Kriokonzervacija fluorescenčnih celic

Pri ohranjanju fluorescenčnih celic je treba skrbno preučiti postopek kriokonzervacije in ohranjanje stabilnosti fluorescenčnega proteina. V družbi Cytion smo razvili optimizirane protokole, ki zagotavljajo, da vaše fluorescenčno označene celice po odtajanju ohranijo tako vitalnost kot intenzivnost fluorescence.

Stabilnost fluorescenčnih proteinov med kriokonzervacijo

Fluorescenčni proteini, zlasti GFP in njegove različice, so med ustreznimi postopki kriokonzervacije izjemno stabilni. Naše raziskave v podjetju Cytion, zlasti s celičnimi linijami, kot sta HK EGFP-alfa-tubulin/H2B-mCherry Cells in HK EGFP-H2B Cells, kažejo, da fluorescenčni proteini ohranijo svojo strukturno celovitost, ko so zamrznjeni pod optimalnimi pogoji. Ključ do uspešne konzervacije je v uporabi ustreznih krioprotektantov in upoštevanju standardiziranih protokolov. Priporočamo uporabo zamrzovalnega medija CM-1, ki je bil posebej oblikovan za zaščito celičnih struktur in ohranjanje stabilnosti beljakovin med postopkom zamrzovanja. Ob uporabi ustreznih tehnik krioprezervacije izražanje fluorescenčnih beljakovin po odmrznitvi običajno ostane nad 90 % ravni pred zamrznitvijo.

Pomen sestave medija za zamrzovanje za ohranjanje fluorescence

Sestava medija za zamrzovanje ima ključno vlogo pri ohranjanju vitalnosti celic in intenzivnosti fluorescence. V podjetju Cytion smo razvili specializirana sredstva za kriokonzervacijo, ki obravnavajo edinstvene izzive pri ohranjanju fluorescenčnih celic. Naš medij za zamrzovanje CM-ACF, brez seruma, je bil posebej optimiziran za zaščito fluorescenčnih beljakovin med postopkom zamrzovanja. Za občutljive fluorescenčne celične linije, kot so celice HK EGFP-Cap-D2, priporočamo uporabo našega medija za zamrzovanje CM-1 - 100 ml, ki vsebuje optimizirane koncentracije krioprotektantov, ki preprečujejo nastajanje ledenih kristalov in hkrati ohranjajo stabilnost fluorofora. Uravnotežena osmolarnost medija in zaščitna sredstva zagotavljajo, da fluorescenčni proteini med postopkom zamrzovanja in odmrzovanja ohranijo svojo prvotno konformacijo, zaradi česar so fluorescenčni signali po odmrzovanju konsistentni.

Zamrzovanje z nadzorovano hitrostjo: Bistvenega pomena za ohranjanje fluorescence

Zamrzovanje z nadzorovano hitrostjo je ključnega pomena za ohranjanje celovitosti fluorescenčnih beljakovin med kriokonzervacijo. Naše raziskave v podjetju Cytion s fluorescenčnimi celičnimi linijami, kot so celice NRK-EGFP-H2B in U2OS-CRISPR-NUP96-SNAP, klon št. 33, kažejo, da je hitrost ohlajanja -1 °C na minuto optimalna za ohranitev intenzivnosti fluorescence. Ta nadzorovani pristop v kombinaciji z našim zamrzovalnim medijem CM-ACF - brez seruma - 100 ml zmanjšuje nastajanje škodljivih ledenih kristalov, ki lahko vplivajo na strukturo beljakovin. Priporočamo uporabo posode za zamrzovanje z izopropanolom ali programirljivega zamrzovalnika, da bi dosegli dosledno hitrost hlajenja. Ta metoda se je izkazala za posebno učinkovito pri ohranjanju kompleksnih konfiguracij fluorescenčnih beljakovin, kot so tiste v naših celicah HK EGFP-LaminA/H2B-mCherry.

Posebni vidiki ravnanja s celicami, ki izražajo GFP in RFP

Različni fluorescenčni proteini zahtevajo posebne pristope ravnanja za optimalno ohranitev. Po naših izkušnjah v podjetju Cytion s celicami, kot so celice HK EGFP-LaminB1/H2B-mCherry, so različice GFP med kriokonzervacijo bolj stabilne kot različice RFP. Za celice, ki izražajo GFP, priporočamo uporabo našega zamrzovalnega medija CM-ACF - brez seruma - 100 ml, ki zagotavlja boljšo zaščito fluoroforne strukture. Celice, ki izražajo RFP, kot so naše celice HK-CRISPR-Pom121-mCherry #32, imajo koristi od dodajanja antioksidantov v zamrzovalno gojišče, da se prepreči razgradnja fluorofora. Ključne razlike pri ravnanju vključujejo:

• Celice, ki izražajo GFP: Standardna hitrost hlajenja (-1 °C/min) z gojiščem brez seruma
• Celice, ki izražajo RFP: Nekoliko hitrejše hlajenje (-1,5 °C/min) z gojiščem, dopolnjenim z antioksidanti
• Obe vrsti: Med ravnanjem sta minimalno izpostavljeni svetlobi
• Zaščita pred nihanjem pH med postopkom zamrzovanja

Obdobja okrevanja po odtajanju in ocena fluorescence

Po kriokonzervaciji potrebujejo fluorescenčne celice posebna obdobja obnove, da ponovno pridobijo optimalno intenzivnost fluorescence. Naše študije s celicami HEK293, ki izražajo fluorescenčne beljakovine, so pokazale, da je ključnega pomena 24-48-urno obdobje okrevanja. V tem času je treba celice vzdrževati v popolnem rastnem gojišču, dopolnjenem s standardnimi antibiotiki. Opazili smo, da intenzivnost fluorescence običajno doseže vrh okoli 72 ur po odmrznitvi, zlasti pri celičnih linijah, kot so celice HEK293T, ki izražajo različice GFP.

Optimizacija strategije za ohranjanje fluorescenčnih celic

Uspeh pri ohranjanju fluorescenčnih celic je odvisen od celovitega pristopa h kriokonzervaciji. V podjetju Cytion priporočamo uporabo našega zamrzovalnega medija CM-1 v kombinaciji s protokoli za zamrzovanje z nadzorovano hitrostjo. Redno preverjanje ohranjanja fluorescence s pretočno citometrijo ali fluorescenčno mikroskopijo zagotavlja dosledne rezultate. Za specializirane aplikacije lahko naša ekipa za tehnično podporo zagotovi prilagojene protokole, prilagojene vašim specifičnim fluorescenčnim celičnim linijam. Ne pozabite, da je pravilno ravnanje med celotnim postopkom - od priprave pred zamrzovanjem do obnovitve po odmrzovanju - bistveno za ohranjanje vitalnosti celic in intenzivnosti fluorescence. Zaupajte Cytionovemu strokovnemu znanju in izdelkom, da vam pomagajo doseči optimalne rezultate pri ohranjanju fluorescenčnih celic.