Кріоконсервування | Для заморожування та тривалого зберігання клітин ссавців |
| Заморожувальне середовище CM-ACF, без сироватки | 800650 | Кріоконсервування | Безкомпонентне середовище для заморожування клітин |
| PBS | 860015 | Буферний розчин | Для відмивання клітин та підтримання балансу рН |
| Середовище для росту ендотеліальних клітин | 820731 | Спеціалізоване середовище | Оптимізоване для культивування ендотеліальних клітин |
| Тестування на мікоплазму | 900159 | Контроль якості | Необхідний для виявлення мікоплазмового забруднення в культурах |
| Аутентифікація клітинних ліній - людина | 900154 | Контроль якості | Перевіряє ідентичність клітинних ліній людини |
У цій таблиці представлено перелік основних продуктів для культивування клітин ссавців. Для ознайомлення з повним асортиментом продукції для культивування клітин, включаючи спеціалізовані середовища та реагенти, відвідайте нашу сторінку категорії " Середовища та реагенти ".
- м'яка альтернатива трипсину
Аккутаза
- це розчин для відокремлення клітин, який революціонізує індустрію клітинних культур. Це суміш протеолітичних і колагенолітичних ферментів, яка імітує дію трипсину і колагенази. На відміну від трипсину, Аккутаза не містить жодних ссавців або бактеріальних компонентів і набагато м'якше діє на клітини, що робить її ідеальним рішенням для рутинного відділення клітин від стандартного пластикового посуду для культури тканин і пластикового посуду з адгезивним покриттям. У цій статті ми розповімо про переваги та застосування Accutase, а також про те, як вона змінює правила гри в культурі клітин.
Переваги Accutase
Аккутаза має кілька переваг над традиційними розчинами трипсину. По-перше, її можна використовувати, коли потрібно м'яко та ефективно відокремити будь-яку прилиплу клітинну лінію, що робить її прямою заміною трипсину. По-друге, Аккутаза надзвичайно добре працює на ембріональних і нейронних стовбурових клітинах, і було показано, що вона підтримує життєздатність цих клітин після пасажування. По-третє, Accutase зберігає більшість епітопів для подальшого аналізу методом проточної цитофлуориметрії, що робить її ідеальною для аналізу маркерів клітинної поверхні.
Крім того, Аккутазу не потрібно нейтралізувати при пасажуванні адгезованих клітин. Додавання більшої кількості середовища після поділу клітин розбавляє Accutase, тому вона більше не здатна відокремлювати клітини. Це усуває необхідність в інактивації та економить час для техніків, які працюють з культурами клітин. Нарешті, Аккутазу не потрібно аліквотувати, а флакон стабільно зберігається в холодильнику протягом 2 місяців.
Застосування Аккутази
Аккутаза є прямою заміною розчину трипсину і може використовуватися для пасажування клітинних ліній. Крім того, Аккутаза добре проявляє себе при відділенні клітин для аналізу багатьох маркерів клітинної поверхні за допомогою проточної цитофлуориметрії, а також для сортування клітин. Інші сфери застосування Accutase включають аналіз маркерів клітинної поверхні, аналіз росту вірусів, проліферацію клітин, аналіз міграції пухлинних клітин, рутинне пасажування клітин, масштабування виробництва (біореактор) і проточну цитометрію.
Склад аккутази
Аккутаза не містить компонентів ссавців або бактерій і є природною ферментною сумішшю з протеолітичною та колагенолітичною активністю. Вона має набагато нижчу концентрацію, ніж трипсин і колагеназа, що робить її менш токсичною і м'якшою, але такою ж ефективною.
Ефективність Аккутази
Аккутаза виявилася ефективнішою у відділенні первинних і стовбурових клітин та підтримці високої життєздатності клітин порівняно з ферментами тваринного походження, такими як трипсин. 100% клітин відновлюються через 10 хвилин, і немає ніякої шкоди, якщо залишити клітини в Accutase до 45 хвилин, завдяки автоперетравленню Accutase.
Підсумовуючи
На закінчення, Accutase
- це потужне рішення, яке змінює правила гри в культурі клітин. Завдяки своїй м'якій дії, ефективності та універсальності, Аккутаза є ідеальною альтернативою трипсину. Якщо ви шукаєте надійне та ефективне рішення для відокремлення клітин, Аккутаза
- це рішення для вас.
Фосфатно-буферний розчин (PBS)
- це буферний розчин, який широко використовується в біологічних і хімічних дослідженнях. Він відіграє важливу роль у підтримці балансу рН та осмолярності під час різних експериментальних процедур, включаючи обробку тканин та культивування клітин. Наш буферний розчин PBS ретельно розроблений з використанням високочистих інгредієнтів для забезпечення стабільності та надійності в кожному експерименті. Осмолярність та концентрація іонів нашого PBS наближені до людського організму, що робить його ізотонічним та нетоксичним для більшості клітин.
Склад нашого розчину PBS
Наш розчин PBS
- це відрегульована за рівнем рН суміш фосфатних буферів надвисокої чистоти та фізіологічних розчинів. У 1-кратній робочій концентрації він містить
8000 мг/л хлориду натрію (NaCl)
200 мг/л хлориду калію (KCl)
1150 мг/л фосфат натрію двоосновний безводний (Na2HPO4)
200 мг/л фосфат калію одноосновний безводний (KH2PO4)
Цей склад забезпечує оптимальний рН та іонний баланс, що підходить для широкого спектру біологічних застосувань.
Застосування нашого розчину PBS
Наш розчин PBS ідеально підходить для різних застосувань у біологічних дослідженнях. Його ізотонічні та нетоксичні властивості роблять його придатним для розведення речовин і промивання клітинних контейнерів. Розчини PBS, що містять ЕДТА, ефективні для видалення прикріплених і злиплих клітин. Однак не слід додавати до PBS двовалентні метали, такі як цинк, оскільки це може призвести до випадання осаду. У таких випадках рекомендується використовувати буфери Good's. Крім того, наш розчин PBS є прийнятною альтернативою вірусному транспортному середовищу для транспортування та зберігання РНК-вірусів, включаючи SARS-CoV-2.
Контроль якості
Стерильно відфільтрований
Зберігання та термін придатності
Зберігати при температурі від +2°C до +25°C, в захищеному від світла місці.
Після відкриття зберігати при температурі від 2°C до 25°C і використати протягом 24 місяців.
Умови транспортування
Температура навколишнього середовища
Обслуговування
Зберігати в холодильнику при температурі від +2°C до +8°C у темряві. Уникайте заморожування та частого нагрівання до +37°C, оскільки це знижує якість продукту.
Не нагрівайте середовище вище 37°C і не використовуйте неконтрольовані джерела тепла, такі як мікрохвильові печі.
Якщо потрібно використати лише частину засобу, відберіть необхідну кількість і підігрійте його до кімнатної температури перед застосуванням.
Склад
Категорія
Компоненти
Концентрація (мг/л)
Солі
Калій хлористий
200
Калій фосфат одноосновний безводний
200
Натрій хлористий
8000
Натрій фосфат двоосновний безводний
1150
- це невеликі прокаріотичні організми, які занадто малі, щоб бути видимими під мікроскопом, і не можуть бути знищені звичайними антибіотичними реагентами. Мікоплазми можуть впливати на клітинний ріст, проліферацію і морфологію клітинних ліній, що може призвести до недостовірних результатів експериментів. Приблизно від 15 до 35% лабораторних клітинних культур заражені мікоплазмами. Тому рекомендується проводити частий контроль, щоб гарантувати відсутність мікоплазми в середовищі.
Метод аналізу
CLS пропонує як короткострокове, так і довгострокове тестування для виявлення мікоплазми. У першому випадку зразки тестуються одразу після надходження, тоді як у другому випадку ініціюється культура клітин і клітини тестуються через 14 днів культивування без антибіотиків. Тестування на мікоплазму проводиться за допомогою двоточкової системи виявлення за допомогою набору PlasmoTest™
- Mycoplasma Detection Kit (Invivogen) і Certus QC
- mycoADVANCED detection kit (Certus).
Зразки
Для проведення експрес-тесту, будь ласка, надайте мінімум 50 мкл клітинної суспензії, що містить 50 000 клітин. Клітинна суспензія може бути відправлена при температурі навколишнього середовища.
Для преміум-тесту, будь ласка, надайте мінімум 1 мільйон клітин у відповідному середовищі для заморожування, щоб забезпечити міцну і здорову культуру для культивування і подальшого тестування клітин. Будь ласка, відправляйте зразки на сухому льоду.
Будь ласка, заповніть форму зразка для тестування на мікоплазму і додайте її до відправки зразка.
Колориметричний репортерний аналіз
Цей тест є колориметричним аналізом на основі клітин. У присутності мікоплазми репортерна лінія клітин індукує сигнальний каскад, що викликає зміну кольору середовища з червоного на синій. Аналіз проводять у 96-лункових багатокамерних планшетах. Сигнали детектуються в мікропланшетному спектрофотометрі при 620-655 нм. Виявляються всі види мікоплазм і ахолеплазм, а також інші забруднювачі в культурі клітин, такі як бактерії.
Ізотермічна ампліфікація
Ізотермічна ампліфікація
- це швидкий і надійний тест, заснований на ізотермічній ампліфікації мікоплазмової ДНК в поєднанні з детекцією в реальному часі за допомогою ДНК-інтеркалюючого барвника. Тест здатний виявляти шість найпоширеніших видів мікоплазм, на які припадає понад 95% забруднень: M.orale, M.hyorhinis, M.arginini, M.fermentans, M.hominis та A.laidlawii. Завдяки гомології послідовностей будуть виявлені й інші види мікоплазм (M.pneumoniae, M.gallisepticum та M.synoviae). Щоб визначити, чи є зразок мікоплазмою позитивним або негативним, вивчають температуру плавлення (Tm).
Висновок: Ключова роль культури клітин ссавців у сучасних дослідженнях
Культура клітин ссавців зробила революцію в біологічних і медичних дослідженнях, надавши вченим потужні інструменти для вивчення складних клітинних процесів, механізмів захворювань і потенційних терапевтичних втручань. Від виділення первинних клітин до створення імморталізованих клітинних ліній - цей метод став невід'ємною частиною сучасного наукового інструментарію
Подорож культури клітин ссавців починається з ретельних методів ізоляції, проходить через ретельне підтримання клітин у спеціалізованих середовищах і завершується широким спектром застосувань у різних галузях науки. Будь то дослідження раку, розробка ліків або фундаментальна клітинна біологія, можливість вирощувати і маніпулювати клітинами ссавців in vitro відкрила безпрецедентні шляхи для наукових досліджень
Ключем до успіху культури клітин ссавців є ретельно контрольовані умови, в яких вони утримуються. Від складу поживних середовищ до точних параметрів навколишнього середовища в інкубаторах - кожен аспект оптимізовано так, щоб максимально наблизити клітини до природних умов існування. Така увага до деталей забезпечує надійність і відтворюваність експериментів, що є наріжним каменем належної наукової практики
Розвиток імморталізованих клітинних ліній, таких як широко використовувані клітини HeLa, ще більше розширив можливості клітинної культури. Ці клітинні лінії забезпечують стабільні, легкодоступні клітинні моделі, які прискорили дослідження в багатьох дисциплінах
Зазираючи в майбутнє, культура клітин ссавців продовжує розвиватися. Досягнення в техніці 3D-культивування, розробка органоїдів та використання хімічно визначених середовищ розширюють межі можливого в культурі клітин. Ці розробки обіцяють ще більше наблизити моделі in vitro до складності систем in vivo, що потенційно може зробити революцію у створенні ліків, персоналізованої медицини та нашому розумінні біології людини
На завершення, культура клітин ссавців залишається динамічним і важливим методом у медико-біологічних дослідженнях. Її подальше вдосконалення та застосування, безсумнівно, відіграватиме вирішальну роль у вирішенні деяких з найбільш актуальних питань біології та медицини, стимулюючи науковий прогрес на довгі роки вперед