Metabolično inženirstvo HEK293 za izboljšano glikozilacijo beljakovin

Glikozilacija je ena od najbolj kritičnih posttranslacijskih modifikacij, ki vplivajo na učinkovitost, stabilnost in imunogenost terapevtskih beljakovin. V družbi Cytion se zavedamo, da je za proizvodnjo rekombinantnih proteinov z optimalnimi glikanskimi profili potrebno prefinjeno razumevanje celične presnove in glikozilacijskega mehanizma. Celice HEK293 ponujajo edinstveno ugodno platformo za proizvodnjo glikoproteinov, saj njihovo človeško poreklo zagotavlja nativno podobne vzorce glikozilacije, ki natančno odražajo endogene človeške beljakovine - ključna prednost v primerjavi s sistemi za izražanje, ki niso človeški.

Ključne ugotovitve

• Celice HEK293 proizvajajo človeku primerne glikanske strukture, ki so boljše od celic CHO za nekatere terapevtske izdelke
• Dodajanje nukleotidnih sladkornih prekurzorjev neposredno poveča zasedenost mesta glikozilacije
• Pogoji gojenja, vključno s temperaturo, pH in raztopljenim kisikom, močno vplivajo na profile glikanov
• Pristopi genskega inženiringa omogočajo prilagajanje glikanskih struktur za posebne terapevtske aplikacije
• Strategije analitične karakterizacije so bistvene za oceno kakovosti glikoproteinov

Prednost celic HEK293 glede glikozilacije

Celice humanih embrionalnih ledvic 293 imajo posebne sposobnosti glikozilacije, ki jih razlikujejo od drugih sesalskih ekspresijskih sistemov. Za razliko od celic CHO (Chinese Hamster Ovary), ki proizvajajo izključno α2,3-vezane sialne kisline, celice HEK293 izražajo tako α2,3- kot α2,6-sialiltransferaze, pri čemer nastajajo glikanske strukture, ki bolj spominjajo na naravne človeške glikoproteine.

Ta razlika ima pomembne terapevtske posledice. Številni človeški serumski glikoproteini, vključno z imunoglobulini in faktorji koagulacije, vsebujejo precejšen delež sialne kisline, vezane na α2,6. Terapevtski proteini, proizvedeni v celicah HEK293, imajo zato lahko boljše farmakokinetične profile in manjšo imunogenost v primerjavi s svojimi kolegi, proizvedenimi v CHO.

Naše celice HEK293 (300192 ) so odlično izhodišče za proizvodnjo glikoproteinov, saj imajo robustne rastne lastnosti, obenem pa ohranjajo avtohtone mehanizme glikozilacije. Za aplikacije, ki zahtevajo večjo učinkovitost transfekcije, naše celice HEK293T (300189) omogočajo hitre študije izražanja.

Metabolizem nukleotidnih sladkorjev in inženiring predhodnikov

Učinkovitost glikozilacije je bistveno odvisna od razpoložljivosti donorjev nukleotidnih sladkorjev v endoplazemskem retikulumu in Golgijevem aparatu. Te aktivirane sladkorne molekule - vključno z UDP-glukozo, UDP-galaktozo, UDP-N-acetilglukozaminom, GDP-manozo, GDP-fukozo in CMP-sialno kislino - služijo kot substrati za glikoziltransferaze, ki gradijo glikanske verige.

Pristopi presnovnega inženiringa lahko povečajo bazene nukleotidnih sladkorjev z več mehanizmi. Neposredno dopolnjevanje gojišč z monosaharidi, kot so galaktoza, manoza ali N-acetilmanozamin (ManNAc), zagotavlja substrate reševalne poti, ki jih lahko celice pretvorijo v ustrezne nukleotidne sladkorje. Dokazano je bilo, da dodajanje 10-40 mM ManNAc znatno poveča stopnjo sialilacije v različnih celičnih linijah.

Genetski pristopi ponujajo trajnejše rešitve. Prekomerna ekspresija ključnih encimov v biosintetičnih poteh nukleotidnih sladkorjev - vključno s sintezo CMP-sialne kisline, UDP-glukozno pirofosforilazo ali GDP-manozno pirofosforilazo - lahko trajno poveča bazene prekurzorjev, ne da bi bilo treba dodajati medij.

Optimizacija pogojev gojenja za kakovost glikanov

Okoljski parametri močno vplivajo na rezultate glikozilacije, pri čemer se po vplivu na profile glikanov pogosto kosajo z genetskimi spremembami. Znižanje temperature s 37 °C na 32-34 °C med proizvodno fazo dosledno povečuje sialilacijo, verjetno zaradi kombinacije podaljšanega časa zadrževanja proteinov v Golgijevih celicah in zmanjšane aktivnosti sialidaze.

PH kulture vpliva na aktivnost glikoziltransferaze in stabilnost glikanov. Vzdrževanje pH med 6,8 in 7,2 na splošno podpira optimalno glikozilacijo, čeprav se lahko specifični optimum razlikuje glede na ciljni protein in želeni profil glikana. Vrednosti pH pod 6,5 lahko spodbujajo cepitev sialne kisline, kar zmanjšuje končno sialilacijo.

Ravni raztopljenega kisika vplivajo na celično presnovo in posledično na glikozilacijo. Medtem ko lahko hipoksični pogoji (pod 20 % nasičenosti zraka) oslabijo rast in produktivnost celic, zmerne ravni kisika (30-50 % nasičenosti zraka) običajno podpirajo močno glikozilacijo. V hiperoksičnih razmerah lahko nastajajo reaktivne kisikove vrste, ki poškodujejo glikoproteine ali ovirajo mehanizme glikozilacije.

Naše gojišče DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a ) je odlična osnovna formulacija za proizvodnjo glikoproteinov, saj ponuja uravnoteženo sestavo hranil, ki podpira rast celic in posttranslacijsko obdelavo.

Genski inženiring za prilagojeno glikozilacijo

Sodobna orodja za genski inženiring omogočajo natančno spreminjanje sposobnosti glikozilacije HEK293 za proizvodnjo proteinov s prilagojenimi glikanskimi strukturami. Tehnologija CRISPR/Cas9 je povzročila revolucijo na tem področju, saj omogoča učinkovito izločanje določenih glikoziltransferaz ali uvajanje novih encimskih aktivnosti.

Afukozilirana protitelesa predstavljajo pomembno aplikacijo glikoinženiringa. Izločitev gena FUT8, ki kodira α1,6-fukoziltransferazo, odpravi fukozilacijo jedra N-glikanov. Afukozilirana protitelesa kažejo dramatično izboljšano od protiteles odvisno celično citotoksičnost (ADCC), kar je zaželena lastnost za onkološke terapije.

Nasprotno pa lahko prekomerna ekspresija glikoziltransferaz poveča specifične modifikacije. Z uvedbo β1,4-N-acetilglukozaminiltransferaze III (GnT-III) nastanejo protitelesa z razcepljenim N-acetilglukozaminom, kar je še ena modifikacija, povezana z izboljšano efektorsko funkcijo. Prekomerna ekspresija galaktoziltransferaz in sialiiltransferaz poveča terminalno zapiranje glikanov, kar lahko izboljša razpolovno dobo v serumu.

Za uporabo v suspenzijskih kulturah, ki podpirajo proizvodnjo glikoproteinov v velikem obsegu, lahko naše celice HEK293, prilagojene za suspenzijo (300686 ), še dodatno prilagodimo, da vključijo želene modifikacije glikozilacije.

Analitične strategije za oceno glikozilacije

Celovita karakterizacija glikanov zahteva več komplementarnih analitičnih pristopov. Analiza sproščenih glikanov z uporabo tekočinske kromatografije s hidrofilno interakcijo (HILIC) s fluorescenčno detekcijo omogoča podrobno profiliranje glikanov z odlično občutljivostjo. Masna spektrometrija dodaja strukturno potrditev in omogoča identifikacijo nepričakovanih modifikacij.

Analiza glikozilacije, specifične za posamezno mesto, obravnava heterogenost, ki je značilna za glikoproteine. Kartiranje glikopeptidov z uporabo LC-MS/MS razkriva zasedenost posameznih mest glikozilacije in glikanske strukture na vsakem mestu. Te informacije se izkažejo za ključne za razumevanje odnosov med strukturo in funkcijo ter zagotavljanje skladnosti med posameznimi serijami.

Hitre presejalne metode podpirajo razvoj procesov in nadzor kakovosti. Preskusi na osnovi lektinov, kapilarna elektroforeza in glikan-specifična protitelesa omogočajo visoko zmogljivo oceno ključnih lastnosti glikanov, ne da bi bila potrebna obsežna priprava vzorcev.

Priporočeni izdelki za proizvodnjo glikoproteinov:

• HEK293 Cells (300192) - Nativni človeški vzorci glikozilacije
• Celice HEK293T (300189) - visoka učinkovitost transfekcije za hitre študije
• HEK293, prilagojene suspenziji (300686) - razširljiva proizvodna platforma
• DMEM:Ham's F12 (1:1) (820400a ) - optimizirano za proizvodnjo glikoproteinov