Культура циркулюючих пухлинних клітин (ЦПК): Виклики та нові рішення

Циркулюючі пухлинні клітини - це рідкісна популяція ракових клітин, які відокремилися від первинних пухлин або метастатичних ділянок і потрапили в кровотік, слугуючи одночасно медіаторами метастазування і потенційними джерелами інформації про пухлину в режимі реального часу. У компанії Cytion ми розуміємо, що успішне культивування ПСК може зробити революцію в персоналізованій онкологічній медицині, уможлививши функціональне тестування ліків, геномну характеристику та механістичні дослідження з використанням власних пухлинних клітин пацієнта, отриманих за допомогою мінімально інвазивного забору крові. Однак, культивування КТК пов'язане з надзвичайними технічними труднощами: ці клітини надзвичайно рідкісні (часто менше 10 клітин на мілілітр крові серед мільярдів нормальних клітин крові), дуже гетерогенні, крихкі і схильні до втрат під час виділення та культивування. Незважаючи на ці перешкоди, нещодавні технологічні досягнення роблять культивування ЦТК все більш можливим, відкриваючи нові шляхи для прецизійної онкології.

Біологія та клінічне значення ЦТК

ЦТК потрапляють в кровообіг як з первинних пухлин, так і з метастатичних уражень, причому їх наявність корелює з прогресуванням захворювання і прогнозом для багатьох типів раку. Ці клітини стикаються з несприятливим середовищем - напругою зсуву в кровотоці, імунним контролем, відсутністю прикріплення до матриксу - і більшість з них швидко гине. Рідкісні ЦТК, які виживають, мають властивості, що сприяють метастатичному потенціалу: стійкість до аноікісу (загибелі клітин, спричиненої відшаруванням), здатність виживати в підвішеному стані, здатність до екстравазації та колонізації віддалених органів. Культивування КТК забезпечило б безпрецедентний доступ до цих метастатичних попередників, уможлививши функціональну характеристику, яку не може виявити лише геномний аналіз. Однак їх дефіцит і крихкість роблять культивування ПСК однією з найбільш технічно складних процедур у клітинній біології.

Технології ізоляції: Перший важливий крок

Перш ніж культивувати ПСК, їх необхідно відокремити від величезного надлишку нормальних клітин крові. Фізичні методи відокремлення використовують різницю в розмірах (ЦТК, як правило, більші за клітини крові) за допомогою фільтрації або мікрофлюїдних пристроїв. Імуноафінні підходи вловлюють ЦТК, що експресують епітеліальні маркери, такі як EpCAM, за допомогою поверхонь, покритих антитілами, або магнітних кульок. Однак ці методи мають обмеження: не всі CTC є великими або експресують EpCAM, особливо ті, що проходять епітеліально-мезенхімальний перехід (ЕМТ). Негативне виснаження видаляє клітини крові, залишаючи ПСК недоторканими, хоча чистота залишається проблематичною. Ідеальний метод виділення культури повинен бути м'яким, щоб зберегти життєздатність і водночас досягти достатнього збагачення і чистоти, щоб запобігти надмірному розмноженню клітин крові.

Проблема Аноікіса

Адгезивні клітини зазвичай потребують прикріплення до позаклітинного матриксу для виживання; коли вони відокремлюються, вони піддаються аноікісу - формі запрограмованої клітинної смерті. Циркулюючі ЦТК повинні подолати аноікіс, щоб вижити, але навіть ці витривалі клітини зазнають значного стресу під час ізоляції та переходу в культуру. Стратегії боротьби з аноікісом включають негайне нанесення на поверхні з матричним покриттям, культивування в тривимірних матрицях, які забезпечують структурну підтримку, додавання факторів виживання, таких як інсуліноподібний фактор росту або EGF, або спільне культивування з підтримуючими клітинами-фідерами, які забезпечують сигнали виживання. Критичні перші 24-48 годин після ізоляції визначають, чи адаптуються ПСК до умов культивування, чи піддадуться загибелі, спричиненій відшаруванням.

Ініціювання проліферації з рідкісних клітин

Навіть якщо ЦТК виживають в умовах ізоляції, ініціювання проліферації з дуже малої кількості клітин представляє унікальні виклики. Стандартна культура клітин часто покладається на паракринні сигнали між клітинами, але коли присутні лише кілька ЦТК, цих сигналів недостатньо. Кондиційоване середовище з відомих ракових клітинних ліній або нормальних клітин і клітинних ліній може забезпечити необхідні фактори. Шари клітин із зупиненим ростом постачають паракринні сигнали, не конкуруючи за ресурси. Масиви мікролунок обмежують окремі ПТК в невеликих об'ємах, де секретовані фактори досягають ефективних концентрацій. Спеціалізовані склади середовищ, оптимізовані для культивування в умовах низької щільності, містять підвищені концентрації факторів росту та додаткові добавки, що підтримують клітини, які перебувають у стресовому стані. Метою є створення мікросередовища, яке долає обмеження екстремально низької щільності.

Підходи до тривимірного культивування

тривимірні системи культивування демонструють особливу перспективність для експансії ПТК. Вбудовування ПТК в матригель, колаген або синтетичні гідрогелі забезпечує точки прикріплення до матриці, які запобігають аномаліям, забезпечуючи при цьому тривимірну організацію. Методи органоїдної культури, які довели свою ефективність для нормальних тканин і первинних пухлин, також можуть підтримувати ріст ПСК, при цьому окремі ПСК формують невеликі пухлиноподібні структури. Ці 3D-культури можуть краще зберігати фенотипи ПТК, ніж традиційні моношари, завдяки збереженню клітинної архітектури та сигнальних контекстів, більш подібних до пухлин in vivo. Деякі системи поєднують 3D-культуру з мікрофлюїдною перфузією для забезпечення доставки поживних речовин і видалення відходів, створюючи мініатюрні пухлинні мікросередовища, які підтримують довготривале культивування ЦТК.

Системи з фідерними клітинами

Спільне культивування з фідерними клітинами представляє ще одну стратегію для експансії ПТК. Опромінені або оброблені мітоміцином фібробласти, ендотеліальні клітини або навіть асоційовані з раком фібробласти забезпечують фактори росту, матричні білки і метаболічну підтримку, не проліферуючи самі. Однак фідерні системи вносять складність: розрізнення ЦТК від фідерів вимагає ретельного відстеження, можливо, за допомогою флуоресцентного маркування або чіткої морфології. Зрештою, ПТК повинні бути відокремлені від фідерів або за допомогою селективних середовищ, або за допомогою диференціальної трипсинізації, або за допомогою імуномагнітного сортування. Незважаючи на ці труднощі, фідерні системи дозволили досягти таких показників успішності вирощування культури ЦТК, яких було б важко досягти в умовах без фідерів, особливо під час критичної фази ранньої експансії.

Вирішення проблеми гетерогенності за допомогою клональної культури

Популяції ЦТК, як відомо, є гетерогенними, оскільки містять клітини з різним метастатичним потенціалом, чутливістю до лікарських препаратів і проліферативною здатністю. Об'ємне культивування змішаних популяцій може призвести до домінування швидкозростаючих клонів, втрачаючи різноманітність, яка робить ЦТК клінічно інформативними. Ізоляція однієї клітини з подальшою клональною експансією зберігає цю гетерогенність, дозволяючи охарактеризувати окремі субпопуляції ЦТК. Мікроманіпуляції, флуоресцентно-активоване сортування клітин (FACS) або мікрофлуоресцентне дозування одноклітинного матеріалу можуть ізолювати окремі ЦТК в окремі лунки. Хоча цей підхід є технічно складним і вимагає терпіння, оскільки окремі клітини повільно утворюють клони, він дозволяє виявити справжню різноманітність у популяції ПСК пацієнта та ідентифікувати субпопуляції з відмінними функціональними властивостями.

Оптимізація середовища для росту ЦТК

Універсального живильного середовища для культивування ПСК не існує, оскільки ПСК різних типів раку та пацієнтів мають різні вимоги. Багато груп починають з середовищ, оптимізованих для вже існуючих ракових клітинних ліній подібного походження (наприклад, RPMI для ПСК раку молочної залози, DMEM для ПСК раку легенів), а потім додають додаткові фактори росту, включаючи EGF, FGF, інсулін та інші. Деякі протоколи додають компоненти середовища стовбурових клітин, такі як добавки B27 або N2, припускаючи, що ХТК зі стовбуровими властивостями можуть потребувати подібної підтримки. Концентрація сироватки є ще однією змінною: деякі протоколи використовують високий вміст сироватки (15-20%) для максимальної підтримки росту, в той час як інші використовують певні безсироваткові склади для кращого контролю. Може знадобитися емпірична оптимізація для кожного зразка пацієнта, хоча це складно, враховуючи обмеженість вихідного матеріалу.

Моніторинг та визначення характеристик під час експансії

У міру розмноження культур ЦТК постійний моніторинг гарантує, що культивовані клітини зберігають характеристики ЦТК і не обростають забруднюючими речовинами. Імуноферментний аналіз на епітеліальні маркери (цитокератини, EpCAM), ракові маркери, що відповідають типу пухлини (ER/PR для молочної залози, PSA для передміхурової залози), та відсутність лейкоцитарних маркерів (CD45) підтверджує ідентичність. Генетична характеристика за допомогою профілювання коротких тандемних повторів (STR), каріотипування або цільового секвенування підтверджує, що культивовані клітини відповідають генотипу пухлини пацієнта. Функціональні аналізи, що оцінюють пухлиногенні властивості, реакцію на лікування або здатність до інвазії, демонструють, що культивовані ПТК зберігають біологічно значущі фенотипи. Ця постійна характеристика має важливе значення з огляду на високі ставки при прийнятті клінічних рішень, заснованих на культурах ЦТК.

Показники успішності та прогностичні фактори

Частота успішних результатів культурального дослідження залишається низькою, як правило, 1-10% спроб, хоча цей показник широко варіює залежно від типу раку, стадії захворювання та методології. Метастатичні пацієнти з високими показниками КТК демонструють кращі результати, ніж пацієнти з низькими показниками КТК. Певні типи раку краще піддаються культивуванню - рак молочної залози, простати і дрібноклітинний рак легенів культивують частіше, ніж інші. Технічні фактори також мають значення: більш щадні методи виділення, швидка обробка, оптимізовані умови культивування та досвідчені оператори покращують результати. З розвитком галузі та стандартизацією методів, показники успішності повинні покращитися, але культивування ХТК, ймовірно, залишатиметься складним завданням, враховуючи притаманний цим клітинам стресовий стан.

Моделі експлантатів, отриманих з ПТК

Альтернативою традиційній культурі in vitro є моделі експлантатів, отриманих з ЦТК (CDX), в яких ЦТК вводять мишам з ослабленим імунітетом для експансії in vivo. Мікросередовище тварин забезпечує фактори росту, матрикс і тривимірну архітектуру, які можуть краще сприяти виживанню ХТК, ніж штучні умови культивування. Після формування пухлин у мишей їх можна збирати і повторно культивувати in vitro або серійно перещеплювати тваринам. Хоча цей підхід дозволяє обійти деякі проблеми культивування, він створює інші: витрати, час, вимоги до умов утримання тварин і потенційний селекційний тиск з боку мишачого середовища, який може змінити властивості ЦТК. Тим не менш, моделі CDX виявилися цінними, коли пряме культивування не вдається, забезпечуючи розширюваний матеріал для подальших застосувань.

Застосування в прецизійній онкології

Кінцевою метою культури ЦТК є створення можливостей для застосування в прецизійній медицині. Функціональне тестування лікарських засобів на культивованих ЦТК пацієнта може допомогти у виборі лікування, визначенні ефективних методів терапії та уникненні марного токсичного лікування. Оскільки КТК представляють біологію пухлини в реальному часі, вони можуть краще відображати поточну чутливість до лікарських засобів, ніж архівні зразки первинних пухлин, отримані роками раніше. Механістичні дослідження культивованих ЦТК можуть виявити механізми резистентності, метастатичні властивості та нові терапевтичні мішені. Біобанкінг культур, отриманих з ЦТК, створює сховища моделей раку, що відповідають пацієнтам, для досліджень. Однак реалізація цих застосувань вимагає подолання існуючих технічних обмежень і підтвердження того, що культивовані ЦТК точно відображають захворювання пацієнта.

Мікрофлюїдні платформи для культивування ЦТК

Мікрофлюїдні пристрої пропонують унікальні переваги для культивування ЦТК, забезпечуючи точний контроль над мікросередовищем у масштабах, що відповідають окремим клітинам або невеликим кластерам. Ці платформи можуть створювати градієнти поживних речовин, забезпечувати точні концентрації факторів, підтримувати ламінарний потік для безперервного обміну поживними речовинами і включати біосенсори для моніторингу в реальному часі. Деякі пристрої інтегрують функції захоплення і культивування в єдину систему, мінімізуючи втрату клітин під час перенесення. Пристрої, сумісні з візуалізацією, дозволяють безперервно спостерігати за поведінкою, проліферацією і морфологією ЦТК. Хоча мікрофлюїдні підходи є дуже перспективними, вони потребують спеціалізованого обладнання та досвіду, що обмежує їх широке застосування. В міру того, як ці технології розвиватимуться і стануть більш доступними, вони можуть стати стандартними інструментами для культивування ХТК.

Контроль якості та запобігання забрудненню

Враховуючи надзвичайну рідкість ЦТК, забруднення клітинами крові або іншими типами клітин може легко переважати над культурами. Сувора стерильність техніки є дуже важливою, так само як і раннє виявлення забруднення. Регулярне мікроскопічне дослідження дозволяє виявити морфологічно відмінні забруднення. Проточна цитофлуориметрія або імунофарбування на лінійні маркери (CD45 для лейкоцитів, CD31 для ендотеліальних клітин) дозволяє виявити неепітеліальні клітини. Якщо забруднення виявлено на ранній стадії, селективні середовища або імуномагнітне виснаження можуть врятувати культуру. Профілактика краща за лікування: імунне виснаження клітин крові перед культивуванням, селективні середовища і клональне очищення шляхом ізоляції однієї клітини - все це знижує ризик контамінації. Ці суворі заходи якості додають складності, але є необхідними з огляду на цінність зразків ЦТК.

Роль стандартизованих клітинних ліній

У той час як культура ЦТК фокусується на зразках пацієнта, стандартизовані клітини і клітинні лінії Cytion відіграють важливу допоміжну роль. Встановлені лінії раку слугують позитивним контролем для технологій виділення, дозволяючи валідацію та оптимізацію перед застосуванням методів до цінних зразків пацієнта. Вони забезпечують кондиціоноване середовище для підтримання культури ЦТК. Змішані зі зразками крові, вони створюють штучні зразки з високим вмістом ЦТК для розробки методів і навчання. Деякі дослідники використовують встановлені лінії як сурогатні моделі для тестування умов культивування або складів середовищ, які можуть бути корисними для реальних ЦТК. Не замінюючи отримані від пацієнта ЦТК, ці стандартизовані інструменти прискорюють розробку методів і забезпечують контроль якості протягом усього робочого процесу.

Нові технології та майбутні напрямки

Кілька нових підходів можуть покращити успіх культури ПТК. Системи "орган-на-чіпі", що включають кілька типів клітин, більш повно моделюють мікрооточення пухлини. Біореактори з контрольованою перфузією підтримують довготривале культивування невеликої кількості клітин. Удосконалені біоматеріали з регульованими механічними та біохімічними властивостями оптимізують фізичне середовище для культивування. Аналіз параметрів ранньої культури за допомогою машинного навчання може передбачити успішне розширення, дозволяючи зосередити ресурси на перспективних зразках. Визначення характеристик одноклітинних мультипопуляцій перед культивуванням може дозволити відібрати клітини, які, найімовірніше, будуть рости. Інженерія на основі CRISPR може підвищити виживаність ЦТК без шкоди для клінічної значущості. По мірі того, як ці технології зближуються, культивування ПТК має стати більш рутинним, нарешті, виконавши свою обіцянку для прецизійної онкологічної медицини.